專利名稱：一段天花病毒基因組特異的核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及生物技術(shù)，特別涉及天花病毒的檢測和天花診斷技術(shù)。
背景技術(shù)：
天花是由屬于痘病毒科正痘病毒屬的天花病毒引起的烈性傳染病，可經(jīng)呼吸道和皮膚粘膜在各年齡人群中傳播。歷史上曾經(jīng)大規(guī)模流行，病死率高達(dá)20％-30％。由于痘苗(天花疫苗)的廣泛接種，有效預(yù)防了天花的流行，并最終于20世紀(jì)70年代在全世界范圍消滅了天花。從1980年起，全世界停止了痘苗接種，目前人群中存在大量對天花病毒沒有免疫力或免疫力低下的群體，我國22歲以下對天花無免疫力的人群至少有4億人，而在全世界共有20多億人。這樣，一旦由于生物恐怖、實驗室泄漏、考古發(fā)掘等因素造成天花病毒重新出現(xiàn)，疾病的擴散將非常迅速。為了應(yīng)對這樣的局面，必須在天花病毒重新出現(xiàn)時迅速發(fā)現(xiàn)并盡快采取應(yīng)急措施，才能最大程度減小損失。在這樣的形勢下，國內(nèi)外都很重視天花病毒檢測和天花病診斷技術(shù)的研究。
目前天花病毒檢測主要使用病原電鏡負(fù)染、病原雞胚尿囊絨毛膜培養(yǎng)、病毒抗原和抗體檢測等技術(shù)。世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦使用的主要是病原電鏡負(fù)染和病原雞胚尿囊絨毛膜接種技術(shù)。病原電鏡負(fù)染技術(shù)能從形態(tài)學(xué)上準(zhǔn)確確定被檢樣品是否為痘病毒，但不能區(qū)別天花病毒與其它痘病毒，如猴痘、牛痘病毒等；病原雞胚尿囊絨毛膜接種法雖然從痘皰形態(tài)的差別可以在一定程度上區(qū)別天花病毒和其它痘病毒，但耗時長(2-4天)、操作復(fù)雜，結(jié)果可靠性有限；病毒抗原和抗體檢測技術(shù)均不能明確區(qū)分天花病毒和其它痘病毒。也就是說，上述常用技術(shù)均不能對天花病毒進(jìn)行特異性檢測。目前上述技術(shù)僅用于天花病毒和天花病的輔助檢測與診斷。
最近幾年，國外有人試圖利用光循環(huán)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Light Cycler PCR)和寡聚核苷酸芯片(Oligonucleotide microchip)的技術(shù)來檢測天花病毒。但前者仍無法區(qū)分天花病毒和其它痘病毒，后者目前還沒有實質(zhì)進(jìn)展。以上兩種方法目前還都處于實驗室研究階段。

發(fā)明內(nèi)容
綜上所述，目前還沒有一種快速準(zhǔn)確的天花病毒特異檢測方法。這很大程度因為痘病毒(包括天花病毒)是目前最大和最復(fù)雜的一類病毒，其蛋白抗原同源性很高，病毒形態(tài)又極為相似，因此很難使用常規(guī)技術(shù)建立能與其它痘病毒相區(qū)別的天花病毒特異檢測方法。一切生物的性狀都由其基因組決定，病毒也不例外。因此，本發(fā)明的目的是從病毒基因組的差異性出發(fā)，尋找能區(qū)別于其它病毒的天花病毒特異基因組序列，即這種序列應(yīng)在所有天花病毒中都存在，而在其它已知病毒，特別是與天花病毒親緣關(guān)系很近的其它痘病毒，如猴痘、牛痘、痘苗等病毒中都不存在，為天花病毒特異檢測提供標(biāo)識基因。
本發(fā)明可以通過以下方法和原則實現(xiàn)①以目前已經(jīng)公開發(fā)表的天花病毒基因組序列為基礎(chǔ)；②以痘苗、猴痘病毒等與天花病毒具有相近親緣關(guān)系的病毒和水痘、麻疹病毒等出疹性病毒基因組序列為比對對象；③應(yīng)用生物信息學(xué)手段比對處理序列數(shù)據(jù)，尋找天花病毒基因組與上述病毒基因組的差別，初步確定天花病毒特異序列；④再將得到的特異序列與歐洲分子生物學(xué)實驗室(EMBL)數(shù)據(jù)庫記錄的所有病毒核苷酸序列進(jìn)行比對驗證，基本確定天花病毒基因組特異序列；⑤人工合成天花病毒這種特異序列，以此序列為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的模板，與其它病毒基因組核酸模板比較，通過實驗驗證，最終確定這種特異序列為天花病毒的標(biāo)識基因。
本發(fā)明的主要內(nèi)容本發(fā)明以目前公開發(fā)表的天花病毒基因組序列(共有三條包括兩株普通型天花病毒，印度株India-1967和孟加拉株bangladesh-1975，其Genbank數(shù)據(jù)庫索取號分別為X69198和L22579；一株輕型天花病毒，加西亞株Garcia-1966，索取號為Y16780)為基礎(chǔ)，以痘苗、猴痘病毒等與天花病毒具有相近親緣關(guān)系的病毒和水痘、麻疹等出疹性病毒基因組序列為比對對象，使用美國國家信息中心(NCBI)的網(wǎng)絡(luò)版共享軟件，進(jìn)行天花病毒特異標(biāo)識基因的篩選。首先選擇印度株天花病毒的基因組序列作為工作序列，使用美國國家生物信息中心的網(wǎng)絡(luò)版共享軟件“成對基本局域聯(lián)配查找工具”(Pairwise BLAST)逐個比較該序列與上述比對對象病毒的基因組序列的同源性。比對后返回參加比對的兩種病毒基因組序列的同源區(qū)域，剩下非同源區(qū)域。將上述比對對象病毒一一比對完畢后，再將每次比對得到的非同源區(qū)域取交集，得到天花病毒基因組上與所有比對對象病毒都不同源的區(qū)域，即天花病毒基因組特異序列，該序列長920個核苷酸，命名為U160K。然后，將此序列再經(jīng)歐洲分子生物學(xué)實驗室(EMBL)的網(wǎng)絡(luò)版共享軟件FASTA對EMBL數(shù)據(jù)庫記錄的所有病毒核苷酸序列(154,696條)進(jìn)行比對。結(jié)果表明，該序列與數(shù)據(jù)庫中天花病毒以外的所有其它病毒核苷酸序列都沒有顯著的同源性，即進(jìn)一步確認(rèn)了序列U160K的特異性。最后，再比對序列U160K和另兩株已發(fā)表的天花病毒基因組序列，證明它在天花病毒基因組中普遍存在并且保守(序列同源性大于90％)，同時證明U160K在普通型天花病毒中為連續(xù)分布，而在弱天花病毒中為間斷分布。本發(fā)明依據(jù)U160K序列，人工合成其同源序列作為模板，以相關(guān)病毒為對照，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實驗，證明該特異序列可作為天花病毒的標(biāo)識基因，用于天花病毒特異性檢測。
本發(fā)明的優(yōu)點在于提供的天花病毒基因組標(biāo)識基因U160K具有很高的特異性。它在已發(fā)表的三株天花病毒序列中都存在，而在與其親緣性較高的猴痘、牛痘、駝痘、痘苗等病毒，以及歐洲分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫中天花病毒以外的所有其它病毒基因序列中都不存在。以人工合成的這段序列為模板，與其它痘病毒做聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)比較證明，該序列可以作為天花病毒的標(biāo)識基因，用于天花病毒特異的基因檢測。由于該序列在普通型天花病毒和輕型天花病毒基因組序列中排列方式不同，該標(biāo)識基因還可用于普通型天花病毒和輕型天花病毒的區(qū)別檢測。


圖1.使用Pairwise BLAST軟件逐個比對天花病毒基因組序列和其他病毒基因組序列的結(jié)果?！?”同源區(qū)，“*”非同源區(qū)(特異區(qū))，陰影部分為天花病毒基因組上唯一一個與所有參加比對的其它病毒基因組都特異的序列U160K。1.天花病毒基因組上與痘苗病毒哥本哈根株基因組同源和非同源的區(qū)域，2.天花病毒基因組上與痘苗病毒天壇株基因組同源和非同源的區(qū)域，3.天花病毒基因組上與猴痘病毒基因組同源和非同源的區(qū)域，4.天花病毒基因組上與牛痘病毒基因組同源和非同源的區(qū)域，5.天花病毒基因組上與駝痘病毒基因組同源和非同源的區(qū)域，6.天花病毒基因組上與鼠痘病毒基因組同源和非同源的區(qū)域，7.天花病毒基因組上與禽痘病毒基因組同源和非同源的區(qū)域，8.天花病毒基因組上與羊松皮病病毒基因組同源和非同源的區(qū)域，9.天花病毒基因組上與兔纖維瘤病毒基因組同源和非同源的區(qū)域，10.天花病毒基因組上與豬痘病毒基因組同源和非同源的區(qū)域，11.天花病毒基因組上與亞巴猴樣病病毒基因組同源和非同源的區(qū)域，12.天花病毒基因組上與人傳染性軟疣病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、水痘-帶狀皰疹病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒基因組同源和非同源的區(qū)域。天花病毒與這幾個病毒基因組同源的區(qū)域很少很短，圖上未顯示相應(yīng)同源符號。
圖2.天花病毒基因組特異序列U160K。共920個核苷酸，陰影部分為U160K序列內(nèi)兩個蛋白編碼框。
圖3.應(yīng)用FASTA軟件確認(rèn)序列U160K的特異性。使用FASTA軟件比對病毒序列同源性的E值變化曲線時，E值越小，同源度越高。圖中前7個點代表7個顯著同源序列的病毒的E值，E值均少于0.01，此后的點代表EMBL數(shù)據(jù)庫記錄的其它病毒序列比較的E值，E值較高，均無顯著同源性。圖中前7個點對應(yīng)的是FASTA軟件在EMBL數(shù)據(jù)庫記錄的所有病毒核苷酸序列(共計154,696條)中找到的與U160K顯著同源的序列，共7個，均為天花病毒序列，編號及名稱為1.EM_VIVVCGAA X69198.1 Variola virus DNA comple(185578)[f]，2.EM_VIVVXHOIFOH X67117.1 Variola virus(XhoI-F 25344)[f]，3.EM_VIVV18341U18341.1 Variola virus Somalia-1(30869)[f]，4.EM_VIPXVARCG L22579.1 Variola majorvirus(st 186103)[f]，5.EM_VIVV18339 U18339.1 Variola virus Garcia-19(31562)[f]，6.EM_VIVMVY16780 Y16780.1 variola minor virus c(186986)[f]，7.EM_VIVMVGENX72086.1 Variola minor virus comp(20259)[f]。
圖4.天花病毒特異序列U160K在三株天花病毒基因組上的排列分布。 為U160K片段，該片段位于印度株第160681至161600核苷酸處，位于孟加拉株第160713至161680核苷酸處，位于加西亞株161745至162261和162889至163261核苷酸處。
圖5a.克隆人工合成U160K同源序列的質(zhì)粒圖。使用pMD18T商品質(zhì)粒為載體，將U160K同源序列插至SalI和XbaI酶切點之間。
圖5b.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢驗U160K序列特異性的瓊脂糖電泳結(jié)果。1.DL2000DNA分子量標(biāo)記，單位為堿基對(bp)，2.痘苗天壇株特異引物在痘苗天壇株基因組DNA模板上PCR，做為陽性技術(shù)對照(→)，3.天花病毒特異引物在合成天花病毒特異序列U160K模板上PCR，做為天花病毒陽性指示(→)，4.天花特異引物在空白模板(純水)上PCR，做為陰性技術(shù)對照，5.和6.都是天花特異引物在痘苗天壇株基因組DNA模板上PCR，做為天花病毒陰性對照。
表1.使用Pairwise BLAST軟件與天花病毒基因組比對的其它病毒名稱與基因組序列來源。選擇三類病毒，①所有感染人的痘病毒包括痘苗病毒(天壇株和哥本哈根株)、牛痘病毒、猴痘病毒、人傳染性軟疣病毒；②其它重要的痘病毒(脊椎動物痘病毒，每個屬取一到二種為代表)包括駝痘病毒、鼠痘病毒、禽痘病毒、羊松皮病病毒、兔纖維瘤病毒、豬痘病毒、亞巴猴樣病病毒；③感染人并引起出疹性疾病的病毒單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、水痘-帶狀皰疹病毒(即人皰疹病毒3型)、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒。共選16種病毒，其中除痘苗病毒選兩株外，其余每種病毒選一株，共計17株病毒。各病毒基因組序列來源與編號詳見上表。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明例1.比對天花病毒基因組和其它病毒基因組尋找天花病毒基因組特異序列使用Pairwise BLAST軟件逐個比對天花病毒基因組序列和其它病毒(詳見附表1)基因組序列的同源性。結(jié)果表明天花病毒基因組上只有一個區(qū)域與所有參加比對的其它病毒基因組都特異，命名為天花病毒特異序列U160K(結(jié)果見附圖1)。該序列長920個核苷酸，含有兩個蛋白編碼框，分別位于序列的5’-末端起第207位核苷酸到第500位核苷酸和第516位核苷酸到第713位核苷酸(見附圖2)。例2.使用FASTA軟件進(jìn)一步確認(rèn)天花病毒基因組特異序列U160K的特異性應(yīng)用FASTA軟件將天花病毒特異序列U160K和EMBL數(shù)據(jù)庫中記錄的(至2002年10月止)所有發(fā)表的病毒核苷酸序列(共計154,696條)進(jìn)行比對。結(jié)果表明，除天花病毒的核苷酸序列外，沒有任何病毒與U160K序列顯著同源(結(jié)果見附圖3)，從而確認(rèn)了該序列的特異性。例3.序列U160K在天花病毒中都存在并且保守將序列U160K與普通型天花病毒印度株和孟加拉株，以及輕型天花病毒加西亞株這三株天花病毒基因組進(jìn)行比對。結(jié)果表明(詳見圖4)該序列與印度株基因組記錄鏈5’-末端第160681位核苷酸到第161600位核苷酸區(qū)域同源且連續(xù)排列，同源比為100％；與孟加拉株基因組記錄鏈5’-末端第160713位核苷酸到第161680位核苷酸區(qū)域同源且連續(xù)排列，同源比為94.0％；與加西亞株基因組記錄鏈5’-末端第161745位核苷酸到第163261位核苷酸區(qū)域同源但呈間斷排列，同源比為94.7％。例4.序列U160K特異性的實驗證據(jù)人工合成U160K同源序列，插入商品載體質(zhì)粒pMD18-T中，獲得的帶有U160K同源序列的質(zhì)粒命名為pMD18TSU160K(見附圖5a)。以此質(zhì)粒為天花病毒陽性模板，以痘苗病毒天壇株基因組脫氧核糖核酸(DNA)為陰性對照，依據(jù)U160K序列合成天花病毒特異引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。結(jié)果使用天花病毒特異引物在U160K序列模板上有陽性條帶，而在陰性對照上沒有(見附圖5b)。本實驗證明，U160K序列可以做為標(biāo)識基因進(jìn)行天花病毒特異性檢測。
本發(fā)明提供一段天花病毒基因組特異的核苷酸序列U160K，該序列長920個堿基，廣泛存在于天花病毒基因組中，在普通型和輕型天花病毒中其分布方式不同，但核苷酸同源性大于90％，與天花病毒以外的病毒無明顯同源性，是天花病毒特有的遺傳物質(zhì)標(biāo)志，可用于天花病毒特異的檢測技術(shù)研究與開發(fā)。
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權(quán)利要求
1.一段天花病毒基因組特異的核苷酸序列U160K。其特征是U160K來源于普通型天花病毒印度株(India-1967)，位于該毒株基因組5’-末端起第160681位核苷酸到第161600位核苷酸，共920個核苷酸；U160K含有兩個蛋白編碼框，分別位于U160K的5’-末端起第207位核苷酸到第500位核苷酸和第516位核苷酸到第713位核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天花病毒基因組特異的核苷酸序列U160K，其特征是U160K以一段連續(xù)分布的序列存在于普通型天花病毒孟加拉株(bangladesh-1975)的基因組中，同源性大于90％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天花病毒基因組特異的核酸序列U160K，其特征是U160K以非連續(xù)的間斷分布方式存在于輕型天花病毒加西亞株(Garcia-1966)的基因組中，同源性大于90％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天花病毒基因組特異的核苷酸序列U160K，其特征是U160K與天花病毒以外的其它病毒基因組沒有顯著的同源性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天花病毒基因組特異的核苷酸序列U160K和權(quán)利要求2、3、4描述的U160K特征產(chǎn)生的天花病毒特異檢測、治療和預(yù)防技術(shù)。
全文摘要
本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域1.生物技術(shù)。2.病毒檢測技術(shù)。本發(fā)明提供一段天花病毒基因組特異的核苷酸序列U160K，該序列長920個堿基，廣泛存在于天花病毒基因組中，在普通型和輕型天花病毒中其分布方式不同，但核苷酸同源性大于90％，與天花病毒以外的病毒無明顯同源性，是天花病毒特有的遺傳物質(zhì)標(biāo)志，可用于天花病毒特異的檢測技術(shù)研究與開發(fā)。
文檔編號C07H21/00GK1482131SQ03121260
公開日2004年3月17日 申請日期2003年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月31日
發(fā)明者阮力, 王世峰, 鄭楠, 陸柔劍, 阮 力 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所, 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制