專利名稱：一種治療惡性實體瘤的中藥藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療惡性實體瘤的中藥藥物組合物，尤其涉及以傳統(tǒng)中藥苦參中所含有的苦參總生物堿為其藥物有效成分的中藥制劑，該藥物對惡性實體瘤的治療有明顯效果，本發(fā)明還提供了該藥物的一種制備方法。
惡性腫瘤是一類致死性常見惡性疾病，被稱為世界“第一號殺手”，人人“談癌色變”，由于目前尚無攻克癌癥的醫(yī)療手段，全世界每年死于癌癥的患者達800萬人，且死亡人數(shù)逐年遞增；據(jù)世界衛(wèi)生組織97年統(tǒng)計，世界癌癥患者逾8000萬人，每年約以5％的速度遞增。在我國，惡性腫瘤死亡率排在第一位，達135.39/10萬人，患病人群2800萬人，每年新增近300萬患者；北京市已達到每六人死亡，其中一例便是死于癌癥！根據(jù)《Scrcpp》1997年的統(tǒng)計，全世界腫瘤藥市場銷售額為每年180億美元，中國市場為110億人民幣，腫瘤藥銷售額增長幅度明顯高于其它類藥品。
雖然目前用于癌癥的藥物有很多，但大多數(shù)都是西藥(或稱化學(xué)藥品)，所以癌癥的藥物治療簡稱化學(xué)治療(化療)。但因為西藥的毒性太大，從植物中提取有效的抗癌藥物一直是受到廣泛重視的一個領(lǐng)域，比如紫杉醇、羥基喜樹堿、長春新堿系列等藥物，臨床上的療效已得到了充分的肯定。
我國傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，腫瘤的病機為“毒發(fā)五臟”、虛實兼夾的全身性疾病，治療上以扶正祛邪為主，通過活血化瘀、清熱解毒、扶本固正等方法使機體正氣充盈，邪不能侵，以達到治療目的?？鄥槲覈鴤鹘y(tǒng)中藥，經(jīng)過大量的藥理、藥效試驗發(fā)現(xiàn)，苦參提取物苦參總生物堿具有明顯的抗惡性實體瘤作用，能提高癌癥小鼠的遠期生存率，而且苦參總生物堿安全無毒，為一腫瘤細胞選擇性很強的新型抗腫瘤中藥良藥。
苦參為豆科植物苦參Sophora flavescens Ait的干燥根，又名水槐、苦識(《本經(jīng)》)，地槐、菟槐、驕槐、白莖、虎麻、岑莖、綠白、陵郎(《別錄》)，野槐(《綱目》)，好漢枝(《全國中草藥匯編》)。生于沙地或向陽山坡草叢中及溪溝邊。分布于全國各地。春、秋二季采挖，除去根頭及小支根，洗凈，干燥，或趁鮮切片，干燥。
本品味苦性寒，多用于清熱燥濕，殺蟲，利尿。用于熱痢，便血，黃疸尿閉，赤白帶下，陰腫陰癢，濕疹，濕瘡，皮膚瘙癢，疥癬麻風(fēng)，作為抗腫瘤新藥的開發(fā)，屬于發(fā)明創(chuàng)新，國內(nèi)外首創(chuàng)。
據(jù)文獻記載，苦參中含有多種生物堿類成分，另外還有黃酮類、酚性成分、糖及多糖、皂甙、氨基酸類等成分。其中，生物堿類成分是治療惡性實體瘤的主要成分。
苦參根中主要含生物堿苦參堿(matrine)，氧化苦參堿(oxymatrine)，N-氧化槐根堿(N-oxysophocarpine)、槐定堿(sophoridine)、右旋別苦參堿(-allomatrine)、右旋異苦參堿(isomatrine)、右旋槐花醇(sophoranol)、(+)槐花醇N-氧化物(sophoranol N-oxide)、左旋槐根堿(sophocarpine)、左旋槐胺堿(sophoramine)、右旋-N-甲基金雀花堿(N-methylcytisine)，左旋臭豆堿(anagyrine)贗靛葉堿(baptifoline)[1]。d-苦參醇堿(d-Sophoranole)，1-臭豆堿(1-anagyrine)，1-甲基金雀花堿(1-methylcytisine)、1-乙野靛葉堿((1-baptifoline)、1-乙基槐果堿(N-oxysophocarpine)、1-乙基槐明堿(1-ethysophoramine)、粉防己堿等。黃酮類化合物有苦參素(kurarinone)、異苦參素(isokurarinone)、去甲苦參素(norkurarinone)、次苦參素(kuraidin)、苦參醇素(kurarinol)、次苦參醇素(kuraridenol)、新苦參醇素(neokurarinol)、去甲脫水淫羊藿素(noranhydroiaritin)、異脫水淫羊藿素(isoaanhydroicaritin)、蛇麻素(xanthohumol)、異蛇麻素(isoxanthohumol)及三葉豆高麗槐甙(trifolirhizin，1-maackiain-β-D-glucoside)等[2]。
藥理研究表明，以苦參藥材提取精制的總生物堿，具有抑制腫瘤生長的活性，是治療腫瘤疾病的有效部位?？鄥⒖偵飰A不是一個簡單的化合物，而是包括苦參堿在內(nèi)的生物堿類混合物，我們對有效部位中的化學(xué)成分進行了分離鑒定，獲得了5種生物堿類成分。
其成分見下表。
表1 苦堿中的主要化學(xué)成分化合物 中文名 英文名1 氧化苦參堿oxymatrine2 苦參堿 matrine3 槐定堿 sophoridine4 氧化槐果堿 oxysophocarpine5 槐果堿 sophocarpine據(jù)藥典記載，苦參的提取物有清熱燥濕，殺蟲，利尿等作用。用于熱痢，便血，黃疸尿閉，赤白帶下，陰腫陰癢，濕疹，濕瘡，皮膚瘙瘁，疥癬麻風(fēng)，作為抗腫瘤新藥的開發(fā)，屬于發(fā)明創(chuàng)新，國內(nèi)外首創(chuàng)。在傳統(tǒng)的中醫(yī)療法中，只能是水煎后服用或外用，這種傳統(tǒng)方法一是難以最大程度發(fā)揮藥效，從另一方面講，中藥的服用不方便已是公知的。通過對中藥中有效成分的藥效研究，進而實現(xiàn)對該天然成分的提取和利用，制造出在藥效上等同甚至優(yōu)于合成藥，而在毒性上優(yōu)于化學(xué)合成藥的純中藥制劑，特別是純中藥注射針劑，這是對傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。
本發(fā)明的目的在于提供一種可治療實體腫瘤的中藥藥物組合物，其中的有效成分是來自中藥苦參提取物中的生物堿類類化合物，亦稱苦參總堿。
本發(fā)明進一步提供了以所述苦參總堿提取物為活性成分，用于治療實體腫瘤的純中藥藥物制劑和相應(yīng)的藥物劑型。
本發(fā)明的另一個目的在于提供用于治療實體腫瘤的該純中藥藥物的制備方法，特別是苦參總堿提取物的制備方法。
本發(fā)明提供的藥物組合物，其含有從苦參原料藥得到的水提取物，該苦參提取物的組成中包括了苦參總生物堿，其中的主要活性成分是苦參總生物堿，從藥效學(xué)角度出發(fā)，作為本發(fā)明用于治療實體腫瘤的藥物組合物，所述苦參提取物中的苦參總生物堿的含量在50％以上，最好不低于55％。
在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明還研究提出了二種治療惡性實體瘤的純中藥藥物制劑，該中藥藥物以上述苦參提取物為有效活性成分，并包括了藥劑學(xué)上可接受的輔料組分。
本發(fā)明的藥物制劑包括針劑和口服劑，其中口服劑包括膠囊劑、口服液、片劑、顆粒劑等，針劑，特別是注射用粉針劑則要求其有效成分中苦參總生物堿的含有量不低于80％，最好是不低于90％。
本發(fā)明還提供了該純中藥藥物制劑的二種制備方法，其包括以苦參為原料，用水提取，并經(jīng)純化分離制取苦參提取物，使該提取物中苦參總生物堿的含量在50％以上；以該苦參提取物為有效成分，按照藥劑學(xué)方法制備成要求的藥物制劑。
苦參應(yīng)在春、秋二季采挖，除去根頭及小支根，洗凈，干燥，或趁鮮切片，干燥。在用于提取前應(yīng)先粉碎，通常要求通過20-40目篩，以利于其中有效成分被充分提取。從生產(chǎn)角度考慮，本發(fā)明選用的苦參藥材中，包括了上述各種苦參總生物堿化合物的總生物堿含量應(yīng)該不低于2％。
根據(jù)本發(fā)明的比較優(yōu)選的實施方案，提取苦參堿提取物的方法包括如下步聚(1)用8倍體積的水提取粉碎后的苦參原料藥3次；(2)合并提取液，濃縮至相對密度為1.06～1.08；(3)將上述濃縮后的提取液加鹽酸調(diào)pH值至3～4，過濾。
(4)上清液過732型陽離子交換樹脂柱，用10倍體積水及6倍體積30％乙醇洗去部分雜質(zhì)。
(5)用1倍柱體積濃氨水堿化步驟(4)中洗過的樹脂后，用6倍體積30％乙醇洗脫。
(6)收集洗脫液，經(jīng)減壓濃縮，噴霧干燥，得苦參總生物堿。
附圖4工藝流程圖上述提取步驟中，苦參總生物堿的提取工藝路線有稀鹽酸滲漉法、乙醇滲漉法、乙醇回流法、稀鹽酸回流法、水煮法、水滲漉法等，為節(jié)約提取工藝成本，我們以轉(zhuǎn)移率為主要考察指標(biāo)，兼顧總堿含量，對不同的提取工藝路線進行了試驗研究，并采用正交試驗法對選定的提取工藝路線進行了技術(shù)條件的優(yōu)選。優(yōu)選結(jié)果表明，水煮法樣品含量及總生物堿重量均優(yōu)于0.5％鹽酸滲漉法，而且水煮法可以節(jié)約工時，減小成本，不腐蝕生產(chǎn)設(shè)備，故提取工藝路線選用水煮法。
苦參水提物中仍含有大量的雜質(zhì)，需進一步分離精制，苦參總生物堿的分離與純化方法較多，比如陽離子樹脂交換—氨水堿化—氯仿回流法、堿化后二氯甲烷提取法、堿化氯仿提取法、陽離子樹脂交換—氨水堿化-80％乙醇洗脫法、陽離子樹脂交換—氨水堿化—甲醇回流法、陽離子樹脂交換—稀碳酸鈉溶液循環(huán)洗脫法等，我們對溶劑法與樹脂法做了比較研究，認(rèn)為樹脂法具有操作簡便、設(shè)備簡單、收率高、總堿含量高、成本低的優(yōu)點，因此，我們考慮選用樹脂法對苦參總堿進行分離純化。
苦參水提物中含有大量的黃酮及水溶性較差的雜質(zhì)，故在提取液上離子交換柱之前要進行除雜。由于黃酮類成分在酸性條件下溶解性較差而苦參總生物堿易溶于酸水，所以采用酸水轉(zhuǎn)溶的方法除去大部分黃酮類成分。為了盡可能多地沉掉雜質(zhì)，通過考察不同的pH值對雜質(zhì)沉出情況的影響，我們確定采用每500ml(相當(dāng)于100g藥材)濃縮液加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3～4，以沉掉大部分雜質(zhì)。
通過實驗確定，用10倍體積水及6倍體積30％乙醇來洗脫雜質(zhì)，可以在保證生物堿不損失的情況下洗掉大部分雜質(zhì)。故選用10倍體積水與6倍體積30％乙醇同時洗脫雜質(zhì)。
在實際生產(chǎn)中要求盡可能地回收乙醇，將濃縮液的濃度控制到其相對密度D20℃為1.06～1.08來控制濃縮過程的完成。
對于陽離子交換樹脂的選擇，一般樹脂法多用732型強酸性陽離子樹脂，出于降低苦參生物堿與陽離子樹脂結(jié)合力，從而在解吸附時易于洗脫的目的，我們選用了724型弱酸性陽離子交換樹脂與732型強酸性陽離子交換樹脂，對其做了靜態(tài)及動態(tài)情況下的吸附量對比研究。從兩種方法測定的最大吸附量來看，724型吸附量太小，而且在處理樹脂的過程中發(fā)現(xiàn)其膨脹80％以上，占用層析柱的體積大，故選用732型陽離子交換樹脂用于苦參總堿的分離純化。同時確定732型強酸性陽離子交換樹脂對苦參總生物堿的最大吸附量為2.81g(總生物堿)/100ml樹脂。
為有利于有效成分的分離，濃縮后的提取液需要分散在適當(dāng)?shù)妮d體上，例如本發(fā)明的技術(shù)方案中是優(yōu)選使用了732型強酸性陽離子交換樹脂，但不排除其它可行的載體物質(zhì)，使?jié)饪s液里有效成分被732型強酸性陽離子交換樹脂所吸附，然后使用乙醇洗脫。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所用層析柱的規(guī)格和材質(zhì)無特別要求，可根據(jù)實際生產(chǎn)的需要選定，并按常規(guī)操作方法裝填，但裝柱量應(yīng)不少于柱高的2/3，最好選用直徑與柱高之比在大約1∶6～1∶8范圍內(nèi)的柱。然后將濃縮藥液加入樹脂柱中，使用乙醇洗脫時，洗脫速度優(yōu)選為約850-1500ml/分種。
收集的洗脫液在60℃以下減壓濃縮回收乙醇至流浸膏狀，優(yōu)選濃縮溫度50-60℃，此時真空度約在400-600Mpa，所述流浸膏狀，其1毫升相當(dāng)于約1-2克生藥量，或通過相對密度控制。經(jīng)進一步揮發(fā)溶劑，噴霧干燥，粉碎，即可得到所述苦參提取物粉末。
對于干燥條件，本發(fā)明也做了優(yōu)選方案的研究，試驗中苦參總堿的干燥條件如為減壓干燥，得到的多為棕色糖漿狀物，棕色膏狀物、暗褐色樹膠狀總堿，也有得到棕紅色粉末；在我們的多次試驗中，發(fā)現(xiàn)在70-100℃的真空干燥條件下，無法得到干燥疏松的粉末，為此，我們試驗了多種方法。從試驗結(jié)果看以噴霧干燥法得到的苦參總堿性狀明顯好于其他方法，因此確定苦參總堿的干燥條件為噴霧干燥。
根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，該中藥制劑劑型可以是注射針劑或口服制劑，其中口服制劑包括膠囊劑、口服液、片劑、顆粒劑等。在制備口服制劑時，選用的輔型劑可以是淀粉、糊精或環(huán)糊精、微粉硅膠、蔗糖、硬脂酸鎂等常規(guī)充填劑，制劑的后期制備工藝及設(shè)備均屬制藥領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，本發(fā)明對此不作限定，故在此不予詳述。
本發(fā)明優(yōu)選的劑型是注射劑，特別是注射用凍干粉針劑，可以按照制藥學(xué)常規(guī)方法精制處理提取物，將得到濃縮液噴霧干燥后按常規(guī)方法處理并添加輔料制成注射用凍干粉針劑。
本發(fā)明的創(chuàng)造性在于通過科學(xué)可行的方法從苦參中藥中提取分離出了苦參提取物，并進一步將該提取物作為有效成分制備成用于治療惡性腫瘤的疾病，特別是治療惡性實體瘤的中藥制劑。如前面所述，本發(fā)明提供的藥物的有效成分是包括苦參總生物堿的苦參提取物，為達到發(fā)明目的，對原料藥中苦參總生物堿的提取率應(yīng)在55％以上，同時該提取物中苦參堿的含量也應(yīng)不低于15％。
為保證藥物的質(zhì)量，在生產(chǎn)過程中需要對最終提取物中的有效成分含量隨時進行檢測。用于檢測所述生物堿類化合物的方法可以借助任何可行的檢測手段和公知的方法，本發(fā)明在此提出了一套可行的檢測方法。
首先，通過高效液相色譜分析，與苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品譜圖對照，證明了在總生物堿提取物中含有以苦參堿為主要成分的苦參生物堿混合物(從譜圖中計算主要成分的峰面積，苦參堿約占到30％左右)。從紫外吸收光譜中可看到，苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品和苦參提取物在209nm均有最大吸收峰，所以應(yīng)該認(rèn)為苦參提取物同苦參堿的紫外吸收圖譜基本相一致，據(jù)此本發(fā)明采用了紫外—可見光分光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線粗略檢測總堿的含量；同時，采用高效液相外標(biāo)法，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測和控制苦參提取物中的苦參堿含量，經(jīng)實際生產(chǎn)中使用證明，檢測結(jié)果的重現(xiàn)性好。應(yīng)該說明的是，該方法僅作為本發(fā)明產(chǎn)品的質(zhì)量控制手段之一，不應(yīng)排除其它任何可滿足要求的方法和操作。特別是總生物堿混合物的提取率含量測定對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是很容易實現(xiàn)的，也可以如上述以苦參堿為標(biāo)示通過對比提取物與原料物在209nm的吸光值得到總堿提取物中有效成分的提取率，而其中含有苦參堿的有效量則可通過HPLC外標(biāo)法測得。
附

圖1是苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC譜圖。
附圖2是本發(fā)明制備的苦參提取物的HPLC譜圖。
附圖3是所用檢測溶劑色譜圖提取物中苦參堿的HPLC測定HPLC條件流動相乙腈-水(磷酸調(diào)PH＝2.0)-乙醇(85∶8∶10)檢測波長209nm流速1ml/分鐘
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線精密稱取五氧化二磷干燥器中減壓干燥至恒重的苦參堿10.80mg，置10ml量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。精密吸取苦參堿對照品溶液0.08、0.24、0.40、0.56、0.72ml，分別置10ml量瓶中，甲醇定容至刻度，分別從中精密吸取10ul，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定。以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
回歸方程Y＝16287989X-7869決定系數(shù)r＝0.9999線性范圍10.8-54.0ug2、苦參提取物中苦參堿的測定對照品溶液的制備精密稱取五氧化二磷干燥器中減壓干燥至恒重的苦參堿10mg，置10ml量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。供試品溶液的制備 精密稱取五氧化二磷干燥器中減壓干燥至恒重的苦參總生物堿約50mg，置25ml量瓶中，甲醇超聲溶解并定容至刻度，搖勻，從中精密量取1.0ml，置10ml量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。測定法 精密吸取供試品溶液10ul，注入高效液相色譜儀，測定，即得。本品按干燥品計算含苦參堿(C15H24N2O)，不得少于15％。
為便于理解本發(fā)明組合物在治療惡性腫瘤疾病方面的藥用價值，發(fā)明人使用以上所述方法或?qū)嵤├哪z囊藥劑及注射針劑完成了以下藥理和藥效試驗一、急性毒性試驗用昆明種健康小鼠，采用口服和腹腔注射兩種給藥方式，測定用苦參總生物堿灌胃小鼠測定LD50為343.6±46.8mg/kg，95％可信限為299.9-393.6mg/kg，尸解臟器未見病變。用苦參總生物堿腹腔注射小鼠測定LD50為192.8±18.2mg/kg，95％可信限為175.4～211.8mg/kg，尸解未見臟器病變。
具體方法如下取昆明種小鼠50只，雌雄各半，體重18-22g，禁食12h，按體重分為5組，每組10只動物，雌雄各半。給藥容量0.2ml/10g，給藥后24h內(nèi)嚴(yán)密觀察動物反應(yīng)情況，連續(xù)觀察7d，記錄死亡只數(shù)，死亡動物及時尸檢，7d后存活動物斷頭處死，取心、肝、脾、肺、腎、腦、睪丸、卵巢稱重計算臟器系數(shù)，做病理組織學(xué)檢查。
二、長期毒性試驗●Wistar種大鼠口服苦參總生物堿長期毒性試驗用Wistar種大鼠180只，體重70-90克，雌雄各半，隨機分成4組(對照組及三個劑量組)，對照組和大劑量組50只，中劑量組和小劑量組40只，每組雌雄各半。試驗用藥為苦參提取物。
苦參總生物堿以小(20mg/kg)、中(40mg/kg)、大(80mg/kg)三個劑量分別給Wistar大鼠灌胃(ig)，對照組用等量生理鹽水灌胃，每天1次，每周6次，連續(xù)26周。除大劑量組的體重和攝食量在給藥后期出現(xiàn)降低之外，各給藥組的一般情況、攝食量、體重、尿常規(guī)分析、血液學(xué)指標(biāo)、血液生化指標(biāo)、臟器重量、臟器系數(shù)、系統(tǒng)尸解及病理組織學(xué)檢查，與對照組比較均無顯著性差異，未見明顯毒性反應(yīng)。停藥后4周的恢復(fù)期，各項檢測指標(biāo)均未見遲緩毒性，其中大劑量組的體重和攝食量也有明顯回升。
結(jié)果表明，Wistar種大鼠連續(xù)口服苦參總生物堿26周，未見有明顯的毒性反應(yīng)?！馚eagle犬口服苦參總生物堿長期毒性試驗Beagle犬口服苦參總生物堿三種劑量10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg，每天1次，每周6次，連續(xù)給藥26周。與對照組比較苦參總生物堿大劑量組動物的體重在給藥18-26周時，有所減低，但中、小劑量組體重未見顯著性差異。3個劑量組動物的一般情況、心電圖檢測、各項血液學(xué)及血清生化指標(biāo)、尿常規(guī)分析、系統(tǒng)尸解、臟器系數(shù)、病理組織學(xué)檢查，與對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義，未見明顯毒性反應(yīng)。停藥后4周的恢復(fù)期，觀察以上所有檢測指標(biāo)均未見遲緩毒性。
結(jié)果表明，Beagle犬連續(xù)口服苦參總生物堿26周，未見有明顯的毒性反應(yīng)。
三、一般藥效學(xué)試驗1.苦參總生物堿對S180實體瘤的影響本試驗采用小鼠右腋皮下接種(sc)S180實體瘤細胞懸液，造成S180實體瘤動物模型，觀察苦參總生物堿小(10mg/kg)、中(20mg/kg)、大(40mg/kg)三個劑量灌胃給藥(ig)對S180實體瘤的影響。
方法如下取生長良好無潰破的S180實體瘤瘤株，按常規(guī)方法在嚴(yán)格無菌條件下，從瘤株腹腔抽取乳白色濃稠癌性腹水混勻，加NS稀釋為1∶3的瘤組織懸液(外置冰塊)，消毒皮膚，混勻后于小鼠右腋sc0.2ml/只(含瘤細胞2×106)，24h后隨機分為模型對照(生理鹽水)、威麥寧(200mg/kg)、苦參總堿小(10mg/kg)、中(20mg/kg)、大(40mg/kg)三個劑量組，每組10只動物，共5組。各組ig給藥，1次/天，共7天。觀察腫瘤生長情況，破潰者剃除，于末次給藥后24h頸椎脫臼處死動物，稱體重，剝瘤，稱瘤重，計算腫瘤抑制率。
結(jié)果表明苦參總生物堿小、中、大三個劑量對S180實體瘤均有顯著抑瘤作用，三個劑量組對S180實體瘤的抑制率均在30％以上。
2.苦參總生物堿對H22肝癌實體瘤的影響本試驗采用小鼠右腋sc H22肝癌實體瘤細胞懸液，造成H22肝癌實體瘤動物模型，觀察苦參總生物堿小(10mg/kg)、中(20mg/kg)、大(40mg/kg)三個劑量ig對H22肝癌實體瘤的影響。
方法如下取8天生長旺盛的H22肝癌瘤株，按常規(guī)方法在嚴(yán)格無菌條件下，從2只瘤株腹腔抽取乳白色濃稠癌性腹水混勻，加NS稀釋為1∶3的瘤組織懸液(外置冰塊)，消毒皮膚，混勻后于小鼠右腋sc 0.2ml/只(含瘤細胞2×106)，24h后隨機分為模型對照(生理鹽水)、威麥寧(200mg/kg)、苦參總堿小(10mg/kg)、中(20mg/kg)、大(40mg/kg)三劑量組，共5組，每組10只動物。各組ig給藥，1次/天共7天。觀察腫瘤生長情況，破潰者剃除，于末次給藥后24h頸椎脫臼處死動物，稱體重，剝瘤，稱瘤重，計算腫瘤抑制率。
結(jié)果表明苦參總生物堿三劑量對H22肝癌實體瘤有明顯的抑制作用，三個劑量組的抑瘤率均大于30％。3.苦參總生物堿對艾氏腹水瘤的影響本實驗采用小鼠腹腔接種艾氏腹水瘤細胞懸液，造成艾氏腹水瘤動物模型，觀察苦參總生物堿小(10mg/kg)、中(20mg/kg)、大(40mg/kg)三個劑量ig對艾氏腹水瘤小鼠生存時間的影響。
方法如下取昆明種小鼠50只，在無菌操作下，從瘤株腹腔取出乳白色濃稠癌性腹水腹水，用生理鹽水按1∶3稀釋，消毒接種小鼠腹腔0.2ml/只(含瘤細胞1×107)，接種24h后，隨機分為模型對照(生理鹽水)，威麥寧(200mg/kg)、苦參總堿小(10mg/kg)、中(20mg/kg)和大(40mg/kg)劑量組，共5組，每組10只。各組均ig給藥，1次/天，連續(xù)7天，觀察每組小鼠的平均生存時間，計算生命延長率。
結(jié)果表明苦參總生物堿小、中、大三個劑量組對艾氏腹水瘤小鼠的生存時間明顯延長，苦參總生物堿小、中、大三個劑量組對小鼠生命延長率均大于50％，大劑量組大于70％。4.苦參總生物堿對Lewis肺癌的影響本實驗采用C57BL小鼠右腋sc Lewis肺癌瘤細胞懸液，造成Lewis肺癌動物模型，觀察苦參總生物堿小(10mg/kg)、中(20mg/kg)、大(40mg/kg)三個劑量ig對Lewis肺癌的影響。
方法如下取2只10天生長旺盛無潰破的Lewis肺癌瘤株，按常規(guī)方法在嚴(yán)格無菌條件下取瘤，取生長良好無液化、壞死的瘤組織，用玻璃勻漿器制成勻漿，加NS稀釋為1∶3的瘤組織懸液(外置冰塊)，混勻后sc于C57BL小鼠右腋0.2ml/只(含瘤細胞1×105)，24h后按隨機分為模型對照(生理鹽水)、Cy(60mg/kg)、苦參小(10mg/kg)、中(20mg/kg)、大(40mg/kg)三個劑量組，每組10只動物，共5組。Cy組ip1次，模型對照組、苦參總堿小、中、大三個劑量組ig給藥，均1次/天，共12天。觀察腫瘤生長情況，破潰者剃除，于末次給藥后24h頸椎脫臼處死動物，稱體重，剝瘤，稱瘤重，計算腫瘤抑制率。
結(jié)果表明苦參總生物堿對Lewis肺癌有明顯的抑制作用，三個劑量組抑瘤率均大于30％。5.苦參總生物堿對W256實體瘤抗腫瘤的影響本試驗采用Wistar大鼠右腋sc W256實體瘤瘤細胞懸液，造成W256實體瘤動物模型，觀察苦參總生物堿小(10mg/kg)、中(20mg/kg)、大(40mg/kg)三個劑量組ig對W256實體瘤的抑制作用。
方法如下取Wistar大鼠50只(第三批60只)，按常規(guī)方法在嚴(yán)格無菌條件下，從2只瘤株腹腔抽取乳白色濃稠癌性腹水混勻，加NS稀釋為1∶3的瘤組織懸液(外置冰塊)，消毒皮膚，混勻后于大鼠右腋sc 0.2ml/只(含瘤細胞2×107)，24h后隨機分為模型對照(生理鹽水)、威麥寧(200mg/kg)、苦參總堿小(5mg/kg)、中(10mg/kg)、大(20mg/kg)三個劑量組，共5組，每組10只動物。均ig給藥，1次/天，連續(xù)7天。末次給藥后24h處死動物，稱體重，剝離腫瘤，稱瘤重，計算腫瘤抑制率。
結(jié)果表明苦參總生物堿小、中、大劑量三劑量組對W256實體瘤有明顯的抑制作用，三個劑量對W256實體瘤的抑制率均大于30％。6.苦參總生物堿對環(huán)磷酰胺(Cy)抗S180的增效作用本試驗采用小鼠右腋sc S180實體瘤細胞懸液，造成S180實體瘤動物模型，腹腔注射(ip)環(huán)磷酰胺20mg/kg 1次，ig苦參總生物堿小(10mg/kg)、中(20mg/kg)、大(40mg/kg)三個劑量，觀察苦參總生物堿對環(huán)磷酰胺抗S180實體瘤的增效作用。
方法如下取7d生長良好的S180瘤株，在無菌條件下，用空針抽吸腹水，取乳白色濃稠腹水以NS 1∶3倍稀釋，接種于受體動物右腋皮下，0.2ml/只(含瘤細胞2×106)。24小時后按體重分組模型對照(生理鹽水)、Cy組(生理鹽水)、苦參總堿小劑量(10mg/kg)+Cy、苦參總堿中劑量(20mg/kg)+Cy、苦參總堿大劑量(40mg/kg)+Cy，共5組，每組10只動物。接種24小時后，Cy組ip一次(模型對照ip NS)，各組ig給藥，1次/天，連續(xù)7天。觀察小鼠生長情況，腫瘤破潰者剔除，于末次給藥后24小時頸椎脫臼處死稱重，剝?nèi)∧[瘤，稱瘤重，計算腫瘤抑制率。
結(jié)果表明苦參總生物堿對環(huán)磷酰胺抗S180有增效作用，明顯增加環(huán)磷酰胺抗S180腫瘤的抑制率。7.苦參總生物堿對環(huán)磷酰胺(Cy)的減毒作用本試驗通過小鼠ip(20mg/kg)環(huán)磷酰胺1次/天，連續(xù)4天，造成動物損傷模型，同時ig苦參總生物堿小(10mg/kg)、中(20mg/kg)、大(40mg/kg)三個劑量7天，觀察苦參總生物堿對環(huán)磷酰胺所致的骨髓抑制、免疫功能低下及肝腎功能損害是否有所改善。
方法如下取昆明種小鼠65只，按血液學(xué)WBC指標(biāo)(小于6×109/L或大于9×109/L者剔除)分為正常對照(生理鹽水)、模型對照(Cy20mg/kg)、苦參總堿小(10mg/kg+Cy20mg/kg)、中(20mg/kg+Cy20mg/kg)、大(40mg/kg+Cy20mg/kg)三個劑量組，共5組，每組12只動物。除正常對照組ip生理鹽水NS外，其余各組ip Cy20mg/kg，給藥體積0.1ml/10g，每天1次，連續(xù)4天；各組ig給藥0.2ml/10g，每日1次，連續(xù)7天。于末次給藥后24h摘眼球取血，涂片，用瑞氏—姬姆薩染色法進行WBC計數(shù)；取左側(cè)股骨，用5ml 3％醋酸沖洗骨髓進行骨髓有核細胞(BMNC)計數(shù)；測定血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、血清尿素氮(BUN)及肌酐(Cr)含量。
結(jié)果表明苦參總生物堿能夠明顯增加白細胞(WBC)、骨髓有核細胞(BMNC)，顯著降低谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)及肌酐(Cr)水平，結(jié)果提示苦參總生物堿對環(huán)磷酰胺有減毒作用。8.苦參總生物堿對腫瘤細胞的抑制作用本實驗用體外細胞培養(yǎng)方法，觀察苦參總生物堿對肝癌細胞、胃癌細胞和腸癌細胞的抑制作用。
方法如下將腫瘤細胞用0.25％胰酶消化，按3000個/ml的細胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，放入37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁生長后加藥。
用培養(yǎng)液將苦參總生物堿溶液倍比稀釋成以下各濃度1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml，每濃度5孔，并設(shè)細胞對照和空白對照。將培養(yǎng)板放入37℃5％CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4d。4d后，用加樣器吸去各孔上清液，向每孔加無血清培養(yǎng)液配制的濃度為0.2mg/ml的MTT溶液，再放回37℃5％CO2培養(yǎng)箱中，4小時后，吸去各孔中液體，每孔加DMSO200μl，然后將培養(yǎng)板置微量振蕩器上振蕩10分鐘后，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長下檢測。根據(jù)OD值，按公式計算細胞生長抑制率和半數(shù)毒性濃度(IC50)。
結(jié)果表明，苦參總生物堿對肝癌細胞、胃癌細胞和腸癌細胞均有抑制作用，并有一定的量效關(guān)系。為苦參總生物堿對腫瘤細胞的抑制作用提供了實驗依據(jù)。
綜上所述，苦參總生物堿對S180實體瘤、H22肝癌實體瘤、艾氏腹水瘤、Lewis肺癌、W256實體瘤、肝癌細胞、胃癌細胞和腸癌細胞均有明顯有抑制作用，并增加環(huán)磷酰胺抗S180實體瘤的抑制率，對環(huán)磷酰胺有減毒作用。
本發(fā)明藥用組合物具有如下突出特點1.高效低毒2.有效成分明確，質(zhì)量可控3.工藝簡便，易于產(chǎn)業(yè)化4.植物原料廉價易得5.適應(yīng)癥廣，市場容量大
權(quán)利要求
1.一種治療包括S180惡性實體瘤、H22肝癌惡性實體瘤、艾氏腹水瘤、Lewis肺癌、W256惡性實體瘤、肝癌、胃癌和腸癌細胞等惡性實體瘤的中藥藥物組合物，其為用水作溶劑，從苦參原料藥中提取得到的苦參總生物堿提取物，該提取物中苦參堿的含量在15％以上。
2.治療惡性實體瘤的中藥藥物，其中的活性成分為權(quán)利要求1的組合物，并包括藥劑學(xué)可接受的輔料組分。
3.權(quán)利要求2所述的中藥藥物組合物，其劑型包括注射針劑和口服制劑。
4.權(quán)利要求3所述的藥物組合物的口服制劑，其特征在于將組合物單獨或與其它藥用許可的輔料配合后按現(xiàn)有方法制成片劑、膠囊、滴丸、顆粒劑、口服液等劑型，且所述苦參提取物中的苦參堿的含量在15％以上。
5.權(quán)利要求3所述藥用組合物的注射制劑的制備方法，其特征在于將組合物單獨或與其它藥用許可的輔料配合后按現(xiàn)有方法制成注射液(1-500ml任意規(guī)格)或粉針(凍干或噴干)。
6.治療惡性實體瘤的中藥藥物組合物的制備方法，其包括以苦參中藥為原料，用水提取，并經(jīng)純化分離制取苦參總生物堿提取物，該提取物中苦參總堿含量在50％以上，苦參堿含量為15％以上；以該提取物為有效成分按照藥劑學(xué)方法制備成制劑。
7.權(quán)利要求5所述的制備方法，其中，提取苦參堿提取物的方法包括如下步驟(1)用8倍體積的水提取粉碎后的苦參原料藥3次；(2)合并提取液，濃縮至相對密度為1.06～1.08；(3)將上述濃縮后的提取液加鹽酸調(diào)pH值至3～4，過濾。(4)上清液過732型陽離子交換樹脂柱，用10倍體積水及6倍體積30％乙醇洗去部分雜質(zhì)。(5)用1倍柱體積濃氨水堿化步驟(4)中洗過的樹脂后，用6倍體積30％乙醇洗脫。(6)收集洗脫液，經(jīng)減壓濃縮，噴霧干燥，得苦參總生物堿。
8.權(quán)利要求6所述的方法，其中，乙醇液洗脫時的洗脫速度為850-1500毫升/分鐘。
9.權(quán)利要求5所述的制備方法，其中，藥物制劑的制備包括按照藥劑學(xué)方法制備成注射針劑和口服劑。
10.減壓回收乙醇，濃縮后噴霧干燥。即得苦參總生物堿。
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥新藥研究開發(fā)領(lǐng)域,涉及一種用現(xiàn)代科技手段對中藥苦參中有效成分進行提取精制的制備方法,并提供了該中藥藥物組合物的制劑劑型,尤其是口服膠囊劑。本發(fā)明藥物可用于治療惡性實體瘤,對環(huán)磷酰胺有減毒作用,且對腫瘤細胞具有高度選擇性,對正常細胞沒有殺傷作用。
文檔編號C07D471/00GK1389223SQ0111847
公開日2003年1月8日 申請日期2001年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月1日
發(fā)明者周亞偉, 王莉潔, 解秀蘭, 趙祥, 周玲 申請人:周亞偉