專利名稱：識別潛在的免疫優(yōu)勢乙酰膽堿受體α亞基肽的制作方法
背景技術：
自身免疫性疾病是特別重要的一類有害的免疫反應，它影響9,000,000多人口，構成美國的一個主要健康問題。在自身免疫性疾病中，機體缺失自我耐受，免疫系統(tǒng)把自身組織當作外來目標攻擊。這些疾病在缺少治療時，一般發(fā)展為慢性疾病，許多情況下導致患者死亡。
原始的治療自身免疫性疾病的方法一般為免疫抑制。這種方法明顯的弊端在于削弱機體對真正外來物質激發(fā)免疫反應的反應能力。僅稍微成熟的治療方法依賴于移除目標組織中的免疫復合物。這種方法也有副作用并且難于實現。除了使用含有害副作用的免疫抑制劑，任何的自身免疫性疾病幾乎沒有有效的治療方法?，F有30多種發(fā)病率各不相同的器官特異和全身形式的自身免疫性疾病。那些有相對較多患者的疾病，例如，類風濕性關節(jié)炎、I型糖尿病和多發(fā)性硬化，由于明顯的經濟原因被經常鎖定為開發(fā)新治療方法的目標。
對于T淋巴細胞在保持免疫耐受和自身免疫性病理中作用認識的加深，觸發(fā)了許多抗原特異的治療方法的發(fā)展，這些方法擬于抑制或消除自身反應性T細胞，同時保持保護性免疫反應。這些方案依賴于自身免疫性疾病中自身抗原和自身抗原肽表位的識別。對于許多自身免疫性疾病，包括那些有較多患者的疾病，這方面的信息是未知的、不完全的或有爭議的。
重癥肌無力(MG)是影響神經肌肉接頭并可威脅生命的一種自身免疫性疾病?；颊呷藬导s在25,000至100,000間波動(Drachman(1994)N.Eng.J.Med.3301797-1810；MG Foudation，1997)，患者人數預期隨著平均人口年齡的增長而增長。MG以乙酰膽堿受體(AChR)自身抗體為特征。動物體內模型和免疫抑制藥物實驗說明，這些自身抗體的產生依賴于CD4+T細胞。在MG的情況下，自身抗體與神經肌肉接頭肌膜表面的乙酰膽堿受體(AChR)結合，引起AChR的內吞和補體介導的損傷。AChR的丟失減少了肌肉做功的效率，產生從疲勞到呼吸衰竭的癥狀。
MG為抗原特異療法的發(fā)展和臨床檢測提供許多便利，包括一個明確鑒定的自身抗原AChR的存在。AChR被普遍認為是自身反應性T和B細胞的靶位，不像在多發(fā)性硬化等疾病中可以是多種髓磷脂蛋白(包括髓磷脂堿性蛋白、蛋白脂質蛋白、髓磷脂少突細胞糖蛋白、髓磷脂相關糖蛋白、αB-晶體蛋白、CNPase和熱休克蛋白)。而且也可方便獲得明確的臨床參數。例如，檢測由于膽堿酯酶阻斷造成肌肉受損而使功能暫時減退的拉力試驗，抗AChR抗體的檢測是MG的診斷工具。早期發(fā)病患者的疾病與HLA-DR3相關，晚期發(fā)病與HLA-DR2相關。而且，肌電圖可以方便地檢測肌肉功能，ELISA及其它相對簡單的分析可以得到抗AChR抗體的水平，所以MG的臨床檢測得益于疾病活動度的簡單的和明確的替代標記物。除了這些優(yōu)點，在MG的治療方面還沒有實驗其它方案。
開發(fā)MG抗原特異治療方法的最大困難是目前缺少關于免疫優(yōu)勢AChR表位的特性的一致意見。
AChR是一個五聚體離子通道，在成人受神經支配的肌肉中由α2βεδ組成，在胚胎和去神經支配的肌肉中及胸腺肌樣細胞中由α2βγδ組成。AChRα亞基既是乙酰膽堿的結合位點，其67-76的結構域位點又是與自身抗體結合的(Tzartos等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852899-2903)主要免疫原區(qū)(MIR)，即自身抗原結合的優(yōu)勢位點。雖然有許多關于優(yōu)勢AChR T細胞表位的文獻報道，其中許多研究并不確定，所以并沒有明確一致的意見(見綜述，例如，Manfredi等，(1992)J.Lab.Clin.Med.113-21；Hawke等，(1996)Immunol.Today 17307-311)。這些實驗中的大多數沒有檢驗HLA-DR限制。另外，一些研究基于對合成AChR肽具有反應性的T細胞系的產生鑒定了免疫優(yōu)勢肽，但在許多情況下，這些T細胞不能對天然AChR產生反應(Matsuo等，(1995)J.Immunol.1553683-3692；Hawke等，supra)。這樣就不明確是否這些T細胞是分析系統(tǒng)中的假象。
以往的研究檢驗了MG患者外周血單核細胞對一組AChR肽的反應(見Harcourt等，(1988)J.Clin.Invest.821894；和Newsom-Davis等，(1989)J.Autoimmun.2101)。然而這些研究或者檢驗了一組不完全的AChR肽，或者檢驗了連續(xù)肽的重疊限于幾個氨基酸的一組肽，可能錯過某些相關表位。其它情況下，HLA-DR對T細胞反應的限制并無測定。另一些可能對MG有重要意義的研究識別了結合HLA-DR等位基因的免疫優(yōu)勢肽，但T細胞對這些肽的反應仍未被證實。除了這些進展，該技術缺乏對HLA-DR相關免疫優(yōu)勢AChR肽的一致意見。
目前對MG的治療并非特異，許多情況下存在有害的副作用。例如，移除抗體的血液透析是一項昂貴的操作，抗體滴度在透析結束后可以迅速回升，并超過透析前標準。類固醇和其它免疫抑制劑(例如，ACTH、咪唑硫嘌呤和環(huán)胞霉素A)有時也被使用，但經常引發(fā)腎毒性、高血壓或其它健康危險。胸腺切除有時有療效，但經常失敗，并需要術后五年以上才見效，對兒童及老年患者禁忌。
因此，該領域需要沒有主要副作用且不影響整個免疫系統(tǒng)的治療自身免疫性疾病特別是MG的有效方法。本發(fā)明即著手于這些和其它需求。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及可用于抑制重癥肌無力時免疫系統(tǒng)自身免疫反應的組合物。本發(fā)明組合物的作用靶點設計為識別與MHC成分相聯(lián)系的特異抗原的輔助T細胞。本發(fā)明組合物結合T細胞且引起靶T細胞的無反應性，提供了較前副作用更少的特異性療法。
本發(fā)明提供了識別與HLA-DR2和HLA-DR3有較高親和力的AChR亞基肽，HLA-DR2和HLA-DR3在具有這些單倍型的患者中可能代表免疫優(yōu)勢T細胞表位。這些肽可被用于誘導靶位T細胞的無反應性并用于MG的治療。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了所述肽。其它實施方案中，該肽被用于藥物組合物治療MG，或與MHC分子結合用于藥物組合物。另一方案中，本發(fā)明提供了一種治療MG的方法。
附圖簡述

圖1表示HLA-DR2和HLA-DR3親和力DELFIA分析中檢測到的重疊AChR肽位置。
圖2列出結合HLA-DR2和HLA-DR3的每個AChR肽的IC50值。大于100,000nM的IC50值以“＞”表示。
圖3表示AChRα肽1/IC50值的柱狀圖，說明了肽與HLA-DR2和HLA-DR3的相對親和力。
圖4表示對HLA-DR2具有高親和力的AChRα肽的可能的DRB1*1501基序排列。與公開的HLA-DR2基序最適的AChRα肽順序和IC50值共同標出。
圖5表示對HLA-DR3具有高親和力的AChRα肽的可能的DRB1*0301基序排列。與公開的HLA-DR3基序最適的AChRα肽順序和IC50值共同標出。
圖6列出HLA-DR2和HLA-DR3的候選免疫優(yōu)勢AChR肽。那些IC50值≤10,000nM的肽被列出。
圖7表示正常健康個體樣本PBMCs的ELISPOT測定結果。特定抗原的反應指數為2或大于2時認為是陽性。
圖8表示MG患者樣本PBMCs的ELISPOT測定結果。如果特定抗原的反應指數大于2則T細胞反應鑒定為陽性。
圖9表示正常健康個體(“正常”)或MG患者(“患者”)對不同AChR肽陽性反應性的百分比對比。
圖10表示DR2+正常健康個體(“正?！?或DR2+MG患者(“患者”)對AChR肽反應性的百分比對比。
具體實施方案的說明I.前言本發(fā)明提供可用于調節(jié)T細胞功能的肽。例如，該肽可與MHC分子結合，并抑制T細胞介導的有害免疫反應，特別是重癥肌無力。而且該肽自身可誘導無反應性并應用于疾病治療。
以下分別描述該肽和可與之形成復合物的MHC成分，并且說明該肽和復合物的制備、評價和使用方法。適于制備和使用本發(fā)明MHC肽復合物的一般方法由美國專利5,468,481和PCT專利申請WO96/40944公布。
本發(fā)明特別提供了新的乙酰膽堿受體(AChR)肽、MHCII類多肽和MHCII類多肽AChR肽復合物。本發(fā)明提供分離的(從天然來源)、合成的和重組產生的AChR肽和MHCII類多肽形式。這些肽和蛋白可在體外或體內重組表達。使用本領域任何已知的方法可以制備和分離本發(fā)明的肽、多肽和復合物，本發(fā)明提供一些示例性的制備這些蛋白的方法。而且，制備MHCII類肽復合物的方法在以下文獻有說明，例如，美國專利5,194,425，公布于1993年3月16日；5,130,297，公布于1992年7月14日；5,284,935，公布于1994年2月8日；5,260,422，公布于1993年11月9日；和5,468,481，公布于1995年11月21日；和PCT專利申請NO.WO96/40944。
本發(fā)明的核酸操作和編碼AChR肽、MHCII類分子和AChR肽MHCII類肽復合物基因的重組表達技術在科學和專利文獻(見，例如，Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual(2nd Ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，(1998)；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.New York(1997)；和Tijssen等，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular BiologyHybridization WithNucleic Acid Probes，Part I.Theory and Nucleic AcidPreparation，Elsevier，N.Y.(1993))中描述。使用各種本領域專業(yè)人員熟知的方法在核酸內引入突變。例如，快速實施定點誘變的有效方法是聚合酶鏈反應延伸的重疊(Urban(1997)Nucleic Acids Res.252227-2228)。證實感興趣的核酸序列的測序方法多選用雙脫氧測序法(Sequenase，U.S.Biochemica1)，或本領域專業(yè)人員熟知的其它試劑盒和方法?？梢允褂酶鞣N本領域專業(yè)人員熟知的轉化原核和真核細胞的方法和體內表達系統(tǒng)(見，例如，Weising(1988)Ann.Rev.Gene t.22421-477；Sambrook等；和Tijssen等，均同上)。
本發(fā)明中的AChR肽、MHCII類分子和MHCII類肽肽復合物可使用本領域熟知的化學方法全部或部分合成(見，例如，Caruthers(1980)Nucleic Acids Res.Symp.Ser.215-223；Horn(1980)NucleicAcids Res.Symp.Ser.225-232；和Banga，Therapeutic Peptidesand Proteins，Formulation，Processing and Delivery SystemsTechnomic Publishing Co.，Lancaster，PA(1995))。例如，可以使用不同的固相技術(見，例如，Roberge(1995)Science 269-202；和Merrifield(1997)Methods Enzymol.2893-13)合成肽，也可遵照制造者提供的使用說明利用ABI431A肽合成儀(Perkin Elmer)自動合成肽。II.定義在此使用的“肽”或“寡肽”是指一系列殘基，尤其是兩者之間典型地通過α-氨基和鄰近氨基酸的羰基之間的肽鍵連接的L-氨基酸。只要保持正確的表位，肽的長度并不是關鍵。典型的肽長度少于約30個氨基酸，通常由約10-25個殘基，優(yōu)選14-20個殘基組成。
“AChR寡肽”是具有來源于AChR的一部分的序列，特異地結合MHC分子并誘導重癥肌無力相關的T細胞免疫反應。寡肽可以包括來源于AChR的序列(例如，7-22或36-49位殘基)，或與之基本相似的序列。該術語在以下介紹中也包括這些序列的各種類似物。
術語“殘基”指通過酰胺鍵或酰胺鍵模擬物插入寡肽的氨基酸(D或L)或氨基酸模擬物。本發(fā)明中的肽鍵模擬物包括本領域技術人員熟知的變異肽主鏈。
在此使用的“氨基酸模擬物”是天然存在的氨基酸以外的部分，在結構和功能上當作本發(fā)明肽中氨基酸的替代物。如果這種部分基本不干擾肽結合AChR的能力，即可當作氨基酸殘基的替代物。氨基酸模擬物包括非蛋白氨基酸，例如，β-γ-δ氨基酸、β-γ-δ亞氨基酸(例如哌啶-4-羧基酸)和許多L-α氨基酸的衍生物。本領域技術人員已獲知許多合適的氨基酸模擬物，包括環(huán)己基丙氨酸、3-環(huán)己基丙酸、L-金剛烷丙氨酸，金剛烷乙酸等。適用于本發(fā)明的肽類似物見Morgan和Gainor(1989)Ann.Repts.Med.Chem.24243-252。
如果兩個多肽的氨基酸殘基序列在最大相關比對時相同，它們被稱為“相同”的多肽。
“序列同一性百分比”是通過在對比窗口中對比兩個最優(yōu)比對的序列而判斷，其中在兩個序列間進行最優(yōu)比對時，對比窗口中的多核苷酸或氨基酸序列部分通過與參考序列(不包括添加或刪除)比較有無添加或刪除(即空位)。百分比的計算是用兩個序列中相同核苷酸堿基或氨基酸殘基的位點數得到匹配位點數，用匹配位點數除以對比窗口中全部的位點數再乘以100，既是序列同一性百分比。
對于氨基酸或核苷酸序列所使用的術語“基本上相同”，一般指序列至少有60％相同。優(yōu)選的多肽或多核苷酸的同一性百分比可以是60％至100％間的任何整數。更優(yōu)選的實施方案包括至少80％、85％、90％、95％或99％?！盎旧舷嗨频摹倍嚯陌陨咸峒暗男蛄?，除了不相同的殘基位點可以因為保守的氨基酸變化而不同。“保守的氨基酸替代物”是指有相似側鏈殘基的可交換性。例如，含脂肪側鏈的氨基酸組是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；含脂肪-羥基側鏈的氨基酸組是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側鏈的氨基酸組是天冬酰胺和谷氨酰胺；含芳香側鏈的氨基酸組是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。含堿性側鏈的氨基酸組是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側鏈的氨基酸組是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸替代物組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、天冬氨酸-谷氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
最佳的序列比對可以使用Smith和Waterman(1981)Add.APL.Math.2482的局部同一性運算法則，Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443的同一性比對運算法則，Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)852444的相似性搜索方法，計算機實現的這些運算法則(GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA和TFASTA，Wisconsin Genetics，Genetics Compute Group(GCG)，575 ScienceDr.，Madison，WI)或檢查。
適用于確定序列相同和相似百分比的優(yōu)選運算法則是BLAST和BLAST2.0，該運算法則分別見Altschul等(1977)Nuc.Acids.Res.253389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410。BLAST和BLAST2.0同此處描述的參數一起使用，確定本發(fā)明核苷酸序列和氨基酸序列同一性百分比。運行BLAST分析的軟件可以從國家生物技術信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。對于氨基酸序列使用評分矩陣計算累積分值。字命中在各方向的延伸在遇到以下情況時中斷累積比對分值從最大獲得值中降低了量X；由于累積一個或更多的得分為負值的殘基比對，累積分值達到0或0以下；或達到任一序列的末端。BLAST運算法則的參數W、T和X決定了運算的敏感性和速度。對于氨基酸序列，BLASTP程序默認字長為3，期望值(E)為10，和BLOSUM62評分矩陣(見Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915)比對(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4和兩鏈的對比。
短語“分離的”指基本上或本質上沒有其天然狀態(tài)下通常與之伴隨的成分的物質。
此處使用的術語“免疫優(yōu)勢”或“免疫優(yōu)勢肽”是指作為免疫反應主要靶位的肽或肽表位。代表性的免疫優(yōu)勢肽是較其它存在的表位召集更大量的抗體并與抗體有更高的親和力的表位。這些位點的識別因被靶定為對抗自身免疫性疾病的靶位而重要。免疫優(yōu)勢是復合抗原(或表位內某些殘基)中某些表位的特征，這使得它們在免疫原性或抗原性上非常關鍵。
此處使用的術語“分離的MHC成分”是指MHC糖蛋白或MHC糖蛋白的有效部分(即包括抗原結合的一個或多個位點和被恰當的T細胞受體識別所必須的序列)，它們不處在天然狀態(tài)，例如，與正常表達MHC的細胞的細胞膜無關。如下面的詳細描述，MHC成分可以重組產生，由適當的細胞源溶解產生或與脂質體相關。對于人類MHC分子，特別優(yōu)選人類淋巴母細胞。
術語“重組的”用于例如，細胞、核酸、蛋白或載體時，指該細胞、核酸、蛋白或載體已被異源核酸或蛋白的引入或天然核酸或蛋白的改變而修飾，或該細胞來源于如此修飾過的細胞。因此，例如，重組細胞表達天然(非重組)形式細胞沒有的基因，或使天然基因表達異常，低表達或根本不表達。
術語“異源的”用于指核酸的部分時，是指該核酸包含天然狀態(tài)中互相不處于相同關系中的兩個或更多亞序列。例如，該核酸一般是重組產生，具有來源于無關基因的兩個或更多序列，它們的排列產生一個新的功能性核酸，比如一種來源的啟動子和另一來源的編碼區(qū)。相似的是，異源蛋白是指天包含然狀態(tài)中互相不處于相同關系中的兩個或更多亞序列的蛋白(例如融合蛋白)。
術語“可操作性連接”是指核酸表達控制序列(例如啟動子、或轉錄因子結合位點的排列)和另一核酸序列之間的功能性連接，其中表達控制序列指導對應于第二個序列的核酸的轉錄。III.MHC成分編碼MHC的糖蛋白在人類和鼠系統(tǒng)中已被深入研究。MHC基因復合物在小鼠被稱為H-2復合物，在人類被稱為HLA復合物。MHC糖蛋白被分為I類糖蛋白，發(fā)現于所有細胞表面，主要被細胞毒性T細胞識別；II類糖蛋白，發(fā)現于包括例如巨噬細胞等輔助細胞的一些細胞表面，參與向輔助T細胞呈遞抗原。一些組織相容性蛋白已被分離并鑒定。對于MHC糖蛋白結構和功能的概括性綜述見Paul，FundamentalImmunology，2nd Ed.，Ravens Pres s N.Y.(1989)和Albert等，Molecular Biology of the Cell，2nd Ed.，Garland Publishing，Inc.，N.Y.& London(1989)。
本發(fā)明中MHCII類分子尤為有用。由伸展出細胞膜雙層的兩個II類鏈的N-末端結構域部分構成一個II類MHC分子。一條鏈的N-末端部分的兩個結構域與MHCI類抗原序列的α1和α2區(qū)同源。MHCII類分子的抗原結合袋由α1和β1結構域組成。II類分子兩端的結合袋開放所以能容納長的肽。HLA-DR1的三維結構已有描述(Brown等(1993)Nature 36433)。II類基因的克隆允許II類MHC結合結構域進行以下所述的操作。
本發(fā)明復合物的MHC糖蛋白部分可通過從淋巴細胞分離并篩選其結合所需肽抗原的能力而獲得。淋巴細胞來源于用復合物處理的個體物種。例如，它們可以從患目標自身免疫性疾病個體的人B細胞中分離，該細胞通過用本領域已知技術轉染復制缺陷的Epstein-Barr病毒而永生。
純化II類組織相容性蛋白的方法是本領域所熟知的?？梢允褂貌煌募夹g從多種細胞中分離得到。例如，該糖蛋白在蛋白酶處理、3MKCL處理或去污劑處理后溶解。優(yōu)選的方法是用去污劑從淋巴細胞抽提II類蛋白后，再進行親和層析(見例如，Turkewitz等，(1983)MolecularImmunology 201139-1147。不同的方法已被開發(fā)用于生產不呈遞內源性抗原的所需MHCII類組織相容性異源二聚體(Stern和Wiley(1992)Cell 68465-77；Ljunggren等(1990)Nature 346476-80；和Schumacher等(1990)Cell 62563-67)。
做為選擇，MHC成分也可使用本領域技術人員熟知的技術重組表達。一些II類蛋白的每個氨基酸序列已獲知，其基因或cDNAs也已克隆。因此，這些核酸可被用于表達MHC多肽。如果不能獲得所需的MHC基因或cDNA，可使用本領域技術人員熟知的克隆方法分離基因?？杀皇褂玫姆椒ㄊ羌兓鐼HC多肽，獲得部分氨基酸序列，根據該氨基酸序列合成核苷酸探針，使用該探針識別具有來自于cDNA或基因組文庫的所需基因的克隆?？梢詫⒔囟毯腿L的核酸與指導所需宿主中基因表達的信號進行可操作性連接，從而用克隆的編碼MHC多肽的核苷酸序列表達MHC多肽?？蛇x用許多適當的和本領域技術人員熟知的宿主。
然后可以使用本領域技術人員熟知的方法使MHC多肽在細胞內表達或通過細胞分泌。
用于轉染宿主細胞的核苷酸序列可根據標準方法修飾，而產生具有多種所需特性的MHC多肽。許多技術都是本領域技術人員熟知的。例如，MHC多肽可通過氨基酸插入、取代、缺失等改變天然存在序列的一級結構水平。也可使用蛋白融合技術給予MHC多肽新的活性或新活性的組合?？梢岳眠@些修飾方法的一些組合產生最終經修飾的MHC多肽。
可以根據多種所需目的制備氨基酸序列變體，包括重組多肽的簡易純化和制備。修飾后的多肽可有效的使用于調整治療半衰期、提高療效和減少治療時副作用的嚴重性或發(fā)生。氨基酸序列變體通常為天然不存在的預定變體，但它們顯示與天然序列MHC同樣的肽結合和T細胞結合能力。例如，可以產生包括僅僅一部分(通常至少約60-80％，代表性的是90-95％)一級結構的多肽片段。在某些實施方案中，MHC多肽基本上由來源于全長多肽的α1或β1結構域組成。這些片段代表性地包括約50-100個氨基酸，優(yōu)選約60-90個，更優(yōu)選約70-80個。另外，可以選用合成法制備多肽(見，例如，Merrifield(1986)Science 232341-347；Atherton等，Solid Phase PeptideSynthesisA Practical Approach，IRL Press，Oxford)?？梢允褂冒被岱治龌驕y序(例如，the Edman degradation procedure；見，例如，Creighton Proteins，Structures and MolecularPrinciples，Freeman and Co.，New York NY(1983)或者使用其它本領域技術人員熟知的適當的方法證實合成肽的組成。
一般來說，編碼MHC多肽的序列的修飾可通過多種熟知的技術，例如定點誘變(見，Gillman和Smith(1979)Gene 881-97；和Roberts等(1987)Nature 328731-734)而容易地完成。可以通適當的分析方法中的常規(guī)篩選對大多數修飾進行所需特征的評估。例如，使用以下描述的分析方法可以輕易評估多種修飾對多肽結合肽或影響T細胞增殖的能力的影響。其它特性的修飾，例如氧化還原作用或熱穩(wěn)定性、疏水性、蛋白質水解易受性或聚集傾向，都可根據標準技術分析。
某些應用中，修飾了MHC cDNA編碼序列，使之缺失跨膜結構域并表達得到的可溶MHC多肽。例如可以使用寡核苷酸指導的缺失誘變或聚合酶鏈反應截短MHC cDNA。寡核苷酸指導的體外突變可見Kunkel等(1987)Meth.Enzymol.154367-382(亦見，Ausubel等，supra)。IV.肽可以認為，抗原呈遞細胞(APCS)表面的MHC糖蛋白呈遞抗原發(fā)生在抗原蛋白水解成小的肽單位之后。認為這些片段長度為8-18個殘基，包括限制位(由MHC分子識別)和表位(由輔助性T細胞上的T細胞受體識別)。表位自身是識別輔助性T細胞的抗原特異受體的連續(xù)的或非連續(xù)的5-6個氨基酸的序列。限制位是負責聯(lián)系肽和MHC糖蛋白的連續(xù)或非連續(xù)的序列。
例如，可以通過篩選與HLA-DR2和HLA-DR3結合的一組重疊的AChR肽，而識別MG中重要的肽?？梢允褂帽绢I域技術人員熟知的多種結合分析檢測肽與MHC復合物的結合親和力。適當結合分析的實例是基于銪的競爭性結合分析(見，例如，Tompkins等，J.Immunol.Methods 163209-216)。而且，本發(fā)明的肽誘導T細胞反應的能力可以使用多種以下描述的本領域技術人員熟知的標準方法測定。
典型地，本發(fā)明的肽將包含對應于AChR的氨基酸序列，或與其基本相同或相似的氨基酸序列。本發(fā)明的肽可以使用本領域技術人員熟知的技術從天然來源分離、合成或重組表達。
具有所需活性的肽為了提供某些需要的特性而必須加以修飾，所述特性例如，在提高或至少基本保持未修飾肽結合所需MHC分子和誘導適當T細胞的無反應性的所有生物學活性同時，改進藥理學特性。例如，肽可以有多種變化，例如保守或非保守的取代，這些變化在使用時提供某些優(yōu)勢，例如改進MHC的結合。單氨基酸取代的效應也可使用D-氨基酸探測。這些修飾可以使用已熟知的肽合成過程達到，描述見，例如，Merrifield(1986)Science 232341-347；Barany和Merrifield，The Peptides，Gross and Meienhofer，eds.(N.Y.，Academic Press)，pp.1-284(1979)；及Stewart和Young，SolidPhase Peptide Synthesis，(Rockford，I11.，Pierce)，2nd Ed.(1984)。
通過延伸或減少肽氨基酸序列，例如，通過添加或刪除氨基酸修飾肽。本發(fā)明的肽也可通過改變某些殘基的順序或組成而修飾，容易理解，在不對生物學活性產生不良影響的條件下，一般不應改變那些生物學活性關鍵的氨基酸殘基，例如，關鍵的接觸位點或保守殘基。非關鍵的氨基酸不限定于天然存在于蛋白中的氨基酸，例如L-α-氨基酸或它們的D-異構體；而是也包括非天然氨基酸，例如β-γ-δ-氨基酸和許多L-α-氨基酸的衍生物。
典型地，一系列具有單氨基酸取代的肽被用于檢測靜電、疏水性對結合等的作用。例如，在沿著肽長度的一系列正電荷(例如，Lys或Arg)或負電荷(例如Glu)氨基酸的取代，揭示了對于各種MHC分子和T細胞受體的不同敏感性模式。而且，可以使用具有小的，相對中性的部分，例如，Ala、Gly、Pro或可利用的相似殘基的多個取代。取代可為同寡聚物或異寡聚物。取代或添加殘基的數量和類型依賴于基本接觸位點和某些進行探詢的功能特性(例如，親水性與疏水性)間的必須空間。這種取代較其母肽可以提高MHC分子或T細胞受體的結合親和力。在任何情況下，這種取代應使用經選擇的氨基酸殘基或其它分子片段，以避免例如可能破壞結合的空間或電荷干擾。
代表性的氨基酸取代是單殘基的取代。取代、刪除、插入或它們的任何組合都可用于構建目的肽。取代變體是指肽的至少一個殘基被移除，并且該位點插入了不同的殘基。當需要精確調節(jié)太的特征時，一般根據以下表1進行取代。
表1原始殘基示例性的取代丙氨酸 絲氨酸精氨酸 賴氨酸；組氨酸天冬酰胺 谷氨酰胺天冬氨酸 谷氨酸半胱氨酸 絲氨酸谷氨酰胺 天冬酰胺谷氨酸 天冬氨酸甘氨酸 脯氨酸組氨酸 賴氨酸；精氨酸異亮氨酸 亮氨酸；纈氨酸亮氨酸 異亮氨酸；纈氨酸賴氨酸 精氨酸；組氨酸甲硫氨酸 亮氨酸；異亮氨酸苯丙氨酸 酪氨酸；色氨酸絲氨酸 蘇氨酸蘇氨酸 絲氨酸色氨酸 酪氨酸；苯丙氨酸酪氨酸 色氨酸；苯丙氨酸纈氨酸 異亮氨酸；亮氨酸功能上的大量改變(例如，對于MHC分子或T細胞受體的親和)由選擇較表1低保守的取代產生，即選擇對維持(a)取代區(qū)域的肽主鏈結構，例如折疊或螺旋構象，(b)靶位點分子的電荷或疏水性或(c)側鏈的大小的作用更顯著不同的殘基。一般期望產生肽特性最大改變的取代是(a)用親水性殘基，例如絲氨酸，取代疏水性殘基，例如，亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸或丙氨酸，或前者被后者取代；(b)用具有正電性側鏈的殘基，例如，賴氨酸、精氨酸或組氨酸，取代負電性殘基，例如，谷氨酸或天門冬氨酸；或前者被后者取代；或(c)用具有大側鏈的殘基，例如，苯丙氨酸，取代不具有側鏈的氨基酸，如谷氨酸，或前者被后者取代。
該肽也可包括免疫原性肽上的兩個或多個殘基的同型空間配位體。此處同型空間配位體的含義是兩個或更多殘基的一個序列可以取代另一序列，因為第個序列的空間構象適合于第二個序列的特異結合位點。該術語特別包括本領域技術人員熟知的肽主鏈的修飾。這種修飾包括酰胺氮、α-碳、酰胺羰基的修飾、酰胺鍵的完全取代、伸展、刪除或主鏈交聯(lián)(一般見，Spatola，Chemistry and Biochemistry ofAmino Acids，Peptides and Proteins，Vol.VII(WeinsteinEd.，1983))。
而且，可以通過與其它分子的鍵而修飾肽。例如，可以引入不同的N-或C-端基對分子的物理和/或化學特性進行改變。這些改變可以用于影響，例如，分子的粘附、穩(wěn)定性、生物可利用度、定位或檢測。對于診斷的目的，多種標記可以和末端連接，直接或間接提供可檢測信號。因此，本發(fā)明肽可以根據最終目的，使用多種方法進行修飾而仍舊保持生物活性。
因此，除了直接來源于AChR氨基酸序列的肽，這些序列的一些構象類似物也可使用。在此使用的“構象類似物”是空間或兩極組織與結合于MHC成分的AChR氨基酸序列十分相似的分子。本發(fā)明的構象類似物可以完全由發(fā)現于AChR序列以外的氨基酸殘基構成。V.復合物的形成本發(fā)明的可溶性MHC異源二聚體肽復合物可以用作治療性阻斷特定T細胞和抗原呈遞細胞結合的拮抗劑。而且，該分子可以誘導目標T細胞的無細胞免疫反應性或增生無反應性。
該復合物的元件可以使用本領域的標準方法結合。例如，混合兩種組分，抗原肽可以與MHC蛋白的抗原結合位點非共價結合。使用任何一種標準程序，例如超濾或透析可以除去過量的肽。使用標準程序，例如，光親和標記(見，例如，Hall(1985)Biochemistry 245702-5711；Leuscher(1990)J.Biol.Chem.26511177-11184；Wraith(1989)Cell 59247-255)或其它任何適當的鍵方式(見，例如，Husain(1995)Biochem.Mol.Biol.Int.36669-677；Traut(1995)Biochem.Cell Biol.73949-958；Haselgrubler(1995)Bioconjug.Chem.6242-248；和Carroll(1994)Bioconjug.Chem.5248-256)它們也可以與抗原結合袋共價結合。
另外，II類肽復合物可以設計為一個連續(xù)的重組多肽(見，例如，PCT公開WO96/40944，1996年12月19日；WO96/40194，1996年12月19日；和WO97/04360，1997年11月6日)。定位于期望的自身免疫性疾病(例如，重癥肌無力)的可溶性融合MHC異二聚體肽分子含有與該自身免疫性疾病相關的抗原肽(例如，AChR肽)，該抗原肽恰當位于NHC分子的結合溝，而不需溶解MHC或外源性加載獨立制造的肽。在該復合物中，MHC成分和抗原肽永久連接成單鏈構象。這些復合物消除無效和非特異肽加載。通過重組法生產要求保護的MHC肽復合物可以產生特異和高產的蛋白，終產品僅包括所選擇的適當構象的MHC肽復合物。
使用已知每個氨基酸的密碼子可以合成編碼肽的寡核苷酸。優(yōu)選使用那些在用于表達的生物體中優(yōu)選利用的密碼子設計寡核苷酸。本領域已獲知多種生物體和細胞類型的密碼子優(yōu)選利用。利用本領域已知的技術，適當的序列可以摻入編碼來源于MHC成分的肽的序列。摻入位點使得當分子表達和折疊時，AChR肽抗原結合將與MHC成分的抗原結合位點結合，并且作為目標T細胞的一個表位。
例如，使用標準重組DNA技術，此處公開的AChR肽可以與源于MG相關MHC抗原的多肽的N-端抗原結合位點相連接。如果該重組復合物使用于小鼠，則AChR肽可以摻入應編碼I-Ab-α或I-Ab-β鏈的序列。如果AChR肽將被摻入β鏈，寡核苷酸作為前導肽的取代物插入。本領域已知替代多核苷酸中序列的方法。
可以使用相似的方案把AChR肽摻入編碼源于適當的人類HLA抗原的肽的序列。例如，人類單倍型DR2W2與MG相關。因此，AChR肽可被摻入編碼DR2等位基因β-鏈的序列。已知DR亞區(qū)中負責主要血清學特異性的結構基礎DR1-9，來源于多種DR單倍型的編碼HLA-DR-β鏈的序列也是已知的(見，例如，Bell等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA846234-6238)。
自身免疫抗原肽和MHC成分可以通過肽鍵鏈接。然而，對本領域技術人員還有其它顯而易見的鍵方式，包括，例如，通過糖蛋白的糖基團連接，包括，例如，α-和/或β-鏈的糖成分。
評定可溶性融合MHC異二聚體肽復合物的物理和生物學特性有多種方法。本領域常規(guī)使用例如電噴射和矩陣輔助激光解吸附(Matrix-Assisted Laser Desorption)/Flight質譜離子化時間(Ionization Time Of Flight mass spectrometry)(MALDI TOF)分析法，提供分子量等信息和證實二硫鍵構象。使用FACs分析檢測單鏈復合物適當折疊。一些標準分析法，例如酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)可用于進一步檢測可溶性融合MHC的濃度和證實正確折疊(見，例如，WO96/40944)。VI.檢測本發(fā)明肽和復合物誘導的T細胞反應本發(fā)明的肽和AChRMHCII類分子可以使用本領域熟知的多種體外模型進行分析。
僅MHCII類肽與TCR結合不足以激活CD4+T細胞。需要額外的“共刺激”信號。本發(fā)明MHCII類肽復合物與TCR的相互作用缺少共刺激信號。因此，也誘導抗原特異的T細胞的無反應性(Boussiotis(1994)Curr.Opin.Immunol.6797-807；Park(1997)Eur.J.Immunol.271082-1090)。該“耐受”或“無細胞免疫反應性”免疫抑制和再激發(fā)無反應性可由T細胞克隆無細胞免疫反應性、免疫抑制細胞因子誘導的無反應性實現(Schwartz(1989)Cell 571073-1081；Quill(1987)J.Immunol.1383704-3712)。通過監(jiān)測細胞增殖、細胞代謝、細胞因子或淋巴因子分泌或任何形式的細胞活化來檢測免疫抑制或再激發(fā)無反應性(即耐受，無細胞免疫反應性)的程度。
本發(fā)明的肽誘導的T細胞反應可以同樣使用上述方法檢測。
T細胞活化可以使用本領域熟知的多種方法檢測。例如，通過檢測3H-胸苷攝入或3-(4，5-二甲基-噻唑-2-7’)-2，5二苯基溴化四唑鎓攝入而分析T細胞增生(見，例如，Liu(1997)J.Neurochem.69581-593)。另外，由于T細胞在激活時合成并分泌細胞因子，MHCII類肽復合物的免疫抑制效應和由本發(fā)明的肽誘導的T細胞反應可通過檢測細胞因子轉錄、翻譯或分泌而評估。因此，可以定量各種細胞因子和淋巴因子，例如，白細胞介素、干擾素(INFs)(例如，gamma INF)、腫瘤壞死因子(TNFs)(例如，TNFβ)等。檢測細胞因子和淋巴因子產生和/或分泌的方法是本領域熟知的，包括但不限于免疫測定，例如酶聯(lián)免疫測定(ELISA)。
其它可使用的測定方法包括ELISPOT測定法。ELISPOT測定法是ELISA方法的改進，可以檢測反應于抗原刺激的個體T細胞的淋巴因子分泌(Czerkinsky等，(1998)J.Immunol.Methods 11029-36)。該方法在濾紙(例如，硝酸纖維素或PVDF濾紙)上平鋪捕獲特定淋巴因子的單克隆抗體并在微孔中加入外周血單核細胞(PBMCs)+抗原。T細胞在刺激時分泌的淋巴因子被平鋪的抗淋巴因子抗體局部捕獲。捕獲期(一般24小時)結束時沖洗掉細胞并檢測分泌的淋巴因子。使用本發(fā)明的ELISPOT測定法可以測量不同淋巴因子的分泌，包括，IL-2，IL-4等。分泌的淋巴因子可以使用例如，二級抗淋巴因子抗體檢測。該二級抗淋巴因子抗體可以被標記或直接或間接與標記或容易檢測到的酶(例如，堿性磷酸酶)偶聯(lián)。本領域的技術人員可以獲知并得到本發(fā)明內容中可以使用的各種標記物和酶。在被刺激T細胞分泌淋巴因子的部位出現班點。該技術較ELISA法更敏感，并被許多研究小組應用于MG患者T細胞反應性的研究(見，例如，Link等(1991)J.Clin.Invest.872191-2196；Sun等，(1992)Eur.J.Immnuol.21553-1559；Yi等(1994)J.Neuroimmunol.50177-186；Newsom-Davis等(1989)J.Autoimmun.2101-108；Ahlberg等(1992)J.Immunol.36435-442；Link等(1992)J.Immunol.36405-414)。
ELISPOT測定法的一種改進方法稱為克隆擴充ELISA斑(或CEE-SPOT)測定法，也可在本發(fā)明內容中使用。CEE-SPOT測定法中，在合適的時間(例如，7天)中用抗原刺激PBMCs，以便在再刺激和淋巴因子捕獲之前(例如，第10天)促進抗原特異性T細胞增殖。這種反應性T細胞的克隆擴充明顯地提高了測定敏感性。使用這種測定可以測量產生的淋巴因子，包括，如IL-2，IL-4等。一般說來，淋巴因子在濾紙上被捕獲，優(yōu)選PVDF濾紙，以改進班點的本底和強度。一般使用攝象機成像和計算機分析進行斑點計數。該測定類型也可先使用完整蛋白刺激T細胞，再用來源于蛋白的肽刺激，以便識別來源于天然加工的表位。
已經觀察到，延長用可溶性MHCII類肽復合物孵育靜止T細胞的時間導致T細胞凋亡，所以亦可監(jiān)測細胞死亡(Arimilli(1996)Immunol.Cell Biol.7496-104)。細胞死亡可以通過多種已知的方法檢測，例如，染料排斥通透性。凋亡的評估可以使用，例如，細胞DNA斷裂、觀察(用推進電子顯微鏡)、凋亡相關蛋白例如bc1-2等的檢測和定量等(見，例如，Arimilli(1996)supra)。
本發(fā)明的可溶性MHC異二聚體肽復合物也可使用一些自身免疫反應動物模型進行體內檢測，特別是實驗性過敏性重癥肌無力模型。VII.本發(fā)明藥物組合物的制劑和給藥如果包括MHC亞基的跨膜區(qū)，本發(fā)明的組合物在摻入脂單層或雙層后可便利的給藥。為此目的一般使用脂質體，但也可使用任何形式的脂膜，例如細胞(例如，紅細胞)的細胞膜或平面脂膜。該組合物也可便利地摻入微膠粒(micelle)中。
使用以下描述的標準方法制備脂質體。然而，如果去除跨膜區(qū)，該組合物可以以一種用于含肽藥物的方式便利地給藥。
給藥是全身的，并在注射后起效，優(yōu)選為靜脈注射，因此可以使用與注射給藥途徑相容的制劑。適當的制劑見于Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Philadelphia，PA，17th ed.(1985)?？梢灾苽涠喾N包括本發(fā)明復合物的和藥物學有效載體的組合物。該藥物組合物適于多種藥物遞送系統(tǒng)。本藥物遞送方法簡要綜述于Langer(1990)Science 2491527-1533。
制備本發(fā)明的藥物組合物時，經常需要修飾本發(fā)明的復合物，以改變它們的藥代動力學特性和生物分布。藥代動力學一般的討論見Remington’s Pharmaceutical Science，Supra，Chapters 37-39。本領域的任何普通技術人員都知道改變藥代動力學和生物分布的多種方法(見，例如，Langer，Supar)。例如，增加復合物血清半衰期的方法包括去除參與將該化合物從血流中清除的糖類的處理。優(yōu)選地，基本上所有的糖部分通過處理被去除。如果至少約75％，優(yōu)選約90％，最優(yōu)選約99％的糖部分被去除，則認為基本上所有的糖部分通過處理被去除。與蛋白、多糖或如聚乙二醇的合成聚合物等可溶性大分子的偶聯(lián)同樣起效。其它方法包括保護小泡內的復合物，所述復合物由蛋白、脂類(例如脂質體)、糖或合成聚合物組成。
本領域技術人員熟知的常規(guī)表面活性劑可以在本發(fā)明中使用。適當的表面活性劑包括，月桂酸鈉、油酸鈉、月桂基硫酸鈉、辛氧基乙二醇單十二烷基醚、octoxyno19和PLURONIC F-127(WyandotteChemicals Corp.)。優(yōu)選的表面活性劑是與靜脈注射相容的非離子型聚氧乙烯和聚氧丙烯去污劑，例如TWEEN-80，PLURONIC F-68等。優(yōu)選的去污劑是十二烷基-β-麥芽糖。而且，如描述在脂質體生產中所使用的磷脂也可作為微膠粒形成。
由于本發(fā)明的MHC亞基包含親脂跨膜區(qū)和相對親水的細胞外結構域，在常規(guī)表面活性劑或磷脂和亞基的存在下形成混合的微膠粒。本發(fā)明的混合微膠粒可以包含任何亞基、磷脂和/或表面活性劑的組合。因此，微膠?？砂瑏喕腿ノ蹌?、亞基同磷脂和去污劑的組合，或亞基和磷脂。
對于包含本發(fā)明復合物的藥物組合物，劑量的變化應根據，例如，特定復合物、給藥方式、治療的不同疾病和其嚴重性、患者的總體健康和狀況以及處方醫(yī)生的判斷。鼠類的給藥劑量一般為約10μg至500μg。優(yōu)選的總體劑量為約50μg至300μg。例如，在疾病的治療過程中，三次25μg或100μg的劑量有效?？倓┝糠秶鸀榧s0.015至15μg/kg，優(yōu)選為約0.15至10μg/kg。
藥物組合物用于腸胃外、表面、口服或局部給藥，例如通過氣溶膠或經皮給藥，用于預防和/或治療性處理。藥物組合物根據給藥方式可以以各種單位劑型給藥。例如，適于口服給藥單位劑型包括粉劑、片劑、藥丸和膠囊。
藥物組合物優(yōu)選靜脈給藥。因此，本發(fā)明提供用于靜脈給藥的組合物，包含溶解或懸浮于可接受載體，優(yōu)選水性載體的復合物溶液?？梢允褂酶鞣N水性載體，例如，水、緩沖液、0.4％的鹽水等。例如，磷酸緩沖液(PBS)特別適于本發(fā)明可溶復合物的給藥。優(yōu)選的制劑是含0.02％TWEEN-80的PBS。這些組合物可以使用常規(guī)的已知技術滅菌或過濾滅菌。得到的水溶液可以被包裝進行使用，例如凍干，凍干制劑在給藥前應與無菌水溶液混合。該組合物可以包含藥學可接受的使之接近生理狀況的輔助物質，例如pH調節(jié)劑和緩沖劑、張力調節(jié)劑、潤濕劑等，例如，醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、去水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油酸鹽等。
復合物的濃度變化范圍較廣，即從最少約0.05重量％，通常為或至少約1重量％至10-30重量％，主要按照所選用的特定給藥方式根據液體體積，粘度等選擇。優(yōu)選的靜脈給藥濃度是PBS的約0.02-0.1％或更多。
對于固體組合物，可以使用常規(guī)的無毒固體載體，包括，例如藥用級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。對于口服給藥，藥學可接受的無毒組合物通過摻入任何常規(guī)使用的賦形劑，如以上列出的載體和一般為10-95％的活性成份而形成。
對于氣溶膠給藥，復合物優(yōu)選以極細的形式與表面活性劑和推進劑(propellant)一起給藥。表面活性劑當然必須無毒優(yōu)選為溶于推進劑。這些試劑的代表是包含6至22個碳原子的脂肪酸例如，己酸、辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、油硬酸和油酸與脂肪族多元醇或其環(huán)酐，例如，乙二醇、甘油、赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇、甘露醇、山梨糖醇、衍生于山梨糖醇的己糖醇酐的酯或部分酯，以及這些酯的聚氧乙烯和聚氧丙烯衍生物。混合酯，例如混合或天然甘油酯也可使用。表面活性劑可以構成組合物的0.1重量％至20重量％，優(yōu)選0.25％-5重量％。組合物的平衡一般是推進劑。液化的推進劑一般在環(huán)境條件下氣化，在壓力下濃縮。適當的液化推進劑是包含5個碳原子的低級烷，例如丁烷和丙烷；優(yōu)選氟化或氟氯化烷。上述物質的混合也可使用。生產氣溶膠時，用適當的推進劑填充裝備合適閥門的容器，容器中包含極細的化合物和表面活性劑。該成分因此在高壓下維持直到閥門打開時釋放。
包含該復合物的組合物可用于治療、預防或診斷應用。在治療應用方面，組合物以足夠治愈或至少部分緩解該疾病和并發(fā)癥癥狀的量給藥于已經患上述疾病的患者。足夠達到該效果的量被定義為“治療有效量”。該用途的有效量取決于疾病的嚴重性和患者的體重及一般狀況。如前面的討論，代表性的給藥量為約0.5mg/kg至約25mg/kg，優(yōu)選約3至15mg/kg。
在預防應用方面，將包含本發(fā)明復合物的組合物給藥于易患特定疾病或具有患特定疾病危險性的患者。該量被定義為“預防有效量”。此用途的精確給藥量仍依賴于患者的健康狀況和體重。該量一般在上述范圍內。
在診斷應用方面，將包含適當復合物或其混合物的組合物給藥于懷疑具有自身免疫性疾病狀態(tài)的患者，以便判斷與疾病相關的自身反應T細胞的存在。另外，也可監(jiān)測特定治療的效果。足夠達到該效果的量被定義為“診斷有效量”。該用途的精確給藥量依賴于患者的健康狀況等，一般在每劑0.01至1000mg，尤其是每個患者約10至100mg。
試劑盒也能應用于治療或診斷用途。因此，本發(fā)明的組合物可以以容器中凍干的形式提供。試劑盒中包含可能與標記或毒素偶聯(lián)的復合物，或非偶聯(lián)的復合物，以及Tris、磷酸鹽、碳酸鹽等緩沖液，穩(wěn)定劑，殺生物劑，血清白蛋白等的惰性蛋白和一套使用說明?；趶秃衔锏牧浚@些物質一般少于約5wt％，基于蛋白濃度，通常其總量至少占約0.001wt％。往往需要包含惰性補充劑或賦形劑，以稀釋活性成份，其中賦形劑可以占總組合物的約1-99wt％。在一種測定中使用了可以與復合物結合的抗體，它通常存在于獨立的管瓶中。按照本領域公知的技術可以將抗體與標記偶聯(lián)和配制。
本說明書引用的所有出版物和專利申請在此引入作為參考，正如每個出版物和專利申請都特別地和獨立地引入作為參考。
雖然前述的發(fā)明已經通過以清楚理解為目的的圖解和實施例進行了詳細描述，任何本領域普通技術人員都顯然容易理解根據本發(fā)明的教導可以進行某些改變和修飾，而不離開所附權利權利要求的精神或范圍。VI.實施例實施例1檢測對HLA-DR結合一組重疊AChR肽的IC50值通過解離增強的lenthanide免疫熒光測定(“DELFIA”)競爭結合測定，檢測一組68個重疊AChRα肽(具有7個氨基酸重疊的14聚體)對HLA-DR4的相對親和力。圖1說明在對HLA-DR2和HLA-DR3親和力的DELFIA測定中檢驗的重疊AChR肽的位置。顯示出了AChRα亞基序列，每個跨膜區(qū)(M1-M4)以有陰影的框表示。10倍稀釋(優(yōu)選1-100，000nM)的非標記AChRα肽與生物素化的髓磷脂堿性蛋白肽MBP84-102在pH5.5下共同孵育，檢測結合溶解HLA-DR2(DRB1*1501和DRB5*0101的混合物)或HLA-DR3(DRB1*0301和DRB3*0101的復合物)的IC50。IC50的檢測優(yōu)選使用銪-鏈霉抗生物素解離增強的lenthanide免疫熒光測定(DELFIA)，IC50的計算一般通過使用含軟件程序SOFTmaxPro的4參數擬合分析。圖2列出了結合HLA-DR2和HLA-DR3的每個AChR肽的IC50值。圖3的1/IC50圖顯示了這些肽的相對親和力。該圖說明了與HLA-DR1-4具有最高相對親和力的AChRα肽相對位置。與HLA-DR2具有高的相對親和力的肽包括AChRα7-22、113-126、204-217、310-327、419-437和421-434。
基于與噬菌體展示文庫的結合研究，合成肽及洗脫肽的測序，一些研究小組已經報道了與DRB1*1501和DRB5*0101結合的結合基序。與DR2顯示高親和力的肽片段被發(fā)現包含文獻引證的潛在的T細胞表位和共有DR2結合基序。圖4說明匹配這些提出的基序的與HLA-DR2具有高親和力的AChRα肽的可能排列。與HLA-DR3具有高親和力的肽少于與HLA-DR2具有高親和力的肽。顯示高親和力的肽包括7-22、36-49、145-163、195-212和400-413。DR3肽基序以n+3位幾乎普遍存在D殘基為特征，其中n是結合DR3袋1的錨定殘基。圖5說明匹配這些提出的基序的與DR3具有高親和力的AChRα肽的可能排列。圖6基于IC50≤10,000nM列出與DR2和DR3相關的候選免疫優(yōu)勢肽的總結。
而且，一組69個合成重疊AChRα肽(14個氨基酸中重疊7位)與HLA-DR4的相對親和力是使用溶解的DR4通過基于銪的競爭結合測定而檢測的。計算抑制已知DR4結合肽的50％的結合所要求的AChRα肽濃度。基于IC50值鑒別高親和力肽。
表2總結了從ELISPOT研究中選出的五個高親和力DR2結合肽的結果。這些肽和它們的IC50值都在表2中給出。表2結合HLA-DR2表現出低IC50值的AChRα肽片段。較低的IC50值說明對HLA-DR的較高結合親和力。
*IC50值絕對高于標準值實施例2AChR肽的T細胞反應性上述肽對患者和正常健康個體PBMCs的T細胞反應性通過改進的ELISPOT測定檢測。本研究包括從30位正常人和9位MG患者處得到的PBMCs。檢測T細胞活性時，上述肽與TT/PPD為陽性對照，培養(yǎng)基為陰性對照。簡言之，將PBMCs和抗原孵育7天，第8天進行抗原特異性克隆擴充。對每個抗原進行的抗原特異性細胞刺激特征通過檢測到的γ-IFN的分泌而測量，γ-IFN的分泌是使用一對抗-γIFN抗體檢測斑點數而檢測。每個抗原獲得的斑點數通過從培養(yǎng)基對照獲得的斑點數進行校準。對每個PBMC樣品和抗原都確立了定義為抗原的斑點數和培養(yǎng)基對照的斑點數的比值的反應指數。圖7和8分別給出了用于正常和患者PBMCs的反應指數對抗原的圖形。
對比患者和正常個體的分析結果，沒有發(fā)現T細胞對所檢測的5個AcHR表位反應性的明顯不同。如所期望的，一些MG患者顯示了對這些所檢測AcHR表位的反應性，但是其中并無顯示高反應性的患者。有趣的是，正常PBMCs也顯示了對這些自身抗原表位的反應性。這明顯表明，包括T細胞對特定抗原的反應性的一些其它因素，可能導致活躍疾病過程的起始。類似的研究也在多發(fā)性硬化和其它自身免疫性疾病中進行。
雖然在改項目中研究的患者數量比正常健康個體少的多，患者和正常健康個體中T細胞的任何初步反應趨勢的存在得到了檢測。對比了反應指數大于2的患者或正常健康個體的百分比。DR2+患者中反應趨勢的存在也同樣得到檢測。圖9和圖10給出該數據分析的結果。
如果忽略所有正常健康個體和患者的HLA型，對AcHR421-434、400-413和36-49肽有反應性的患者百分比大約是對這些肽有反應性的正常健康個體百分比的兩倍。這進一步說明這些肽可能是活躍疾病過程中的致病性T細胞表位。僅有DR2+患者的相似分析說明，除了AcHRα204-217的所有肽都可能是致病性T細胞表位。
因此，檢測的69條AcHRα肽中，5條顯示了與DR2的高結合親和力(見實施例1)，這5條中的4條顯示了與正常個體相比，對MG患者有偏倚的T細胞反應性。
根據前述的說明可以理解，盡管為了說明的目的在此描述了本發(fā)明的特定實施方案，可以在不離開本發(fā)明的精神和范圍的前提下進行各種修改。
權利要求
1.一種組合物，包含一種分離的AChR寡肽，該寡肽包含約12-20個氨基酸殘基，其中寡肽與一種選自以下組的肽具有基本相似的序列LVAKLFKDYSSVVRPVVEVTVGLQLIQLINTGHITWTPPAIFKSHFVMQRLPLYFIVNNWVRKFIDTIPNIMFFSIPNIMFFSTMKRPSREKQQLIQLINVDEVNQIMKLGTWTYDGSVVAINPESDDTPYLDITYHFVMQRLPL。
2.權利要求1的組合物，其中肽的序列選自LVAKLFKDYSSVVRPVVEVTVGLQLIQLINTGHITWTPPAIFKSHFVMQRLPLYFIVNNWVRKFIDTIPNIMFFSIPNIMFFSTMKRPSREKQQLIQLINVDEVNQIMKLGTWTYDGSVVAINPESDDTPYLDITYHFVMQRLPL。
3.權利要求1的組合物，其中的肽包含一種D-氨基酸或氨基酸模擬物。
4.權利要求1的組合物，其中的寡肽是一種免疫優(yōu)勢肽。
5.權利要求1的組合物，其中的肽與具有一種抗原結合位點的分離的MHCII類成分相結合，其中肽與抗原結合位點相結合。
6.權利要求5的組合物，其中MHC成分是一種HLA-DR2分子。
7.權利要求6的組合物，其中肽選自LVAKLFKDYSSVVRPVVEVTVGLQLIQLINTGHITWTPPAIFKSHFVMQRLPLYFIVNNWVRKFIDTIPNIMFFSIPNIMFFSTMKRPSREKQ。
8.權利要求5的組合物，其中MHC成分是一種HLA-DR3分子。
9.權利要求8的組合物，其中肽選自LVAKLFKDYSSVVRPVQLIQLINVDEVNQIMKLGTWTYDGSVVAINPESDDTPYLDITYKFVMQRLPL。
10.一種組合物，包含一種抗原肽和一種具有抗原結合位點的分離的MHC成分，其中抗原肽與抗原結合位點結合，并且其中的肽與一種選自以下組的肽具有基本相似的序列LVAKLFKDYSSVVRPVVEVTVGLQLIQLINTGHITWTPPAIFKSHFVMQRLPLYFIVNNWVRKFIDTIPNIMFFSIPNIMFFSTMKRPSREKQQLIQLINVDEVNQIMKLGTWTYDGSVVAINPESDDTPYLDITYHFVMQRLPL。
11.權利要求10的組合物，其中MHC成分是HLA-DR2。
12.權利要求11的組合物，其中肽選自LVAKLFKDYSSVVRPVVEVTVGLQLIQLINTGHITWTPPAIFKSHFVMQRLPLYFIVNNWVRKFIDTIPNIMFFSIPNIMFFSTMKRPSREKQ。
13.權利要求10的組合物，其中MHC成分是HLA-DR3。
14.權利要求13的組合物，其中肽選自LVAKLFKDYSSVVRPVQLIQLINVDEVNQIMKLGTWTYDGSVVAINPESDDTPYLDITYHFVMQRLPL。
15.一種藥物組合物，包含藥學可接受的載體和權利要求1的肽。
16.權利要求15的藥物組合物，其中肽與分離的MHCII類分子結合。
17.權利要求16的藥物組合物，其中MHC成分選自HLA-DR2和HLA-DR3。
18.一種治療患者的重癥肌無力的方法，包括給予患者權利要求15的藥物組合物。
19.一種治療患者的重癥肌無力的方法，包括給予患者權利要求16的藥物組合物。
20.一種治療患者的重癥肌無力的方法，包括給予患者權利要求17的藥物組合物。
21.一種誘導哺乳動物中靶T細胞的無反應性的方法，該方法包括給予哺乳動物一種治療有效量的藥物組合物，該藥物組合物包含一種抗原肽和一種具有抗原結合位點的分離的MHCII類成分，其中抗原肽與抗原結合位點結合，并且其中抗原肽與一種選自以下組的肽具有基本相似的序列LVAKLFKDYSSVVRPVVEVTVGLQLIQLINTGHITWTPPAIFKSHFVMQRLPLYFIVNNWVRKFITIPNIMFFSIPNIMFFSTMKRPSREKQQLIQLINVDEVNQIMKLGTWTYDGSVVAINPESDDTPYLDITYHFVMQRLPL。
22.權利要求21的方法，其中抗原肽的序列選自LVAKLFKDYSSVVRPVVEVTVGLQLIQLINTGHITWTPPAIFKSHFVMQRLPLYFIVNNWVRKFIDTIPNIMFFSIPNIMFFSTMKRPSREKQQLIQLINVDEVNQIMKLGTWTYDGSVVAINPESDDTPYLDITYHFVMQRLPL。
23.權利要求21的方法，其中MHC成分是HLA-DR2。
24.權利要求21的方法，其中MHC成分是HLA-DR3。
25.權利要求21的方法，其中藥物組合物經靜脈內給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及自身免疫性疾病，特別是重癥肌無力的治療。本發(fā)明提供來源于乙酰膽堿受體的新的自身免疫優(yōu)勢肽，并提供制備該肽的方法。本發(fā)明進一步提供包含這些與適當的主要組織相容性復合物(MHC)分子結合的肽的復合物及制備這些復合物的方法。本發(fā)明中的復合物可以用于重癥肌無力的治療和預防性處理。
文檔編號C07K19/00GK1432024SQ01810422
公開日2003年7月23日 申請日期2001年3月30日 優(yōu)先權日2000年3月31日
發(fā)明者S·德斯潘德, E·斯帕克, N·韋納, S·阿里米利 申請人:科里克薩公司