專利名稱：合成丙烯酰胺衍生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及合成丙烯酰胺衍生物，特別是丙烯酰胺基固定劑(immobilines)的方法，所述方法特別適合用于合成丙烯酰胺基固定劑丙烯酰胺基胍基丁胺，但是也用于合成任何丙烯酰胺衍生物，通過該方法合成的化合物能夠用于生產(chǎn)分離材料，其優(yōu)選的實(shí)例是用于基于等電點(diǎn)(pI)不同而分離，特別是通過電泳方法(等電聚焦，IEF)而分離兩性化合物的分離材料，另一優(yōu)選的實(shí)例是用于2D電泳的分離材料。
背景技術(shù)：
在二維電泳(2D)中，電泳物質(zhì)可以在兩個方向被分離，在第一維中，通過等電聚焦分離物質(zhì)，等電聚焦經(jīng)常伴隨著第二維凝膠電泳，其中每個被分離的物質(zhì)進(jìn)一步按照分子量和/或分子大小被分離。等電聚焦和凝膠電泳一般在互相垂直的二維方向上進(jìn)行。能夠以分析和制備數(shù)量的被分離的物質(zhì)進(jìn)行2D電泳。
被分離的物質(zhì)一般是生物-有機(jī)物，并且主要包括具有多肽結(jié)構(gòu)和/或碳水化合物結(jié)構(gòu)的化合物，其中蛋白質(zhì)是特別重要的。
在某些類型的電泳中，使用提供有利于所需分離條件的基團(tuán)將載體材料官能化，一種重要類型的基團(tuán)是pH-緩沖基團(tuán)，通過在電泳凝膠的陽極端和陰極端之間固定不同pKa的pH-緩沖基團(tuán)，使二十世紀(jì)七十年代后期能夠建立固定化的用于等電聚焦pH-梯度(Aminkemi，US4,130,470)。為了有好的pH-梯度，重要的是有不同的pH-緩沖基團(tuán)范圍，所述基團(tuán)是有處在所需的pH-間隔內(nèi)的增加/降低的pKa值，兩個鄰近的緩沖基團(tuán)的pKa之間的差值一般是1-2個pH單位，對于擴(kuò)展到pH10以上的間隔，在WO 02/25264(Amersham Biosciences)中描述了帶電的載體材料，它們在用于制備分離材料的pH＞10條件下對于水解有改進(jìn)的穩(wěn)定性。所述文獻(xiàn)記載了(1)在以下范圍內(nèi)適當(dāng)?shù)剡x擇固定化的pH-緩沖基團(tuán)(a)在連接sp2-雜化的碳原子的氮原子上的pH-依賴性電荷，和
(b)pKa≥9.5，例如≥10.0或≥10.5或≥11.0，和/或(2)使用基于某些丙烯?；鶈误w的載體材料。
丙烯酰胺基固定劑是帶有緩沖基團(tuán)的丙烯酰胺衍生物，丙烯酰胺基固定劑是由pK值確定的弱的酸或堿，丙烯酰胺基固定劑的優(yōu)選用途是用于2D電泳，一個最有興趣的丙烯酰胺基固定劑是丙烯酰胺基胍基丁胺，丙烯酰胺基胍基丁胺的合成記載于WO O2/25264中，包括讓胍基丁胺硫酸鹽和氫氧化鋇在水中反應(yīng)，然后過濾除去形成的硫酸鋇沉淀，通過冷凍干燥水相而得到脫鹽的胍基丁胺。為了除去大部分硫酸鋇，至少要重復(fù)沉淀一次，下一步是將脫鹽的胍基丁胺重新溶解在有機(jī)溶劑中，并且加入丙烯酰氯和堿。反應(yīng)是耗時的，并且經(jīng)常產(chǎn)率和純度很低，另外處理反應(yīng)混合物經(jīng)常面臨除去堿和過量的未反應(yīng)的丙烯酰氯的困難(在反應(yīng)過程中經(jīng)常水解為丙烯酸)。
丙烯酰胺基胍基丁胺的理論pKa值是13.52，并且適用于在pH間隔超過10的情況下制備用于分離的分離材料。
發(fā)明的簡要說明本發(fā)明涉及合成任何丙烯酰胺衍生物，特別是丙烯酰胺基固定劑的簡單方法，所述方法避免了上述缺點(diǎn)。
另外本發(fā)明涉及生產(chǎn)新的丙烯酰胺衍生物(丙烯酰胺基固定劑)的方法，所述方法彌補(bǔ)了在先公知的丙烯酰胺基固定劑家族的空白。
采用本發(fā)明方法生產(chǎn)的優(yōu)選丙烯酰胺基固定劑是丙烯酰胺基胍基丁胺，但是本發(fā)明的方法適合于任何丙烯酰胺衍生物，特別是生產(chǎn)具有高pKa，例如pKa＞10的親水性丙烯酰胺基固定劑。
丙烯酰胺基固定劑優(yōu)選用于含有固定化的pH梯度的等電聚焦分離材料，該分離材料包括本發(fā)明方法生產(chǎn)的延伸到用于規(guī)定該梯度的至少一部分pH間隔的丙烯酰胺基固定劑。優(yōu)選地，該梯度/間隔延伸到pH＞10，包括具有pKa≥9.5，例如≥10.0或≥10.5或≥11.0的丙烯酰胺基固定劑。優(yōu)選的電泳分離方法是2D電泳。
本發(fā)明提供合成任何丙烯酰胺衍生物的一般方法，即從在水中溶解親核性胺的鹽形成水溶液開始，并且用堿將所述的溶液脫鹽，包括以下步驟a)將溶解的活化的丙烯酸衍生物加入到所述溶液中；
b)酸化水相；和c)萃取所述的水相。
優(yōu)選的丙烯酰胺衍生物是丙烯酰胺基固定劑，優(yōu)選的丙烯酰胺基固定劑是丙烯酰胺基胍基丁胺。
為了生產(chǎn)丙烯酰胺基胍基丁胺，優(yōu)選從胍基丁胺鹽開始，優(yōu)選從胍基丁胺硫酸鹽開始。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟c)的萃取使用有機(jī)溶劑，優(yōu)選使用甲基異丁基酮(MIBK)進(jìn)行。
丙烯酸衍生物是活化的丙烯酸衍生物，選自丙烯酰氯、丙烯酸N-羥基琥珀酰亞胺酯、丙烯酸五氟苯基酯、丙烯酸五氯苯基酯、丙烯酸4-硝基苯基酯等。
按照本發(fā)明，胍基丁胺硫酸鹽或親核性胺的任何其它鹽的脫鹽使用有機(jī)堿，優(yōu)選三乙基胺(TEA)和二異丙基乙基胺(DIPEA)，或者任何無機(jī)堿，優(yōu)選氫氧化鈉(NaOH)和碳酸鉀(K2CO3)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法還包括固定pH到約7。
在另一實(shí)施方案中，所述方法包括在步驟b)以前，i)堿化水溶液到pH超過有機(jī)堿的pKa，和ii)使用有機(jī)溶劑萃取水相以除去有機(jī)堿。
按照本發(fā)明優(yōu)選的方法，將胍基丁胺硫酸鹽是溶解，使用K2CO3脫鹽，并且該方法包括以下步驟a)加入丙烯酰氯；b)酸化到pH1-4，優(yōu)選pH2.3；c)過濾；d)使用MIBK萃??；e)將pH調(diào)節(jié)到pH7。
發(fā)明的詳細(xì)說明按照本發(fā)明合成丙烯酰胺衍生物的新的方法解決了先有技術(shù)中的所有問題，例如重現(xiàn)性問題和涉及健康的問題。按照本發(fā)明，NaOH、TEA、DIPEA或K2CO3作為堿用于原料的脫鹽以及捕獲在丙烯酰氯和脫鹽的原料之間的反應(yīng)期間游離出來的質(zhì)子，改進(jìn)了反應(yīng)過程從而得到了高純度、高產(chǎn)率和允許容易的放大。過量的丙烯酰氯(對于進(jìn)行反應(yīng)而得到優(yōu)異的產(chǎn)率和在反應(yīng)過程中水解得到丙烯酸是必需的)在酸化水相以后通過使用MIBK萃取而被除去，該合成方法能夠很容易地用于制備其它丙烯酰胺基固定劑的制備。對于制備丙烯酰胺基固定劑，當(dāng)使用所述物質(zhì)制備2D電泳凝膠時，污染的丙烯酸是重要的參數(shù)。
本發(fā)明的方法在選擇不同組分方面提供了很多變化，并且受偶合到丙烯酰氯或任何活化的丙烯酸衍生物(丙烯酸、N-羥基琥珀酰亞胺酯、丙烯酸五氟苯基酯、丙烯酸五氯苯基酯、丙烯酸4-硝基苯基酯等)上的游離胺類型的控制。
按照本發(fā)明方法為制備丙烯酰胺衍生物提供了新的機(jī)會，一個特別的應(yīng)用是制備2D電泳的丙烯酰胺基固定劑(在下述試驗(yàn)部分予以說明)，對高pKa值的丙烯酰胺基固定劑是特別有興趣的，但是本發(fā)明的方法不限于丙烯酰胺基固定劑的生產(chǎn)，而是能夠用于涉及丙烯酰胺衍生物制備的其它目的。丙烯酰胺的實(shí)例是未取代的和/或N-烷基取代的丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺。
以下使用某些非限制性公開的實(shí)施例說明本發(fā)明。本發(fā)明被更詳細(xì)地確定在隨后的權(quán)利要求書中。
實(shí)施例部分I.合成丙烯酰胺基胍基丁胺丙烯酰胺基胍基丁胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式1。
式1A.使用NaOH作為堿將胍基丁胺硫酸鹽(2.28g，10mmol)溶解在裝備了電磁攪拌器和pH計(jì)的三口圓底燒瓶(50ml)中的蒸餾水(20ml)中，將反應(yīng)混合物在冰浴中冷卻，為了脫鹽將氫氧化鈉(NaOH)(1M)加入到圓底燒瓶中直到pH＝12，將溶解在丙酮(5ml)中的丙烯酰氯(1.36g，1.22ml，15mmol)滴加到燒瓶中，使用NaOH(1M)在加入丙烯酰氯溶液期間使反應(yīng)混合物的pH保持在11.8，反應(yīng)在室溫下進(jìn)行2h，然后停止攪拌。通過加入濃硫酸將水相的pH固定在pH2.5，然后使用MIBK(甲基異丙基酮)(3次，80ml)萃取水相(約40ml)，除去反應(yīng)期間形成的過量的丙烯酸。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)殘留的MIBK，得到在水中的產(chǎn)品。產(chǎn)率至少是50％。
B.使用TEA作為堿將胍基丁胺硫酸鹽(2.28g，10mmol)溶解在裝備了電磁攪拌器的三口圓底燒瓶(50ml)中的蒸餾水(15ml)中，將三乙基胺(TEA)(3.52ml，25mmol)加入到圓底燒瓶中，將反應(yīng)混合物在冰浴中冷卻，于5℃攪拌混合物10分鐘，使用巴斯德移液管將溶解在丙酮(5ml)中的丙烯酰氯(1.36g，1.29ml，15mmol)滴加到燒瓶中，于5℃進(jìn)行反應(yīng)lh，停止攪拌。將K2CO3加入到圓底燒瓶中直到將pH固定到11，水相的體積是75ml，使用MIBK(2次，150ml)萃取水相以除去TEA，通過加入濃硫酸將水相的pH固定在pH2.3，然后用MIBK萃取(3次，150ml)水相以除去反應(yīng)期間形成的過量的丙烯酸。通過加入K2CO3將水相的pH固定在pH7，產(chǎn)率至少是95％。
任選地，可以通過冷凍干燥除去水，但是這將增加丙烯酰胺基胍基丁胺均聚反應(yīng)的危險，但是假如進(jìn)行該步驟，可以將最終的白色粉末能夠溶解在異丙醇中并且過濾而除去最終形成的聚合物，而鹽仍然存在于水相中。
C.使用DIPEA作為堿將胍基丁胺硫酸鹽(2.28g，10mmol)溶解在裝備了電磁攪拌器的圓底燒瓶(50ml)中的蒸餾水(10ml)中，將二異丙基乙二胺(DIPEA)(3.88g，5.23ml，20mmol)和丙酮(10ml)一起加入到圓底燒瓶中，在冰浴中冷卻反應(yīng)混合物，于5℃攪拌混合物10分鐘，使用巴斯德移液管將溶解在丙酮(5ml)中的丙烯酰氯(1.81g，1.625ml，20mmol)加入到燒瓶中，反應(yīng)于5℃進(jìn)行l(wèi)h，停止攪拌，將K2CO3加入到圓底燒瓶中直到將pH固定到12。水相體積是75ml，然后用MIBK(2次，150ml)萃取水相以除去DIPEA，通過加入濃硫酸將水相的pH固定到pH2.3，然后用MIBK(3次，150ml)萃取水相，除去反應(yīng)期間形成的過量丙烯酸。通過加入K2CO3將水相的pH固定在pH7，產(chǎn)率至少是95％。
任選地，可以通過冷凍干燥除去水，但是這將增加丙烯酰胺基胍基丁胺均聚反應(yīng)的危險，但是假如進(jìn)行該步驟，可以將最終的白色粉末溶解在異丙醇中并且過濾而除去最終形成的聚合物，而鹽仍然存在于水相中。
D.使用K2CO3作為堿使用K2CO3作為堿是進(jìn)行本發(fā)明的最佳模式，將胍基丁胺硫酸鹽(2.28g，10mmol)溶解在裝備了電磁攪拌器的圓底燒瓶(50ml)中的蒸餾水中(5ml)，將溶解在蒸餾水(5ml)中的K2CO3(4.14g，30mmol)加入到圓底燒瓶中，在冰浴中冷卻反應(yīng)混合物，于5℃攪拌反應(yīng)混合物10分鐘，使用巴斯德移液管將溶解在丙酮(5ml)中的丙烯酰氯(1.81g，1.625ml，20mmol)滴加到燒瓶中，反應(yīng)于5℃進(jìn)行l(wèi)h，停止攪拌，用濃硫酸將水相固定在pH2.3，用玻璃漏斗過濾，然后用MIBK(2times 100ml)萃取水相，除去反應(yīng)中形成的過量的丙烯酸。通過加入K2CO3將水相的pH固定到pH7，產(chǎn)率至少是95％。
任選地，可以通過冷凍干燥除去水，但是這將增加丙烯酰胺基胍基丁胺均聚反應(yīng)的危險，但是假如進(jìn)行該步驟，可以將最終的白色粉末能夠溶解在異丙醇中并且過濾而除去最終形成的聚合物，而鹽仍然存在于水相中。
II.根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的丙烯酰胺衍生物的用途優(yōu)選的用途是用于丙烯酰胺基固定劑，特別是丙烯酰胺基胍基丁胺(見上述)的生產(chǎn)。丙烯酰胺基固定劑例如用于生產(chǎn)2D凝膠。本發(fā)明還涉及丙烯酰胺衍生物在其它電泳應(yīng)用中作為載體的用途。另外丙烯酰胺衍生物能夠用于生產(chǎn)色譜珠和其它色譜擔(dān)體。
丙烯酰胺衍生物的其它用途是作為絮凝劑。
權(quán)利要求
1.合成丙烯酰胺衍生物的方法，從在水中溶解親核性的胺的鹽而形成水溶液開始，并且使用堿將所述水溶液脫鹽，包括以下步驟a)將溶解的活化的丙烯酸衍生物加入到所述溶液中；b)酸化水相；和c)萃取所述的水相。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的丙烯酰胺衍生物是丙烯酰胺基固定劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的丙烯酰胺衍生物是丙烯酰胺基胍基丁胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述的鹽是胍基丁胺鹽。
5.根據(jù)上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中萃取步驟c)使用有機(jī)溶劑進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中有機(jī)溶劑是MIBK(甲基異丁基酮)。
7.根據(jù)上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述的丙烯酸衍生物是活化的丙烯酸衍生物，選自丙烯酰氯、丙烯酸N-羥基琥珀酰亞胺酯、丙烯酸五氟苯基酯、丙烯酸五氯苯基酯、丙烯酸4-硝基苯基酯。
8.根據(jù)上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述的脫鹽使用NaOH、TEA(三乙基胺)、DIPEA(二異丙基乙基胺)或K2CO3。
9.根據(jù)上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，還包括固定pH到7。
10.根據(jù)上述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，包括在步驟b)以前，i)堿化水相到pH超過有機(jī)堿的pKa，和ii)使用有機(jī)溶劑萃取水相以除去有機(jī)堿。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)的方法，其中將胍基丁胺硫酸鹽溶解，使用K2CO3脫鹽并且包括以下步驟a)加入丙烯酰氯；b)酸化到pH1-4，優(yōu)選pH2.3；c)過濾；d)使用MIBK萃??；和e)將pH調(diào)節(jié)到pH7。
全文摘要
本發(fā)明涉及合成丙烯酰胺衍生物的方法，該方法從在水中溶解親核性的胺的鹽而形成水溶液開始，使用堿將所述水溶液脫鹽，包括以下步驟a)將溶解的活化的丙烯酸衍生物加入到所述溶液中；b)酸化水相；和c)萃取所述的水相。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，丙烯酰胺衍生物是丙烯酰胺基固定劑，優(yōu)選是丙烯酰胺基胍基丁胺，丙烯酰胺基固定劑的優(yōu)選用途是用于生產(chǎn)2D凝膠。
文檔編號C07C231/02GK1871205SQ200480031474
公開日2006年11月29日 申請日期2004年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月23日
發(fā)明者M·阿爾戈特松, P·布松, N·泰弗南 申請人:通用電氣健康護(hù)理生物科學(xué)股份公司