專利名稱：角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新鑒別的多核苷酸、由這種多核苷酸編碼的多肽、這種多核苷酸和多肽的用途以及產(chǎn)生這種多核苷酸和多肽的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明的多肽是一種角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子，在下文有時(shí)作為“KGF-2”。本發(fā)明也涉及抑制這種多肽的作用。
成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族是參與軟組織生長(zhǎng)和新生的生長(zhǎng)因子的一個(gè)大家族。它目前包括幾個(gè)成員，它們?cè)诘鞍踪|(zhì)水平上有不同程度的同源性，一個(gè)例外的情況是看來(lái)似乎有類似的廣闊的促有絲分裂譜，即它們促進(jìn)中胚層和神經(jīng)外胚層起源的各種細(xì)胞的增殖和/或促進(jìn)血管形成。
該家族的不同成員的表達(dá)方式十分不同，從發(fā)育的某些階段的極其有限的表達(dá)至不同組織和器官中的相當(dāng)普遍存在的表達(dá)。所有成員在胞外基質(zhì)中看來(lái)似乎結(jié)合肝磷脂和肝素硫酸鹽蛋白多糖和糖胺聚糖并強(qiáng)烈濃縮。KGF最初通過(guò)序列同源性或因子純化和克隆鑒別為PGP家族的成員。
角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)作為培養(yǎng)的鼠角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞系的促細(xì)胞分裂劑分離(Rubin，J.S.等，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)，86802-806(1989))。不同于FGF家族的其它成員，它對(duì)間質(zhì)衍生的細(xì)胞活性很小，但刺激上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因編碼194個(gè)氨基酸的多肽(Finch，P.W.等，科學(xué)，245，752-755(1989))。N-末端的64個(gè)氨基酸是獨(dú)特的，但是蛋白質(zhì)的其余部分和bFGF有大約30％的同源性。KGF是FGF家族的最不同的成員。該分子有疏水信號(hào)序列并且高效分泌。翻譯后的修飾包括信號(hào)序列的裂解和在一個(gè)位點(diǎn)上N-連接的葡基化，產(chǎn)生28kDa的蛋白質(zhì)。角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子通過(guò)衍生自皮膚和胎兒肺臟的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生(Rubin等，(1989))。發(fā)現(xiàn)角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子mRNA在成人腎、結(jié)腸和髂骨中但不在腦或肺臟中表達(dá)(Finch，P.W.，等，科學(xué)，245752-755(1989))。KGF顯示在FGP蛋白質(zhì)家族之內(nèi)的保守區(qū)。KGF和FGP-2受體高親和性結(jié)合。
本發(fā)明的多肽被推定鑒別為FGF家族的成員，更具體地說(shuō)，由于和FGP家族的其它成員的氨基酸序列同源，多肽被推定鑒別為KGF-2。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面提供了新的成熟多肽，這種多肽是KGF-2及其生物學(xué)活性的和診斷或治療有用的片段、類似物和衍生物。本發(fā)明多肽是人體起源的。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面提供了分離的編碼人KGF-2的分離的核苷酸分子，包括mRNA、DNAs、染色體DNA以及其反義類似物和其有生物學(xué)活性的和診斷或治療有用的片段的。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了通過(guò)使用重組載體(如在KGF-2蛋白質(zhì)、重組原核生物和/或包含人KGF-2核酸序列的真核宿主細(xì)胞的重組產(chǎn)生中作為試劑有用的克隆和表達(dá)載體)用重組技術(shù)產(chǎn)生這類多肽的方法。
按照本發(fā)明的另一方面提供了使用這類多肽或編碼這類多肽的多核苷酸以用于治療目的方法，例如，為治療創(chuàng)傷刺激表皮細(xì)胞的增殖，刺激毛囊產(chǎn)生，并治愈皮膚的創(chuàng)傷。
按照本發(fā)明的另外的一個(gè)方面提供了抗這類多肽的抗體。
按照本發(fā)明的另一方面提供了包含和人KGF-2序列特異性雜交的足夠長(zhǎng)度的核酸分子的核酸探針。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了抗這類多肽的拮抗劑，此類拮抗劑可用于抑制這類多肽的作用，例如，在創(chuàng)傷治愈過(guò)程中減少結(jié)疤、預(yù)防和/或治療瘤增殖、糖尿病的視網(wǎng)膜病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和腫瘤生長(zhǎng)。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了檢測(cè)與KGF-2核酸序列突變或由這類序列編碼的多肽的過(guò)量表達(dá)有關(guān)的疾病或疾病易感性的診斷測(cè)定方法。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了為與科學(xué)研究有關(guān)的體外目的將這類多肽或編碼這類多肽的多核苷酸用于合成DNA或產(chǎn)生DNA載體的方法。
由本文教導(dǎo)，本發(fā)明的這些和其它方面對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該是明顯的。
下列附圖是本發(fā)明的具體實(shí)施方案的說(shuō)明，并不是限制權(quán)利要求所包括的本發(fā)明的范圍。


圖1說(shuō)明本發(fā)明的多肽的cDNA和相應(yīng)的推斷的氨基酸序列。初始的36個(gè)氨基酸殘基代表推定的前導(dǎo)序列(畫線部分)。使用了標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸單字母縮寫。試圖確定多核苷酸序列時(shí)，測(cè)序不精確性是常見的問(wèn)題。使用373自動(dòng)DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序(Applied Biosystem公司)。預(yù)測(cè)測(cè)序精確性大于97％精確度。
圖2是本發(fā)明的多肽和其它成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的氨基酸序列的比較的圖解。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面提供了這種分離的核酸(多核苷酸)，該核酸編碼具有圖1的推定的氨基酸序列(SEQ ID No.2)的成熟多肽或由1994年12月16日保藏的ATCC 75977的克隆的cDNA編碼的成熟多肽。
編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸可以從人前列腺和胎兒的肺臟中獲得。編碼多肽的cDNA片段首先從衍生自人正常前列腺的文庫(kù)中分離出來(lái)。隨后編碼全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的開放讀框從隨機(jī)致敏的(primed)人胎兒肺臟cDNA文庫(kù)分離到。它與FGF家族在結(jié)構(gòu)上相關(guān)。它包含編碼268個(gè)氨基酸殘基的的蛋白質(zhì)的開放讀框，在這些氨基酸殘基中，前36個(gè)氨基酸殘基是推定的前導(dǎo)序列以使成熟蛋白質(zhì)包含172個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)表現(xiàn)出和人角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子最高程度的同源性，在206個(gè)氨基酸的鏈上，45％相同，82％相似。同樣重要的是，發(fā)現(xiàn)FGF家族保守的序列在本發(fā)明的蛋白質(zhì)中是保守的。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式，其中的DNA包括cDNA、基因組DNA和合成的DNA。如果單鏈可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈，則DNA可以是雙鏈或單鏈。編碼成熟多肽的編碼序列可以和圖1中顯示的編碼序列(SEQ ID No.1)或保藏的克隆的編碼序列相同，或可以是編碼序列的不同的編碼序列，此編碼序列由于基因密碼的冗余和簡(jiǎn)并，編碼與圖1(SEQ IDNo.1)的DNA或保藏的cDNA相同的成熟多肽。
編碼圖1(SEQ ID No.2)的成熟多肽或編碼由保藏的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的序列；編碼成熟多肽的序列和附加的編碼序列(如前導(dǎo)或分泌序列或前蛋白質(zhì)序列)；成熟多肽的編碼序列(和選擇性的附加編碼序列)和非編碼序列(如成熟多肽的編碼序列的內(nèi)含子或非編碼序列的5′和/或3′)。
這樣，術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”包括僅包含編碼多肽的序列的多核苷酸以及包含附加的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及與本文以上所述的編碼具有圖1(SEQ ID No.2)推定的氨基酸序列的多肽或保藏的克隆的cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物的多核苷酸的變體。多核苷酸的變體可以是多核苷酸的天然產(chǎn)生的等位變體或多核苷酸的非天然產(chǎn)生的變體。
這樣，本發(fā)明包括編碼如圖1(SEQ ID No.2)中顯示的相同的成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的相同的成熟多肽的多核苷酸以及這類多核苷酸的變體，其變體編碼圖1(SEQ ID No.2)的多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物。這類核苷酸變體包括缺失變體、取代變體和添加或插入變體。
如上文所述，所述多核苷酸可以有如圖1(SEQ ID No.2)中顯示的編碼序列或保藏的克隆的編碼序列的天然產(chǎn)生的等位變體的編碼序列。如本領(lǐng)域所已知的，等位變體是可以具有一種或多種沒(méi)有實(shí)質(zhì)上改變編碼的多肽的功能的核苷酸的取代、缺失或添加的多核苷酸序列的一種替代形式。
本發(fā)明也包括多核苷酸，其中成熟多肽的編碼序列可與這種多核苷酸序列融合到相同的閱讀框架中，這種多核苷酸幫助多肽從宿主細(xì)胞中表達(dá)和分泌，例如，作為控制多肽從細(xì)胞中運(yùn)輸?shù)姆置谛蛄衅鹱饔玫那皩?dǎo)序列。具有前導(dǎo)序列的多肽是前蛋白質(zhì)并具有前導(dǎo)序列，該前導(dǎo)序列由宿主細(xì)胞裂解以形成成熟形式的多肽。多核苷酸也可以編碼成熟蛋白質(zhì)加其它的5氨基酸殘基的前蛋白。具有原序列的成熟蛋白質(zhì)是前蛋白(proprotein)，是蛋白質(zhì)的失活形式。一旦裂解了原序列，就產(chǎn)生活性的成熟蛋白質(zhì)。
這樣，例如，本發(fā)明的多核苷酸可以編碼成熟蛋白質(zhì)、或具有原序列的蛋白質(zhì)、或具有原序列(prosenquence)和前序列(presequence)(前導(dǎo)序列)的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多核苷酸可以具有符合讀框地融合進(jìn)使得可以純化本發(fā)明的多肽的標(biāo)記序列上的編碼序列。在細(xì)菌宿主的情況下，標(biāo)記序列可以通過(guò)pQB-9載體提供的六個(gè)組氨酸標(biāo)記(tag)以提供融合到標(biāo)記上的成熟多肽的純化，或，例如，當(dāng)使用哺乳動(dòng)物宿主(如COS-7細(xì)胞時(shí))，標(biāo)記序列可以是血細(xì)胞凝集素(HA)標(biāo)記。HA標(biāo)記對(duì)應(yīng)于衍生自流感血細(xì)胞凝集素蛋白質(zhì)的表位(Wilson，I.等，細(xì)胞，37767(1984))。
本發(fā)明還涉及和上述序列雜交的多肽(如果在兩種序列之間至少50％相同，優(yōu)選地70％相同)。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及在嚴(yán)格條件下和上述的多核苷酸雜交的多核苷酸。本文所用的術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”指雜交僅發(fā)生在序列之間至少95％相同，優(yōu)選地至少97％相同時(shí)。和上文優(yōu)選的實(shí)施方案中所述的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼和圖1的cDNA(SEQ ID No.1)或保藏的cDNA編碼的成熟多肽實(shí)質(zhì)上相同的生物功能或活性的多肽。
本文所指的保藏按照用于專利程序的國(guó)際承認(rèn)的布達(dá)佩斯條約的條款保藏。這些保藏僅為了方便本領(lǐng)域技術(shù)人員而提供，不是35 U.S.C§112所需的保藏。本文一并參考了包含在保藏材料中的多核苷酸序列以及由其編碼的多肽的氨基酸序列，如果和本文描述的任何序列發(fā)生沖突時(shí)是對(duì)照性的(controlling)。制造、使用或銷售所述保藏材料需要得到許可，這里沒(méi)有給予這種許可。
本發(fā)明還涉及具有圖1推定的氨基酸序列(SEQ ID No.2)的多肽，或具有由保藏的cDNA編碼的氨基酸序列的多肽及這種多肽的片段、類似物和衍生物。
當(dāng)指圖1的多肽(SEQ ID No.2)或由保藏的cDNA編碼的多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類似物”意思是保持和這種多肽保持本質(zhì)上相同的生物功能或活性的多肽。這樣，類似物包括可由原蛋白部分裂解活化以產(chǎn)生活性的成熟多肽的原蛋白。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽，優(yōu)選地是重組多肽。
圖1中的(SEQ ID No.2)或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)一種多肽，其中一種或多種氨基酸殘基由保守或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選地是保守的氨基酸殘基)取代，這種氨基酸殘基可以是或可以不是由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基，或(ii)一種多肽，其中一種或多種氨基酸殘基包括取代基，或(iii)一種多肽，其中成熟多肽與另一種化合物，如一種提高多肽半衰期的化合物(如聚乙二醇)融合，或(iv)一種多肽，其中另外的氨基酸融合到成熟多肽上，如前導(dǎo)或分泌序列或用于成熟多肽純化的序列或原蛋白序列。通過(guò)本文的教導(dǎo)，這種片段、衍生物和類似物是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選地是以分離形式提供，優(yōu)選地是純化至同質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“分離的”意思是從其原來(lái)的環(huán)境(例如，如果它是天然產(chǎn)生時(shí)的天然環(huán)境)分離到的材料。例如，在生活動(dòng)物中的天然產(chǎn)生的多核苷酸或多肽不是分離的，但是分離自自然系統(tǒng)的某些或所有共存材料的相同多核苷酸或多肽是分離的。這種多核苷酸可以是載體的一部分和/或這種多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，而且可以分離，其中這種載體或組合物不是其天然環(huán)境的一部分。
本發(fā)明也涉及包括本發(fā)明的多核苷酸的載體、用本發(fā)明的載體遺傳工程操作的宿主細(xì)胞以及通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。
宿主細(xì)胞是用本發(fā)明的載體經(jīng)遺傳工程(轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)操作的，所述載體如克隆載體或表達(dá)載體。例如，載體可以以質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等的形式。工程宿主細(xì)胞可以在修飾得適于活化啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增KGF-2基因的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件(如溫度、pH等)是以前用于選擇表達(dá)的宿主細(xì)胞的條件，是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知的。
本發(fā)明的多核苷酸通過(guò)重組技術(shù)可用于產(chǎn)生多肽。這樣，例如，多核苷酸可以包含在各種用于表達(dá)多肽的表達(dá)載體的任何一種中。這些載體包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列。例如，SV40的衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；得自質(zhì)粒和噬菌體DNA、病毒DNA結(jié)合物的載體，如牛痘、腺病毒、家禽痘病毒和假狂犬病病毒。然而，也可以使用任何其它載體(只要它在宿主中可復(fù)制并能生存)。
適當(dāng)?shù)腄NA序列可以通過(guò)各種方法插入到載體中。通常，DNA序列通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法插入到適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點(diǎn)。這種和其它方法被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍之內(nèi)。
把在表達(dá)載體中的DNA序列可操作地連接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列(啟動(dòng)子)上以指導(dǎo)mRNA的合成。這種啟動(dòng)子的代表性例子如下LTR或SV40啟動(dòng)子、大腸桿菌lac或trp、噬菌體λPL啟動(dòng)子以及其它已知在真核細(xì)胞和原核細(xì)胞或其病毒中控制基因表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體也可以包含用于翻譯起始和轉(zhuǎn)錄終止的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。載體也可以包含用于擴(kuò)增表達(dá)的適當(dāng)序列。
另外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一種或多種可選擇的標(biāo)記基因以提供用于轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞選擇的表型特征，如用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或如大腸桿菌中的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含如上所述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)?shù)膯?dòng)子或控制序列的載體可用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗饕允沟盟拗鞅磉_(dá)所說(shuō)的蛋白質(zhì)。
適當(dāng)?shù)乃拗饔写硇缘睦尤缦录?xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌屬、鼠傷寒沙門氏菌；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞如果蠅屬S2和夜蛾屬Sf9；動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物細(xì)胞等。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，適當(dāng)?shù)乃拗鬟x擇被認(rèn)為是在本領(lǐng)域的技術(shù)人員的知識(shí)范圍之內(nèi)。
更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明也包括含有一種或多種如上廣泛敘述的序列的重組構(gòu)建體。構(gòu)建體包含本發(fā)明的序列正或反方向插入的載體，如質(zhì)?；虿《据d體。在實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)選的方面中，構(gòu)建體還包括可操作地與序列連接的調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列包括，例如，啟動(dòng)子。許多適合的載體和啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并可購(gòu)買到。下列的載體以例證的方式提供細(xì)菌的pCP70、pQE60、PQB-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；真核細(xì)胞的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。但是，可以使用任何其它的質(zhì)粒或載體(只要它在宿主中可復(fù)制并能生存)。
使用CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或其它具有選擇性標(biāo)記的載體可從任何所需的基因選擇啟動(dòng)子區(qū)。兩個(gè)適當(dāng)?shù)妮d體是pKK232-8和pCM7。具體命名的細(xì)菌啟動(dòng)子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核細(xì)胞的啟動(dòng)子包括CMV極早期、HSV胸腺嘧啶核甙激酶、早期和晚期SV40、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs以及小鼠金屬硫蛋白-I。適當(dāng)?shù)妮d體與啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平之內(nèi)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含上述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)或低等真核細(xì)胞(如酵母細(xì)胞)，宿主細(xì)胞也可以是原核細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞)。把構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞可由磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAB-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔影響(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物學(xué)的基本方法(1986))。
在宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體可以按照常規(guī)方法使用以產(chǎn)生由重組序列編碼的基因產(chǎn)物。另外，本發(fā)明的多肽可以通過(guò)常規(guī)的肽合成儀合成產(chǎn)生。
成熟蛋白質(zhì)可于適當(dāng)?shù)膯?dòng)子的控制下在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其它細(xì)胞中表達(dá)。也可以使用無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)使用得自本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的RNA產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)。用于原核和真核宿主的適當(dāng)?shù)目寺『捅磉_(dá)載體由Sambrook等描述，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港，N.Y.，(1989)，本發(fā)明一并參考了其說(shuō)明書。
編碼本發(fā)明的多肽的DNA通過(guò)高等真核生物的轉(zhuǎn)錄可通過(guò)把增強(qiáng)子序列插入到載體中提高。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，通常為大約10至300bp，它作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄。例子包括在復(fù)制起點(diǎn)100至270bp的晚期側(cè)向的SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒的早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、在復(fù)制起點(diǎn)的晚期側(cè)向的多形瘤增強(qiáng)子以及和腺病毒增強(qiáng)子。
通常，重組體表達(dá)載體包括使得可以進(jìn)行宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的復(fù)制起點(diǎn)和可選擇性標(biāo)記(例如，大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因和S.cerevisiaeTRP1基因，以及衍生自高度表達(dá)的基因的啟動(dòng)子)以指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列的轉(zhuǎn)錄，這種啟動(dòng)子可以得自編碼在其它酶中的糖酵解酶(如3-磷酸甘油酸鹽激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶或熱擊蛋白)的操縱子。異源結(jié)構(gòu)序列和翻譯起始和終止序列(優(yōu)選的是能指導(dǎo)翻譯的蛋白質(zhì)分泌進(jìn)周質(zhì)空間和胞外培養(yǎng)基的前導(dǎo)序列)在適當(dāng)?shù)碾A段裝配。異源序列可有可無(wú)地編碼包括N-末端鑒別肽的融合蛋白質(zhì)，該鑒別肽傳遞所需的特征，如表達(dá)的重組產(chǎn)物的穩(wěn)定和簡(jiǎn)單純化。
通過(guò)把編碼所需的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)DNA序列和適合的翻譯起始和終止信號(hào)一道插入具有功能啟動(dòng)子的可操作的閱讀相(phase)中構(gòu)建用于細(xì)菌的有用的表達(dá)載體。載體包括一種或多種表型可選擇性標(biāo)記以及復(fù)制起點(diǎn)以確保載體的保持并(如果需要)提供在宿主內(nèi)的擴(kuò)增。雖然其它的原核宿主也可選擇，適當(dāng)?shù)脑怂拗靼ù竽c桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和假單孢菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌的不同物種。
作為代表性的而非限制性的例子，用于細(xì)菌的有用的表達(dá)載體可包含得自市售的質(zhì)粒的可選擇性標(biāo)記和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)，包括熟知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳元件。這種商業(yè)載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美國(guó))。這些pBR322“主鏈”部分和適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和要表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列結(jié)合。
在適合宿主菌株的轉(zhuǎn)化和宿主菌株生長(zhǎng)至適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度之后，選擇的啟動(dòng)子通過(guò)適當(dāng)?shù)姆绞秸T導(dǎo)(如溫度變換或化學(xué)誘導(dǎo))，然后再培養(yǎng)細(xì)胞另外一個(gè)時(shí)期。
細(xì)胞典型地通過(guò)離心收獲，通過(guò)物理或化學(xué)方式破壞，形成的粗提取物留待進(jìn)一步純化。
用于蛋白質(zhì)表達(dá)的微生物細(xì)胞可由任何常規(guī)技術(shù)破壞，包括冷凍-解凍循環(huán)、聲處理、機(jī)械破壞或使用細(xì)胞水解試劑，這種方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。
也可使用各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)以表達(dá)重組蛋白質(zhì)。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的例子包括猴腎成纖維細(xì)胞的COS-7細(xì)胞系(由Gluzman，細(xì)胞，23135(1981)描述)以及其它能表達(dá)相容的載體的細(xì)胞系，如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括復(fù)制起始位點(diǎn)、適合的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子以及必要的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、剪接供體和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列以及5側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。衍生自SV40剪接位點(diǎn)和聚腺苷酸化位點(diǎn)的DNA序列可用于提供所需的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。
可以通過(guò)以下方法從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化KGF-2多肽，這些方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽取、陰離子或陽(yáng)離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水相互作用色譜、親和色譜、羥基磷灰石色譜和外源凝集素色譜。如果需要，可以使用蛋白質(zhì)再折疊步驟完成成熟蛋白質(zhì)的構(gòu)型。最后，可以使用高效液相色譜(HPLC)為最后的純化步驟。
本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或化學(xué)合成過(guò)程的產(chǎn)物，或通過(guò)重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，培養(yǎng)的細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)產(chǎn)生。依賴于用于重組產(chǎn)生過(guò)程的宿主，本發(fā)明的多肽可以是葡基化或非葡基化的。本發(fā)明的多肽也可以包括一種初始的甲硫氨酸殘基。
可以使用本發(fā)明的多肽刺激新血管生長(zhǎng)或血管形成。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的多肽可以刺激角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。因此，可以使用本發(fā)明的多肽刺激創(chuàng)傷治愈并刺激與脫發(fā)預(yù)防有關(guān)的角質(zhì)形成細(xì)胞。
本發(fā)明的多肽也可通過(guò)表皮刺激細(xì)胞增殖治愈皮創(chuàng)傷。
本發(fā)明的多肽也可用于刺激細(xì)胞(例如，肌肉細(xì)胞和神經(jīng)組織、前列腺細(xì)胞和肺臟細(xì)胞)分化。
KGF-2的編碼氨基酸1至36的信號(hào)序列通?？赏ㄟ^(guò)雜交和/或計(jì)算搜索算法鑒別分泌的蛋白質(zhì)。
KGF-2的核苷酸序列可用于通過(guò)雜交分離5序列。然后，包含在其天然的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列的控制之下的KGF-2基因的質(zhì)?？捎糜谀康闹荚谘芯縆GF-2基因表達(dá)的內(nèi)源細(xì)胞和病毒的反式激活蛋白鑒別的體外試驗(yàn)。
KGF-2蛋白質(zhì)在設(shè)計(jì)用于KGF-2受體鑒別的肽模擬的實(shí)驗(yàn)中可用作陽(yáng)性對(duì)照。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了使用這種多肽或編碼這種多肽的多核苷酸用于與科學(xué)研究、DNA合成、DNA載體的制造有關(guān)的體外目的的方法以及用于提供人體疾病治療的診斷和治療目的的方法。
全長(zhǎng)KGF-2基因的片段可用作cDNA文庫(kù)的雜交探針以分離全長(zhǎng)KGF-2基因并分離和這些基因具有高度的序列相似性或類似的生物活性的其它基因。這種類型的探針通常具有至少20個(gè)堿基。雖然探針也可以具有很多堿基，然而，優(yōu)選地探針具有至少30個(gè)堿基，并且一般不超過(guò)50個(gè)堿基。探針也可用于鑒別對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄的cDNA克隆或基因組克隆或包含含有調(diào)節(jié)和啟動(dòng)子區(qū)、外顯子和內(nèi)含子的完全的KGF-2基因克隆。篩選的例子包括通過(guò)使用已知的DNA序列合成寡核苷酸探針?lè)蛛xKGF-2基因的編碼區(qū)。具有和本發(fā)明的基因的序列互補(bǔ)的序列的標(biāo)記的寡核苷酸可用于篩選人cDNA、基因組DNA或mRNA的文庫(kù)以確定探針和文庫(kù)的哪些成員雜交。
本發(fā)明提供了用于KGF-2多肽受體鑒別的方法。編碼受體的基因可通過(guò)許多本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法鑒別，例如，配位體panning和PACS分類整理(Coligan等，免疫學(xué)當(dāng)前方案，1(2)，第5章，(1991))。優(yōu)選地，使用其中多聚腺苷化的RNA從對(duì)多肽有作用的細(xì)胞中制備的表達(dá)克隆，從這種RNA產(chǎn)生的cDNA文庫(kù)劃分成庫(kù)并用于轉(zhuǎn)染對(duì)多肽有作用的COS細(xì)胞或其它細(xì)胞。在載玻片上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞接觸標(biāo)記的多肽。多肽可通過(guò)各種手段標(biāo)記，包括位點(diǎn)特異性蛋白質(zhì)激酶識(shí)別位點(diǎn)的碘化或包含。在固定和培養(yǎng)之后，載玻片進(jìn)行放射自顯影分析。鑒別陽(yáng)性庫(kù)，制備子庫(kù)并使用反復(fù)的子庫(kù)和再篩選過(guò)程再轉(zhuǎn)染，最終產(chǎn)生編碼推定受體的單一克隆。
作為用于受體鑒別的一種替代方法，標(biāo)記的多肽可與表達(dá)受體分子的細(xì)胞膜或提取物制劑光親和連接。交聯(lián)的材料通過(guò)PAGE分析和對(duì)x-射線底片曝光解析?？梢匀コ嚯氖荏w的標(biāo)記復(fù)合物并使其分解為肽片段，并經(jīng)受蛋白質(zhì)微測(cè)序。從微測(cè)序獲得的氨基酸序列可用于設(shè)計(jì)一組退化的寡核苷酸探針篩選cDNA文庫(kù)以鑒別編碼推定受體的基因。
本發(fā)明提供了篩選化合物以鑒定拮抗KGF-2的作用或阻斷KGF-2的功能的化合物的方法。這種測(cè)定例子包括把哺乳動(dòng)物角質(zhì)形成細(xì)胞、要篩選的化合物和3[H]胸苷在角質(zhì)形成細(xì)胞正常增殖的細(xì)胞培養(yǎng)條件下組合。對(duì)照測(cè)定可以在無(wú)篩選的化合物時(shí)進(jìn)行并比較在化合物存在下角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的量以確定化合物是否刺激角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。
為篩選拮抗劑，可以在KGF-2存在時(shí)進(jìn)行相同的測(cè)定，測(cè)定化合物阻止角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的能力并測(cè)定拮抗劑的能力。通過(guò)測(cè)定3[H]胸苷的摻入的液態(tài)閃爍色譜測(cè)定角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞增殖的量。
在另一個(gè)方法，表達(dá)KGF-2受體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或膜制備物在在化合物的存在下和標(biāo)記的KGF-2培養(yǎng)?？蓽y(cè)定化合物提高或封閉這種相互作用的能力。在化合物存在或不存在時(shí)測(cè)定和比較KGF-2和受體相互作用之后的已知的第二信使系統(tǒng)的反應(yīng)。這種第二信使系統(tǒng)包括但不限于cAMP鳥苷酸環(huán)化酶、離子通道或磷酸肌醇水解。
潛在的KGF-2拮抗劑的例子包括和多肽結(jié)合的抗體，或在某些情況下，包括寡核苷酸。另外，潛在的KGF-2拮抗劑可以是結(jié)合KGF-2受體的突變形式，然而，沒(méi)有引發(fā)第二信使反應(yīng)，因而有效地封閉了KGF-2的作用。
另一個(gè)潛在的KGF-2拮抗劑是使用反義技術(shù)制備的反義構(gòu)建體。反義技術(shù)可通過(guò)三股螺旋結(jié)構(gòu)或反義DNA或RNA，兩種方法基于多核苷酸和DNA或RNA結(jié)合。例如，多核苷酸5編碼部分(編碼本發(fā)明的成熟多肽)可用于設(shè)計(jì)長(zhǎng)度從10至40堿基對(duì)的反義RNA寡核苷酸。設(shè)計(jì)了和參與轉(zhuǎn)錄的基因區(qū)域互補(bǔ)的DNA寡核苷酸(三股螺旋-參見Lee等，核酸研究，63073(1979)；Cooney等，科學(xué)，241456(1988)；Dervan等，科學(xué)，2511360(1991))，由此防止KGF-2的轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)生。反義RNA寡核苷酸和mRNA在體內(nèi)雜交以封閉mRMA分子翻譯成KGF-2多肽(反義-Okano，神經(jīng)化學(xué)雜志，5660(1991)；寡核苷酸作為基因表達(dá)的反義抑制劑，CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)L(1988)。可以把上述的寡核苷酸施用給細(xì)胞以便在體內(nèi)表達(dá)反義RNA或DNA，從而抑制KGF-2的產(chǎn)生。
潛在的拮抗劑包括結(jié)合KGF-2并具有KGF-2受體結(jié)合位點(diǎn)的小分子，因而使受體難以接近這種KGF-2而阻止了正常的生物活性。小分子的例子包括但不限于小肽或類似肽的分子。
可以使用KGF-2拮抗劑預(yù)防腫瘤中的新血管生長(zhǎng)或血管生成的誘導(dǎo)。由KGF-2刺激的血管形成也產(chǎn)生幾個(gè)可以通過(guò)本發(fā)明的拮抗劑治療的病狀，這些病狀包括糖尿病視網(wǎng)膜病、抑制病理組織(如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的生長(zhǎng)。
也可以使用KGF-2拮抗劑治療小球腎炎，該疾病的特征是血管小球的上皮細(xì)胞的顯著增殖，這些細(xì)胞形成了填充鮑曼氏空間的細(xì)胞團(tuán)。
拮抗劑也可以用于抑制在外科后瘢痕瘤形成中所見的瘢痕組織的過(guò)量產(chǎn)生、心肌梗塞之后的纖維變性或與肺部纖維變性和再狹窄有關(guān)的纖維變性損傷?？梢允褂肒GF-2拮抗劑以治療其它由KGF-2刺激的增殖疾病，包括癌癥和卡波濟(jì)氏肉瘤。
KGF-2拮抗劑也可用于治療角膜的深層被眼色素層炎癥慢性滲透的角膜炎，該疾病的特征是上皮細(xì)胞的增殖。
拮抗劑可用于含有藥學(xué)上可接受的載體的如下文所述的組合物中。
本發(fā)明的多肽、激動(dòng)劑和拮抗劑可與適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)載體結(jié)合使用以組成藥物組合物。該組合物包含治療有效量的多肽、激動(dòng)劑或拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這種載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其組合物，制劑應(yīng)適于施用方式。
本發(fā)明也提供包含一種或多種用一種或多種本發(fā)明的藥物組合物填充的容器的藥物包或試劑盒。與這種容器有關(guān)的可以是管理制造、使用或銷售藥物或生物學(xué)產(chǎn)物的的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定形式的通告，該通告反映管理機(jī)構(gòu)同意制造、使用或銷售供人使用的產(chǎn)品。另外，本發(fā)明的多肽、激動(dòng)劑和拮抗劑可與其它治療化合物結(jié)合使用。
藥物組合物可以以方便的方式施用，如口服、局部施用、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、真皮內(nèi)路線。藥物組合物以有效治療和/或預(yù)防特定疾病的量施用。通常，它們以至少大約10μg/kg體重的量施用，大多數(shù)情況下，它們以每天不超過(guò)大約8mg/kg體重施用。在大多數(shù)情況下，劑量是每天大約10μg/kg至大約1mg/kg體重，考慮到施用路線、癥狀等。在局部施用的特異性情況下，藥劑施用的量?jī)?yōu)選地是每m2大約0.1μg至9mg。
KGF-2多肽、多肽的激動(dòng)劑和拮抗劑也按照本發(fā)明通過(guò)這種多肽在體內(nèi)表達(dá)使用，這就是所說(shuō)的“基因治療”。
這樣，例如，患者的細(xì)胞可以在體外用編碼多肽的多核苷酸(DNA或RNA)進(jìn)行基因工程操作，然后把工程細(xì)胞提供給用所述多肽治療的患者。這種方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。例如，細(xì)胞可以按照本領(lǐng)域已知的方法通過(guò)使用包含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒進(jìn)行工程操作。
同樣地，也可以通過(guò)，例如，本領(lǐng)域已知的方法在體內(nèi)工程操作細(xì)胞以在體內(nèi)表達(dá)多肽。如本領(lǐng)域中所知的，產(chǎn)生包含RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的生產(chǎn)細(xì)胞可以施用給患者以在體內(nèi)工程細(xì)胞并在體內(nèi)表達(dá)多肽。這些通過(guò)這種方法施用本發(fā)明的多肽的方法其它方法按照本發(fā)明的教導(dǎo)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。例如，工程細(xì)胞的表達(dá)載體可不使用逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如，用于在與適當(dāng)?shù)妮d體組合之后在體內(nèi)工程操作細(xì)胞的腺病毒。其它施用載體的例子包括基于HSV的載體系統(tǒng)、腺有關(guān)的病毒載體以及惰性載體，例如，葡聚糖包衣的鐵酸鹽顆粒。
本發(fā)明也涉及將KGF-2基因用作檢測(cè)與KGF-2核酸序列中突變存在有關(guān)的疾病或疾病易感性的診斷測(cè)定的一部分。
KGF-2基因的單個(gè)攜帶突變可在DNA水平通過(guò)各種技術(shù)檢測(cè)到。用于診斷的核酸可從患者的細(xì)胞中獲得，如血液、尿、唾液、活組織檢查和尸體解剖材料?；蚪MDNA可直接用于檢測(cè)，或在分析前通過(guò)使用PCR酶促擴(kuò)增(Saiki等，自然，324163-166(1986))。RNA或cDNA也可以用于相同的目的。作為例子，和編碼KGF-2的核酸互補(bǔ)的引物可用于鑒別和分析KGF-2突變。例如，可以通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和正常的遺傳型比較的變化檢測(cè)缺失和插入。點(diǎn)突變可以通過(guò)擴(kuò)增的DNA和放射性標(biāo)記的KGF-2RNA雜交，或替代地與放射性標(biāo)記的KGF-2反義DNA序列雜交鑒別。完全匹配的序列可通過(guò)核糖核酸酶A消化或通過(guò)解鏈溫度的區(qū)別從錯(cuò)配的雙鏈中區(qū)分。
基于DNA序列區(qū)別的遺傳試驗(yàn)可通過(guò)有或無(wú)變性劑的凝膠中DNA片段的電泳遷移率改變的檢測(cè)達(dá)到。小序列的缺失和插入可通過(guò)高分辨率凝膠電泳可視化。不同序列的DNA片段可在變性的甲酰胺梯度凝膠上區(qū)別，其中不同的DNA片段的遷移率按照其特異性解鏈或部分解鏈的溫度在不同的位置的凝膠中滯留(參見，例如，Myers等，科學(xué)，2301242(1985))。
在特異性位置的序列改變也可以通過(guò)核酸酶保護(hù)測(cè)定顯示，如核糖核酸酶和S1保護(hù)或化學(xué)裂解方法(例如，Cotton等，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)，854397-4401(1985))。
這樣，特異性DNA序列的檢測(cè)可通過(guò)如下方法完成，如雜交、核糖核酸酶保護(hù)、化學(xué)裂解、直接DNA測(cè)序或使用限制酶(例如，限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP))、基因組DNA的Southern印跡。
除了更常規(guī)的凝膠電泳和DNA測(cè)序之外，突變也可以通過(guò)原位分析檢測(cè)。
本發(fā)明也涉及用于檢測(cè)在各種組織中KGF-2蛋白質(zhì)改變的水平的診斷測(cè)定方法，因?yàn)榕c正常的對(duì)照組織樣品相比，蛋白質(zhì)的超量表達(dá)可以檢測(cè)疾病或疾病易感性(例如，腫瘤)的存在。用于檢測(cè)樣品中得自宿主的KGF-2蛋白質(zhì)的水平的測(cè)定方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的，包括放射免疫測(cè)定、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定、Western印跡分析、ELISA測(cè)定和“三明治形”測(cè)定。ELISA測(cè)定(Coligan等，免疫學(xué)當(dāng)前方案，1(2)，第6章，(1991))最初包括制備對(duì)KGF-2抗原特異性的抗體，優(yōu)選地是單克隆抗體。此外，制備了抗單克隆抗體的報(bào)道抗體。把可檢測(cè)的試劑(如放射性，熒光，或在此例中的辣根過(guò)氧物酶)吸附到報(bào)道抗體上；把樣品從宿主中除去并在固相支持體上(例如，聚苯乙烯盤，其結(jié)合樣品中的蛋白質(zhì))培養(yǎng)。然后通過(guò)和非特異性蛋白質(zhì)(如，牛血清蛋白)溫育封閉盤上的任何自由的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。接著，單克隆抗體在盤中溫育，在此期間，單克隆抗體連接任何吸附到聚苯乙烯盤上的KGF-2蛋白質(zhì)。所有未結(jié)合的單克隆抗體通過(guò)緩沖液洗去。把連接到辣根過(guò)氧物酶上的報(bào)道抗體置于盤中，引起報(bào)道抗體和任何連接KGF-2的單克隆抗體結(jié)合，然后洗去未吸附的報(bào)道抗體，接著把過(guò)氧物酶底物添加到盤中，在給定的時(shí)間段內(nèi)顯色的量和標(biāo)準(zhǔn)曲線相比時(shí)，可測(cè)定給定體積的患者樣品中存在的KGF-2蛋白質(zhì)的量。
可以使用競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定，其中把對(duì)KGF-2特異性的抗體吸附到標(biāo)記的固相支持體上，標(biāo)記的KGF-2和得自宿主的樣品通過(guò)固相支持體，然后通過(guò)(例如，通過(guò)液態(tài)閃爍色譜)檢測(cè)到的標(biāo)記的量和樣品中KGF-2的量相關(guān)聯(lián)。
“三明治”測(cè)定類似于ELISA測(cè)定。在“三明治”測(cè)定中，KGF-2通過(guò)固相支持體并和吸附到固相支持體上的抗體結(jié)合。然后使第二抗體和KGF-2結(jié)合。接著使標(biāo)記的并對(duì)第二種抗體是特異性的第三抗體通過(guò)固相支持體并和第二抗體結(jié)合，然后進(jìn)行定量測(cè)定。
本發(fā)明的序列對(duì)于染色體鑒別也有價(jià)值。序列對(duì)單個(gè)人染色體的特定位置是特異性地并可與其雜交。此外，目前有需要鑒別染色體上的特定位點(diǎn)?；趯?shí)際序列數(shù)據(jù)(重復(fù)多態(tài)性)的極少染色體標(biāo)記試劑目前可用于標(biāo)記染色體定位。按照本發(fā)明的DNA對(duì)染色體圖在序列和與疾病有關(guān)的基因相關(guān)中是重要的第一步。
簡(jiǎn)言之，通過(guò)從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選地15-25bp)，序列可以對(duì)染色體作圖。3端未翻譯區(qū)的計(jì)算機(jī)分析快速選擇不跨越基因組DNA中一個(gè)外顯子以上的引物，這樣使擴(kuò)增過(guò)程復(fù)雜化。然后這些引物用于包含單個(gè)人染色體的體細(xì)胞雜合體的篩選。只有那些包含與上述引物相對(duì)應(yīng)的人基因的雜合體才產(chǎn)生擴(kuò)增片段。
體細(xì)胞雜合體的PCR圖譜是把特定的DNA分配給特定染色體的快速方法。使用具有相同寡核苷酸引物的本發(fā)明，亞定位可用得自特定的染色體或大的基因組克隆庫(kù)的片段組(panel)以類似的方式達(dá)到。其它可相似地用于其染色體作圖的作圖策略包括原位雜交、用標(biāo)記的流式分選染色體預(yù)篩選以及通過(guò)和構(gòu)建的染色體特異性-cDNA文庫(kù)雜交預(yù)選擇。
cDNA克隆和中期染色體伸展的熒光原位雜交(FISK)可用于提供一個(gè)步驟的精確染色體定位。這些技術(shù)可與短至500或600個(gè)堿基的cDNA一起使用；然而，大于2,000bp的大克隆和具有用于簡(jiǎn)單檢測(cè)的充足的信號(hào)強(qiáng)度的單一染色體位點(diǎn)具有更高的結(jié)合可能性。FISH需要使用衍生EST的克隆，克隆越長(zhǎng)越好。例如，2,000bp良好，更好的是4,000，要達(dá)到合理的時(shí)間百分比的良好的結(jié)果，超過(guò)4,000有可能不必要。對(duì)于這種技術(shù)的綜述，參見Verma等，人染色體基本技術(shù)手冊(cè)，Pergamon出版社，紐約(1988)。
一旦序列對(duì)精確的染色體位點(diǎn)作圖，染色體上的序列的物理位點(diǎn)可以與遺傳圖數(shù)據(jù)相關(guān)。這種數(shù)據(jù)在，例如，V.McKusick，人類的孟德爾遺傳(可以聯(lián)機(jī)通過(guò)Johns Hopkins大學(xué)Welch醫(yī)學(xué)圖書館中得到)中找到。然后對(duì)相同的染色體區(qū)作圖的基因和疾病之間的關(guān)系通過(guò)聯(lián)接分析鑒別(物理鄰近的基因的共遺傳)。
接著，必須確定影響的和不受影響的個(gè)體之間cDNA和基因組序列的區(qū)別。如果在一些或所有受影響的個(gè)體中觀察到突變但在任何正常的個(gè)體中沒(méi)有觀察到，突變就很有可能是疾病的病原體。
隨著目前物理作圖和基因組作圖技術(shù)的解析，精確定位到與疾病有關(guān)的染色體區(qū)的cDNA可能是50至500個(gè)潛在的致病基因的一個(gè)(這需要1兆堿基圖譜解析，每20kb一個(gè)基因)。
多肽、它們的片段或其它衍生物或類似物，或表達(dá)它們的細(xì)胞可用作免疫原產(chǎn)生抗體。這些抗體可以是，例如，多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明也包括嵌合片段、單鏈和人源化抗體以及Fab片段或Fab表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)物。本領(lǐng)域已知的各種方法可用于這種抗體和片段的產(chǎn)生。
產(chǎn)生抗與本發(fā)明的序列相應(yīng)的多肽的抗體可通過(guò)直接把多肽注射進(jìn)動(dòng)物或?qū)?dòng)物(優(yōu)選地是非人類)施用多肽獲得。然后這樣獲得的抗體和多肽自身結(jié)合。以這種方式，即使僅編碼多肽片段的序列也可用于產(chǎn)生和整個(gè)天然多肽結(jié)合的抗體。然后可使用這種抗體從表達(dá)這種多肽的組織分離多肽。
對(duì)于單克隆抗體的制備，可以使用任何提供通過(guò)傳代細(xì)胞系培養(yǎng)物產(chǎn)生的抗體的技術(shù)。例子包括雜交瘤技術(shù)(Kohler和Milstein，1975，自然，256495-497)、trioma技術(shù)、人體B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，當(dāng)今免疫學(xué)，472)以及產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，單克隆抗體和癌癥治療，Alan R.Liss公司，77-96頁(yè))。
可使用描述來(lái)產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利4,946,778)以產(chǎn)生抗本發(fā)明的致免疫多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠也可用于表達(dá)抗本發(fā)明的致免疫多肽產(chǎn)物的人源化抗體。
本發(fā)明將還參考下列實(shí)施例描述；然而，可以理解，本發(fā)明不限于這種實(shí)施例。所有部分或量，除非特別指出，是指重量。
為了有利于理解下列的實(shí)施例，現(xiàn)描述某些常出現(xiàn)的方法和/或術(shù)語(yǔ)。
“質(zhì)?！蓖ㄟ^(guò)小寫p在大寫字母之前和/或其后和/或數(shù)字指定。本文的起始質(zhì)粒是市售的、基于非限制的基礎(chǔ)公開可得到的或按照出版的方法從可得到的質(zhì)粒構(gòu)建。此外，和所述的質(zhì)粒等價(jià)的質(zhì)粒在本領(lǐng)域中是已知的，而且對(duì)普通技術(shù)人員是明顯的。
DNA的“消化”指使用僅作用于DNA的某些序列的限制性酶催化裂解DNA。本文所使用的各種限制酶是市售的，所使用的反應(yīng)條件、輔因子或其它需要對(duì)普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。為了分析，典型地使用1μg質(zhì)粒或DNA片段和在20ml緩沖液中的大約2單位酶。要分離用于質(zhì)粒構(gòu)建的DNA片段，典型地用更大體積的20至250單位的酶消化5至50μg的DNA用于特定的限制酶的適當(dāng)緩沖液和底物量由制造廠商指定。通常使用在37℃下大約1小時(shí)的溫育時(shí)間，但是可按照供給者的指導(dǎo)變化。消化之后，反應(yīng)物直接在聚丙烯酰胺凝膠上電泳以分離所需的片段。
按照Goeddel，D.等，核酸研究，84057(1980)所述使用8％的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行所裂解的片段的大小分離。
“寡核苷酸”指可以化學(xué)合成的單鏈的聚脫氧核苷酸或兩條互補(bǔ)的聚脫氧核苷酸鏈。這種合成寡核苷酸沒(méi)有5磷酸鹽，這樣不和另一個(gè)寡核苷酸連接(在激酶存在下不以ATP添加磷酸鹽)。合成的寡核苷酸可與沒(méi)有脫磷酸化的片段連接。
“連接”指在兩條雙鏈核酸片段之間磷酸二酯鍵形成過(guò)程(Maniatis，T.等，同上，146)。除非特別指出，連接可以使用已知的緩沖液和條件用每0.5μg要連接的DNA片段的大約等克分子量10單位T4 DNA連接酶(“連接酶”)完成。
當(dāng)外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)部時(shí)，細(xì)胞就用這種外源DNA“轉(zhuǎn)化”。外源DNA可以或可以不整合(共價(jià)連接)進(jìn)染色體DNA內(nèi)部，以形成細(xì)胞基因組。例如，原核細(xì)胞和酵母的外源DNA可以在游離成分(如質(zhì)粒)上保持。對(duì)于真核細(xì)胞，穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是這種細(xì)胞，其中外源DNA整合進(jìn)染色體以便其通過(guò)子代細(xì)胞由染色體復(fù)制遺傳。這種能力是通過(guò)真核細(xì)胞建立由包含外源DNA的子代細(xì)胞群體組成的細(xì)胞系或克隆的能力證明。轉(zhuǎn)化的例子參見Graham，F(xiàn).和Van der Eb，A.，病毒學(xué)，52456-457(1973)。
“轉(zhuǎn)導(dǎo)”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)的”指這樣一種方法，通過(guò)這種方法細(xì)胞吸收外源DNA并把該外源DNA整合進(jìn)其染色體。轉(zhuǎn)導(dǎo)可以通過(guò)，例如轉(zhuǎn)染(指各種技術(shù)，通過(guò)這些技術(shù)，細(xì)胞吸收DNA)或感染(通過(guò)其使用病毒把DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞)完成。
實(shí)施例1KGF-2的細(xì)菌表達(dá)和純化編碼KGF-2的DNA序列(ATCC#35977)最初使用對(duì)應(yīng)于加工的KGF-2 cDNA(包括信號(hào)肽序列)的5和3末端序列的PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增。具有序列5CCCCACATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGCC 3(SEQ ID No.3)的5寡核苷酸引物包含包括并接著從假定的起始密碼子起始的30個(gè)核苷酸的KGF-2編碼序列Afl III限制性酶位點(diǎn)。3序列5CCCAAGCTTCCACAAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG 3(SEQ ID No.4)包含和Hind III位點(diǎn)的互補(bǔ)序列，其后為26個(gè)核苷酸的KGF-2。限制酶位點(diǎn)與細(xì)菌表達(dá)載體pQE-60上的限制性酶位點(diǎn)是相容的(Qiagen公司，Chatsworth，CA)。pQE-60抗生素抗性(Amp)、細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、IPTG-可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子操縱子(P/O)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、6-His標(biāo)記和限制性酶位點(diǎn)。然后用NcoI和BindIII消化pQE-60。把擴(kuò)增的序列連接進(jìn)pQE-60并符合讀框地插入。然后通過(guò)Sambrook，J.等在分子擴(kuò)增試驗(yàn)室手冊(cè)。冷泉港試驗(yàn)室出版社(1989)中描述的方法用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株M15/rep(Qiagen公司)。M15/rep4包含表達(dá)lacI阻遏物并傳遞卡那霉素抗性(Kan)的質(zhì)粒pREP4的多個(gè)拷貝。轉(zhuǎn)化體通過(guò)其在LB平板上生長(zhǎng)的能力鑒別，選擇得到了抗氨芐青霉素/卡那霉素的菌落。分離質(zhì)粒DNA并通過(guò)限制性分析確認(rèn)。使包含所需的構(gòu)建體的克隆在用Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)補(bǔ)充的LB培養(yǎng)基中的液體培養(yǎng)中生長(zhǎng)過(guò)夜(O/N)。使用O/N培養(yǎng)物接種以1∶100至1∶250接種大培養(yǎng)物。細(xì)胞生長(zhǎng)至光密度600(O.D.600)為0.4和0.6之間。然后添加IPTG(“異丙基-B-D-硫代乳吡喃糖苷”)至1mM的最終濃度。IPTG通過(guò)滅活lacI阻遏物、清除P/O導(dǎo)致提高的基因表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)。細(xì)胞再生長(zhǎng)3至4小時(shí)。然后通過(guò)離心收獲細(xì)胞。把細(xì)胞沉淀溶解在離液劑6克分子的鹽酸胍中。澄清之后，溶解的KGF-2通過(guò)肝素親和柱色譜從該溶液中純化，條件是使得蛋白質(zhì)可以緊密地結(jié)合(Hochuli，B.等，色譜學(xué)雜志，411177-184(1984))。KGF-2(純度為75％)通過(guò)高鹽緩沖液從柱中洗脫。
實(shí)施例2截短的KGF-2的細(xì)菌表達(dá)和純化編碼KGF-2的DNA序列(ATCC#75977)最初使用對(duì)應(yīng)于截短的KGF-2多肽cDNA(包括信號(hào)肽序列)的5和3末端序列的PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增。截短的KGF-2包含減(minus)36個(gè)氨基酸信號(hào)序列的多肽，以及恰好添加在半胱氨酸殘基之前的甲硫氨酸和丙氨酸殘基，這種殘基包括全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的氨基酸37。具有序列5 CATGCCATGGCGTGCCAAGCCTTGGTCAGGACATG 3(SEQ ID No.5)的5寡核苷酸引物包含NcoI限制性酶位點(diǎn)，該位點(diǎn)包含并跟隨KGF-2編碼序列的24個(gè)核苷酸。3序列5 CCCAAGCTTCCACAAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG3(SEQ ID No.6)包含和Hind III位點(diǎn)互補(bǔ)的序列，其后為KGF-2基因的26個(gè)核苷酸。限制酶位點(diǎn)與細(xì)菌表達(dá)載體pQE-60上的限制性酶位點(diǎn)是相容的(Qiagen公司，Chat sworth，CA)。pQE-60抗生素抗性(Amp)、細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、IPTG-可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子操縱子(P/O)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、6-His標(biāo)記和限制性酶位點(diǎn)。然后用NcoI和BindIII消化pQE-60。把擴(kuò)增的序列連接進(jìn)pQE-60并符合讀框地插入。然后通過(guò)Sambrook，J.等在分子擴(kuò)增試驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港試驗(yàn)室出版社(1989)中描述的方法用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株M15/rep(Qiagen公司)。M15/rep4包含表達(dá)lacI阻遏物并傳遞卡那霉素抗性(Kan)的質(zhì)粒pREP4的多個(gè)拷貝。轉(zhuǎn)化體通過(guò)其在LB平板上生長(zhǎng)的能力鑒別，選擇得到了抗氨芐青霉素/卡那霉素的菌落。分離質(zhì)粒DNA并通過(guò)限制性分析確認(rèn)。使包含所需的構(gòu)建體的克隆在用Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)補(bǔ)充的LB培養(yǎng)基中的液體培養(yǎng)中生長(zhǎng)過(guò)夜(O/N)。使用O/N培養(yǎng)物接種以1∶100至1∶250接種大培養(yǎng)物。細(xì)胞生長(zhǎng)至光密度600(O.D.600)為0.4和0.6之間。然后添加IPTG(“異丙基-B-D-硫代乳吡喃糖苷”)至1mM的最終濃度。IPTG通過(guò)滅活lacI阻遏物、清除P/O導(dǎo)致提高的基因表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)。細(xì)胞再生長(zhǎng)3至4小時(shí)。然后通過(guò)離心收獲細(xì)胞。把細(xì)胞沉淀溶解在離液劑6克分子的鹽酸胍中。澄清之后，溶解的KGF-2通過(guò)肝素親和柱色譜從該溶液中純化，條件是使得蛋白質(zhì)可以緊密地結(jié)合(Hochuli，B.等，色譜學(xué)雜志，411177-184(1984))。KGF-2(純度為75％)通過(guò)高鹽緩沖液從柱中洗脫。
實(shí)施例3使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)克隆并表達(dá)KGF-2使用對(duì)應(yīng)于基因的5和3序列的PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增編碼全長(zhǎng)KGF-2蛋白質(zhì)的DNA序列(ATCC#75977)。5引物具有序列5GCGGGATCCGCCATCATGTGGAAATGGATACTCAC 3(SEQ ID No.7)并包含在裝配真核細(xì)胞翻譯起始的有效的信號(hào)的6個(gè)核苷酸后的BamHI限制性酶位點(diǎn)(粗體)(Kozak，M.，分子生物學(xué)雜志，196947-950(1987)，同時(shí)恰好在KGF-2基因的前17個(gè)核苷酸后(翻譯起始密碼子“ATG”有下劃線)。3引物具有序列5 GCGCGGTACCACAAACGTTGCCTTCCT(SEQ ID No.8)并包含與KGF-2基因的3-非翻譯序列互補(bǔ)的限制性內(nèi)切核酸酶Asp718和19的裂解位點(diǎn)。擴(kuò)增的序列使用Qiagen公司，Chatsrorth，CA市售的試劑盒從1％瓊脂糖凝膠中分離。然后片段以內(nèi)切核酸酶BamHI和Asp718消化，然后再在1％瓊脂糖凝膠中純化，該片段定名為F2。
使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(參見綜述Summers，M.P.和Smith，G.E.，1987，桿狀病毒載體和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)步驟方法手冊(cè)，Texas農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站公報(bào)1555號(hào))使載體pA2(pVL941載體的改良，討論如下)用于表達(dá)KGF-2蛋白質(zhì)。該表達(dá)載體包含在限制性內(nèi)切核酸酶BamHI和Asp718的識(shí)別位點(diǎn)之后的苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(AcMNPV)的強(qiáng)多面形啟動(dòng)子；猿猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位點(diǎn)用于有效的聚腺苷酸化。為了易于選擇重組病毒，把大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因以和多面體啟動(dòng)子相同的方向插入，其后為多面體基因的聚腺苷酸化信號(hào)。多面體序列的兩側(cè)是用于共轉(zhuǎn)染的野生型病毒DNA的細(xì)胞介導(dǎo)的同源重組的病毒序列。許多其它的桿狀病毒載體可用于替代pRG1，如pAc373、pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.和Summers，M.D.，病毒學(xué)，17031-39)。
以限制酶BamHI和Asp718消化質(zhì)粒。然后使用市售的試劑盒(Qiagen公司，Chatsworth，CA)從1％的瓊脂糖凝膠分離DNA。該載體DNA定名為V2。
用T4 DNA連接酶連接片段F2和質(zhì)粒V2。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101細(xì)胞，使用兩種克隆寡核苷酸的PCR鑒別包含攜帶KGF-2基因的質(zhì)粒(pBacKGF-2)。克隆片段的序列通過(guò)DNA測(cè)序確認(rèn)。
使用脂轉(zhuǎn)染法(Felgner等，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)。847413-7417(1987))用1.0μg的市售的線形化的桿狀病毒(“BaculoGold桿狀病毒DNA”，Pharmingen，San Diega，CA.)共轉(zhuǎn)染5μg的質(zhì)粒pBacKGF-2。
把1μg的BaculoGold病毒DNA和5μg的質(zhì)粒pBacKGF-2在無(wú)菌的微滴定板的孔中。包含50μl的無(wú)血清Graces培養(yǎng)基(Life Technologies公司，Gaithers-burg，MD)。之后添加10μl的Grace培養(yǎng)基加50μl的脂轉(zhuǎn)染試劑，混合并在室溫下溫育15分鐘。然后把轉(zhuǎn)染混合物滴加至在含有無(wú)血清的1ml Graces培養(yǎng)基的35mm組織培養(yǎng)平板中的Sf9昆蟲細(xì)胞中(ATCC CRL 1711)。平板來(lái)回振蕩以混合新加入的溶液。然后平板在27℃下培養(yǎng)5小時(shí)。5小時(shí)之后，從平板中除去轉(zhuǎn)染溶液，添加用10％胎牛血清予以補(bǔ)加的1ml的Graces昆蟲培養(yǎng)基。把平板放回恒溫箱中，培養(yǎng)保持在27℃下4天。
在4天后，收集上清液，進(jìn)行類似于Summers和Smith(同上)所述的噬斑測(cè)定。改進(jìn)之處是使用帶有“Blue Gal”的瓊脂糖凝膠(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)以使得可以分離染藍(lán)的噬斑(“噬斑測(cè)定”的詳盡描述可在由Life Technologies公司，Gaithersburg發(fā)布的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和桿狀病毒學(xué)的用戶指南第9-10頁(yè)中找到)。
系列稀釋4天之后，把病毒添加到細(xì)胞中，以Eppepdorf吸管尖端挑出染藍(lán)的噬斑。然后把包含重組病毒的瓊脂重新懸浮在包含200μl的Graces培養(yǎng)基的Bppendorf試管中。通過(guò)短時(shí)間的離心除去瓊脂，使用包含重組桿狀病毒的上清液感染在35mm盤中的Sf9細(xì)胞。4天后收獲這些培養(yǎng)盤的上清液，然后在4℃下保存。
在用10％的熱滅活的FB補(bǔ)加的Graces培養(yǎng)基中培養(yǎng)Sf9細(xì)胞。以感染復(fù)數(shù)(MOI)為2用重組桿狀病毒V-KGF-2感染細(xì)胞。6小時(shí)后除去培養(yǎng)基并以SF900減甲硫氨酸和半胱氨酸(Life Technologies公司，Gaithersburg)代替；42小時(shí)后添加5μCi的35S-半胱氨酸(Amersbam)。細(xì)胞還培養(yǎng)16小時(shí)，然后通過(guò)離心收獲，標(biāo)記的蛋白質(zhì)通過(guò)SDS-PAGE和放射自顯影可視化。
實(shí)施例4重組KGF-2在COS細(xì)胞中的表達(dá)質(zhì)粒KGF-2 HA的表達(dá)源自載體pcDNAI/Amp(Invitrogen)，該載體包含1)SV40的復(fù)制起點(diǎn)，2)氨芐青霉素抗性基因，3)大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)，4)CMV啟動(dòng)子，其后為多接頭區(qū)，SV40內(nèi)含子和聚腺苷酸化位點(diǎn)。把編碼全KGF-2前體和符合讀框地融合到其3端的HA標(biāo)記的DNA片段克隆進(jìn)載體的多接頭區(qū)，因此，重組蛋白質(zhì)表達(dá)受CMV啟動(dòng)子的指導(dǎo)。對(duì)應(yīng)于表位的HA標(biāo)記如上所述得自流感血細(xì)胞凝集素蛋白質(zhì)(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A.Cherenson，M.Cannolly和R.Lerner，1984，細(xì)胞，37767，(1984))。HA標(biāo)記融合到靶蛋白質(zhì)使得易于用識(shí)別HA表位的抗體檢測(cè)重組蛋白質(zhì)。
質(zhì)粒構(gòu)建策略描述如下通過(guò)PCR使用兩種引物構(gòu)建編碼KGF-2，ATCC#75977的DNA序列5引物5 CCCAAGCTTATGTGGAAAGGATACTGACACATTGTGCC 3(SEQ ID No.9)包含HindIII位點(diǎn)，其后為從起始密碼子開始的30個(gè)核苷酸的KGF-2編碼序列；3序列5 TGCTCTAGACTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGG(SEQ ID No.10)包含和XbaI位點(diǎn)、翻譯終止密碼子、HA標(biāo)記和編碼KGF-2序列的最后的32個(gè)核苷酸(不包括終止密碼子)互補(bǔ)的序列。因此，PCR產(chǎn)物包含HindIII位點(diǎn)、KGF-2編碼序列(其后為符合讀框地融合的HA標(biāo)記)、緊接著HA標(biāo)記的翻譯終止密碼子以及XbaI位點(diǎn)。用BindIII和XbaI限制酶消化并連接PCR擴(kuò)增的DNA片段和載體pcDNAI/Amp。把連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株XL1 Blue(Stratagene克隆系統(tǒng)，LaJolla，CA)。轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物平板接種于氨芐青霉素培養(yǎng)基平板上并選擇抗性菌落。從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA并通過(guò)PCR和限制性分析檢測(cè)正確片段的存在。要表達(dá)重組KGP-2，使用DEAE-DEXTRAN方法(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆試驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港試驗(yàn)室出版社，(1989))用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。用放射性標(biāo)記和免疫沉淀方法檢測(cè)(E.Harlow，D.Lane，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1988))KGF-2HA蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)染2天后，細(xì)胞以35S-半胱氨酸標(biāo)記8小時(shí)。然后收集培養(yǎng)基，細(xì)胞以去垢劑(RIPA緩沖液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5)(Wilson，I.等，同上，37767(1984))水解。細(xì)胞水解物和培養(yǎng)基都用HA特異性單克隆抗體沉淀。沉淀的蛋白質(zhì)沉淀在15％SDS-PAGE凝膠上分析。
實(shí)施例5重組KGF-2在體外的轉(zhuǎn)錄和翻譯得自在pA2載體中的克隆的cDNA的PCR產(chǎn)物用于KGF-2的昆蟲細(xì)胞表達(dá)。用于這種PCR的引物是5 ATTAACCCTCACTAAAGGGAGGCCATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGCC3(SEQ IDNo.11)和5 CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG 3(SEQ ID No.12)。
第一個(gè)引物包含T3啟動(dòng)子5至ATG起始密碼子的序列；第二個(gè)引物和KGF-2的開放讀框互補(bǔ)并編碼終止密碼子的反向互補(bǔ)序列。
形成的PCR產(chǎn)物使用購(gòu)自Qiagen的試劑盒純化。0.5μg的這種DNA可用作體外轉(zhuǎn)錄翻譯反應(yīng)的模板。反應(yīng)以TNT的名義使用從Promega購(gòu)買的試劑盒進(jìn)行。除了僅使用試劑指定體積的1/2并使反應(yīng)在33℃下進(jìn)行1.5小時(shí)之外，測(cè)定使用放射性標(biāo)記的甲硫氨酸作為底物如試劑盒的說(shuō)明中描述的進(jìn)行。
在變性處理的10至15％的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離5μl的反應(yīng)物。凝膠以水∶甲醇∶醋酸(分別以6∶3∶1的體積)的混合物固定30分鐘。然后凝膠在高溫和真空中干燥，其后對(duì)X-射線底片曝光16小時(shí)。顯影膠卷顯示在大小上對(duì)應(yīng)于概念上的翻譯的KGF-2的放射性蛋白質(zhì)帶的存在，這有力地表明KGP-2的克隆的cDNA包含編碼預(yù)期大小蛋白質(zhì)的開放讀框。
按照以上教導(dǎo)，本發(fā)明許多的改良和變化是可能的，因此，在所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)(而不是按具體描述)可以實(shí)施本發(fā)明。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人GRUBER等(ii)發(fā)明名稱角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(iii)序列數(shù)12(iv)通訊地址(A)通訊人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCI，STEWERT和OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM路(C)城市ROSELAND(D)州新澤西州(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵區(qū)代碼07068(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型3.5英寸軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PS/2(C)操作系統(tǒng)MS-DOS(D)軟件WORD PERFECT版本#5.1(vi)當(dāng)前申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類號(hào)(vii)在先申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(viii)律師/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)登記號(hào)36,134(C)證書/檔案號(hào)325800-261(ix)電信信息(A)電話201-994-1700(B)傳真201-994-1744(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度627個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGTGGAAAT GGATACTGAC ACATTGTGCC TCAGCCTTTC CCCACCTGCC CGGCTGCTGC 60TGCTGCTGCT TTTTGTTGCT GTTCTTGGTG TCTTCCGTCC CTGTCACCTG CCAAGCCCTT 120GGTCAGGACA TGGTGTCACC AGAGGCCACC AACTCTTCTT CCTCCTCCTT CTCCTCTCCT 180TCCAGCGCGG GAAGGCATGT GCGGAGCTAC AATCACCTTC AAGGAGATGT CCGCTGGAGA 240AAGCTATTCT CTTTCACCAA GTACTTTCTC AAGATTGAGA AGAACGGGAA GGTCAGCGGG 300ACCAAGAAGG AGAACTGCCC GTACAGCATC CTGGAGATAA CATCAGTAGA AATCGGAGTT 360GTTGCCGTCA AAGCCATTAA CAGCAACTGT TACTTAGCCA TGAACAAGAA GGGGAAACTC 420TATGGCTCAA AAGAATTTAA CAATGACTGT AAGCTGAAGG AGAGGATAGA GGAAAATGGA 480TACAATACCT ATGCATCATT TAACTGGCAG CATAATGGGA GGCAAATGTA TGTGGCATTG 540AATGGAAAAG GAGCTCCAAG GAGAGGACAG AAAACACGAA GGAAAAACAC CTCTGCTCAC 600TTTCTTCCAA TGGTGGTACA CTCATAG 627(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度208個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Trp Lys Trp Ile Leu Thr His Cys Ala Ser Ala Phe Pro His-35 -30 -25Leu Pro Gly Cys Cys Cys Cys Cys Phe Leu Leu Leu Phe Leu Val-20 -15 -10Ser Ser Val Pro Val Thr Cys Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val-51 5Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro10 15 20Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly25 30 35Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu40 45 50Lys Ile Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn55 60 65Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val Glu Ile Gly Val70 75 80Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn85 90 95Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys100 105 110Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala115 120 125Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu130 135 140Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys145 150 155Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser160 165 170(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO3CCCCACATGT GGAAATGGAT ACTGACACAT TGTGCC 36(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO4CCCAAGCTTC CACAAACGTT GCCTTCCTCT ATGAG 35(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5CATGCCATGG CGTGCCAAGC CCTTGGTCAG GACATG36(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6CCCAAGCTTC CACAAACGTT GCCTTCCTCT ATGAG 35(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型；單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7GCGGGATCCG CCATCATGTG GAAATGGATA CTCAC 35(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8CGCGGTACCA CAAACGTTGC CTTCCT 26(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO9CCCAAGCTTA TGTGGAAATG GATACTGACA CATTGTGCC 39(2)SEQID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度69個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO10TGCTCTAGAC TAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTATGAGTGTACCA CCATTGGAAG AAAGTGAGG 69(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度54個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO11ATTAACCCTC ACTAAAGGGA GGCCATGTGG AAATGGATACTGACACATTG TGCC 54(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO12CCCAAGCTTC CACAAACGTT GCCTTCCTCT ATGAG 3權(quán)利要求
1.一種選自由下列物質(zhì)組成的組的分離的多核苷酸(a)一種編碼具有推定的SEQ ID No.2的氨基酸序列的多肽或所說(shuō)多肽的片段、類似物或衍生物的多核苷酸；(b)一種編碼具有由包含在ATCC保藏號(hào)75977中的cDNA編碼之氨基酸序列的多肽或所說(shuō)多肽的片段、類似物或衍生物的多核苷酸；
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所說(shuō)的多核苷酸是DNA。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所說(shuō)的多核苷酸是RNA。
4.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所說(shuō)的多核苷酸是基因組DNA。
5.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所說(shuō)的多核苷酸編碼具有推定的SEQ IDNo.2的氨基酸序列的多肽。
6.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所說(shuō)的多核苷酸編碼由包含在ATCC保藏號(hào)75977的cDNA編碼的多肽。
7.權(quán)利要求1的多核苷酸，該多核苷酸具有在SEQ ID No.1中所示的編碼序列。
8.權(quán)利要求2的多核苷酸，該多核苷酸具有按照ATCC保藏號(hào)75973保藏的多肽的編碼序列。
9.一種包含權(quán)利要求2的DNA的載體。
10.一種用權(quán)利要求9的載體經(jīng)遺傳工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞。
11.一種用于產(chǎn)生多肽的方法，該方法包括從權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞表達(dá)由所說(shuō)的DNA編碼的多肽。
12.一種產(chǎn)生可以表達(dá)多肽的細(xì)胞的方法，該方法包括用權(quán)利要求9的載體經(jīng)遺傳工程產(chǎn)生細(xì)胞。
13.一種可與權(quán)利要求2的DNA雜交并編碼具有KGF-2活性的多肽的分離的DNA。
14.一種選自由下列物質(zhì)組成的組的多肽(i)一種具有推定的SEQ IDNo.2的氨基酸序列的多肽及其片段、類似物或衍生物；(ii)一種由包含在ATCC保藏號(hào)75977的cDNA編碼的多肽以及所說(shuō)多肽的片段、類似物或衍生物。
15.權(quán)利要求14的多肽，其中所說(shuō)多肽是具有推定的SEQ ID No.2的氨基酸序列的KGF-2。
16.一種抗權(quán)利要求14的多肽的抗體。
17.一種作為權(quán)利要求14的多肽的激動(dòng)劑有效的化合物。
18.一種作為抗權(quán)利要求14的多肽的拮抗劑有效的化合物。
19.一種治療需要KGF-2的患者的方法，該方法包括給患者施用治療有效量的權(quán)利要求14的多肽。
20.一種治療需要KGF-2的患者的方法，該方法包括給患者施用治療有效量的權(quán)利要求18的化合物。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所說(shuō)的治療有效量的多肽通過(guò)給患者提供編碼所說(shuō)多肽的DNA和體內(nèi)表達(dá)所說(shuō)多肽來(lái)施用。
22.一種鑒別作為KGF-2激動(dòng)劑有活性的化合物的方法，該方法包括(a)將待篩選的化合物與包含在細(xì)胞通常受KGF-2刺激的條件下之細(xì)胞的反應(yīng)混合物組合，所說(shuō)的反應(yīng)混合物包含在細(xì)胞增殖時(shí)摻入細(xì)胞的標(biāo)記；(b)確定細(xì)胞增殖的程度以鑒別所說(shuō)化合物是否是有效的激動(dòng)劑。
23.權(quán)利要求22的鑒別作為KGF-2拮抗劑有活性的化合物的方法，其中把KGF-2添加到步驟(a)的組合體中。
24.一種診斷與權(quán)利要求14的多肽不足表達(dá)相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括從得自宿主的樣品分離編碼所說(shuō)多肽的核酸序列；確定在編碼所說(shuō)多肽的核酸序列中的突變。
25.一種包括以下步驟的診斷方法在得自宿主的樣品中分析權(quán)利要求14的多肽的存在。
全文摘要
本文公開了一種人體多肽、編碼這種多肽的DNA(RNA)以及通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生這種多肽的方法。本文也公開了使用這種多肽刺激上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，該方法可用于刺激創(chuàng)傷愈合、減少瘢痕形成以及預(yù)防脫發(fā)。本發(fā)明也公開了抗這種多肽的拮抗劑以及使用它們作為治療增殖疾病(如癌、牛皮癬、卡波濟(jì)氏肉瘤、瘢痕瘤、視網(wǎng)膜病和restcnosis)的治療劑。本文還公開了檢測(cè)KGF－2編碼序列中的突變和在來(lái)源于宿主的樣品中的KGF－2濃度的改變的診斷方法。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1475570SQ0312064
公開日2004年2月18日 申請(qǐng)日期1995年2月14日 優(yōu)先權(quán)日1995年2月14日
發(fā)明者J·R·格胡伯, P·J·迪龍, J R 格胡伯, 迪龍 申請(qǐng)人:人類基因組科學(xué)公司