專利名稱：激發(fā)型抗人cd40單克隆抗體的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體說是一種激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體的制備方法及其應(yīng)用。
惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，盡管隨著化放療和手術(shù)療法等手段的不斷提高，許多腫瘤患者可獲得臨床意義上的緩解，但仍不能免避腫瘤殘留細(xì)胞復(fù)發(fā)所致的死亡。腫瘤的發(fā)生是由逃避免疫監(jiān)視的變異細(xì)胞惡性增殖，其逃避機(jī)制之一是由于機(jī)體抗原遞呈細(xì)胞特別是樹突狀細(xì)胞在數(shù)量和功能上的異常，致使機(jī)體的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞處于免疫耐受狀態(tài)。因此通過改變T細(xì)胞免疫耐受狀態(tài)并激發(fā)機(jī)體特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答，以清除和控制腫瘤殘留細(xì)胞，成為腫瘤免疫治療的重要手段。
樹突細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是體內(nèi)專業(yè)的抗原遞呈細(xì)胞，是初次和再次免疫應(yīng)答有力的開啟者。DCs是唯一可以激發(fā)幼稚性T細(xì)胞的抗原遞呈細(xì)胞，且較其它抗原細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞(Mφ)和B細(xì)胞的抗原遞呈作用強(qiáng)100倍以上，在誘導(dǎo)機(jī)體特異性細(xì)胞免疫中起著極其重要的作用。DCs激發(fā)T細(xì)胞依賴的免疫反應(yīng)，在體外誘導(dǎo)并經(jīng)抗原刺激的DCs回輸入體內(nèi)也可遷移到淋巴組織，并致敏T細(xì)胞，激發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)。因而，采用DCs體外激發(fā)或同時(shí)負(fù)載腫瘤抗原或者將目的基因轉(zhuǎn)染DCs作為免疫疫苗，可有效地激發(fā)機(jī)體特異性的抗腫瘤主動(dòng)免疫，對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性殺傷作用。
在應(yīng)用DCs進(jìn)行腫瘤治療中關(guān)鍵的技術(shù)之一是設(shè)法在體外獲得大量用于治療目的的DCs。傳統(tǒng)的在體外擴(kuò)增樹突狀細(xì)胞的方法是將粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)及腫瘤壞死因子α(TNFα)加于體外培養(yǎng)的CD34+造血前體細(xì)胞，所獲得的樹突狀細(xì)胞高表達(dá)CD40(Nature 1992；360258-261/J Exp Med 1997；185341-349)。這些細(xì)胞依賴GM-CSF生存，但它們還能在CD40L轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞中培養(yǎng)繼續(xù)存活和生長(zhǎng)。樹突狀細(xì)胞在CD40分子被激發(fā)后導(dǎo)致一些與抗原遞呈相關(guān)的重要形態(tài)變化、如細(xì)胞漿內(nèi)容物減少和樹突狀突增多，以及表型改變、CD40的激發(fā)導(dǎo)致了高水平表達(dá)MHCII類抗原和上調(diào)輔助分子如CD58、CD80/B7和CD86/B70，而這些分子有助于提高抗原遞呈能力和增強(qiáng)對(duì)T細(xì)胞的激發(fā)作用。由于體內(nèi)CD34+細(xì)胞數(shù)量很少，不宜獲得，使得體外擴(kuò)增的DCs在數(shù)量上難以滿足臨床治療用量(單次用量≥1×106細(xì)胞)。用TNF和GM-CSF誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞仍然需要經(jīng)過CD40分子的激發(fā)才能最終分化成熟而發(fā)揮激發(fā)T細(xì)胞的功能，若用CD40L轉(zhuǎn)基因細(xì)胞激發(fā)DCs成熟，不宜最終獲得高純度的DCs(有CD40L細(xì)胞污染)，故不宜用于臨床治療。鑒此，研制可溶性的CD40分子激動(dòng)劑(可溶性CD40配體或激發(fā)型抗CD40單抗)，將為臨床應(yīng)用帶來便利。
文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的各種抗CD40單抗均采用正常細(xì)胞或可溶性CD40融和蛋白為免疫原獲得，其中抗CD40單抗mAb89和G28-5因其能與IgM抗體或佛波脂(Phorbol esters)共刺激使純化的B細(xì)胞擴(kuò)增而著名，但這些單抗卻不能有效激發(fā)樹突狀細(xì)胞(Eur J Immunol，1989；191463-67/Nature，1991；353；678-9)?？笴D40單抗5D12、3A8和3C6為阻斷型單抗，可用來阻斷B細(xì)胞的擴(kuò)增(美國(guó)專利號(hào)6004552)。
本發(fā)明的目的在于提供了一種激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體的制備方法及其應(yīng)用，該方法取材方便且來源豐富，通過該方法取得的激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體用于B細(xì)胞體外擴(kuò)增；用于在體外誘導(dǎo)DCs及促使其分化成熟一步完成、DCs可用于臨床；用于誘導(dǎo)CD40表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、凋亡和提高其免疫原性，達(dá)到治療腫瘤的目的。
本發(fā)明的目的是通過以下方案實(shí)現(xiàn)的一種激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體的制備方法，其特征在于將高表達(dá)CD40分子的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株(XG2)為免疫原，免疫Balb/C小鼠；免疫小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠SP2/0細(xì)胞株進(jìn)行融和；以高表達(dá)CD40分子的腫瘤細(xì)胞株(多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株XG2、B淋巴瘤細(xì)胞株Daudi)陽(yáng)性對(duì)照和不表達(dá)CD40分子的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株(XG7、XG1)陰性對(duì)照，用間接免疫熒光法對(duì)雜交瘤培養(yǎng)上清進(jìn)行篩選、蛋白鑒定及Ig亞類鑒定，經(jīng)復(fù)篩及亞克隆后獲得穩(wěn)定分泌特異鼠抗人CD40雜交瘤細(xì)胞株，命名為5C11和2G11，并再體外持續(xù)傳代，分批凍存；規(guī)模化細(xì)胞培養(yǎng)或生產(chǎn)腹水、分離純化和單抗的特性鑒定并獲得激發(fā)型抗人CD40單抗純品。
激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體應(yīng)用包括以下三方面一.激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體用于B細(xì)胞體外擴(kuò)增。
采用激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體5C11或2G11在體外擴(kuò)增B細(xì)胞的方法
1.純度＞98％扁桃體B細(xì)胞；LCD32為轉(zhuǎn)染FcγRII(人CD32)的鼠成纖維細(xì)胞，用含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)(法國(guó)B.Klein博士贈(zèng)送INSERM.U475)；激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體5C11和2G11(本發(fā)明提供的方法制備的)。
2.在B細(xì)胞培養(yǎng)體系中，加入經(jīng)絲裂霉素5×107、50ug絲裂霉素/ml處理洗滌后LCD32 5×104細(xì)胞/ml，5C11或2G11 1ug/ml及人重組IL-4 100U/ml(購(gòu)自Diaclone公司法國(guó))；3.在B細(xì)胞培養(yǎng)體系中再加入人重組IL-2 500U/ml(購(gòu)自上海華新公司)，人重組IL-6 1ng/ml及人重組FL 50ng/ml(購(gòu)自Immugene公司美國(guó))的不同組合，培養(yǎng)，在調(diào)整細(xì)胞濃度后，更換新鮮培養(yǎng)基、細(xì)胞因子及LCD32，計(jì)數(shù)(胎盤蘭染色)。
二.激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體用于誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞DCs分化成熟以及在體外激發(fā)T細(xì)胞的主要試劑。
采用激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體5C11和2G11誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞分化成熟以及在體外激發(fā)T細(xì)胞的方法。
取腫瘤患者或供血員新鮮外周血50～100ml用淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll/Paque)分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC)，將PBMNC貼壁培養(yǎng)、去除非貼壁細(xì)胞，在貼壁生長(zhǎng)的單核細(xì)胞中加入細(xì)胞因子人重組IL-4 100～1000U/ml、粒巨細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF1000U/ml、和激發(fā)型抗人CD40單抗CD40mAb-5C11或2G11 1～10μg/ml，若干天后收集獲得樹突狀細(xì)胞(DCs)。
三.激發(fā)型抗CD40單克隆抗體用于誘導(dǎo)CD40表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、凋亡和提高其免疫原性的方法。
1.在腫瘤病人CD40陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中加入激發(fā)型抗人CD40單抗5C11或2G11 1～10微克/毫升，培養(yǎng)24～96小時(shí)。
2.T淋巴細(xì)胞的激發(fā)用淋巴細(xì)胞分離液分離獲得患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，將其按10～20∶1與經(jīng)激發(fā)型抗人CD40單抗處理(步驟1)的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，同時(shí)加入人重組白細(xì)胞介素-2(rhIL-2)500～1000U/毫升，培養(yǎng)7～14天，激發(fā)后的T細(xì)胞可回輸機(jī)體以過繼免疫治療腫瘤。
本發(fā)明提供的激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體的制備方法，將高表達(dá)CD40分子的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株(XG2)為免疫原、以不表達(dá)CD40分子的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株(XG7、XG1)為陰性對(duì)照，所獲得的激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體(5C11和2G11)，除同樣具有使B細(xì)胞擴(kuò)增的功能只外，可使外圍血來源的CD14+的單核細(xì)胞擴(kuò)增和分化為樹突狀細(xì)胞DCs，并且經(jīng)抗CD40單抗5C11激發(fā)后的DCs還具有成熟的標(biāo)志和明顯激發(fā)T細(xì)胞的功能。本發(fā)明提供的方法，擴(kuò)增和誘導(dǎo)DCs成熟一步完成，且克服了用CD40L轉(zhuǎn)基因細(xì)胞誘導(dǎo)Dcs成熟中的細(xì)胞污染問題，使臨床應(yīng)用成為可能。同時(shí)，由于外周血取材方便且來源豐富，解決了用CD34+細(xì)胞誘導(dǎo)DCs方法中細(xì)胞量不足的問題。用于體外激發(fā)T淋巴細(xì)胞并用于過繼治療腫瘤。本發(fā)明提供的采用激發(fā)型抗CD40單克隆抗體用于誘導(dǎo)CD40表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞凋亡或提高其免疫原性、用于體外激發(fā)T淋巴細(xì)胞并用于過繼治療腫瘤。本發(fā)明所提供的抗CD40激發(fā)型單抗5C11和2G11，它們?cè)隗w外可以導(dǎo)致B細(xì)胞淋巴瘤和MM的生長(zhǎng)抑制和凋亡，并能提高這些腫瘤對(duì)化/放療的敏感性。同時(shí)，這些腫瘤細(xì)胞CD40分子的激發(fā)還導(dǎo)致其CD95(Fas)及粘附分子ICAM-1的表達(dá)，有助于細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLs)對(duì)其殺傷。因CD40分子的激發(fā)，在正常免疫細(xì)胞往往介導(dǎo)增殖與分化成熟，而在許多腫瘤細(xì)胞，CD40分子的激發(fā)介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡以及誘導(dǎo)其抗原性。這兩方面正是腫瘤免疫治療所要達(dá)到的目標(biāo)，激發(fā)型抗人CD40單抗起到了雙功能分子的作用，是較為理想的抗腫瘤生物制劑。
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。
圖1是5C11雜交瘤細(xì)胞株染色體核型2是雜交瘤細(xì)胞株5C11和2G11增殖曲線。
圖3是5C11和抗CD40單抗MAB競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)。
圖4是Western bolt免疫印跡分析。
圖5是CD40分子在不同細(xì)胞上的表達(dá)。
圖6是CD40培養(yǎng)體系中扁桃體B細(xì)胞成團(tuán)族狀生長(zhǎng)。
圖7是不同培養(yǎng)體系中B細(xì)胞的增殖作用。
圖8是不同細(xì)胞因子組合誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞增殖曲線。
圖9是混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。
圖10是5C11引起XG2和Daudi細(xì)胞的同型聚集。
圖11是5C11引起XG2和Daudi細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。
圖12是流式細(xì)胞儀分析5C11誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。
圖13是XG2和Daudi粘附分子的變化。
圖14是T細(xì)胞殺傷結(jié)果。


圖1. 5C11雜交瘤細(xì)胞株染色體核型分析。
圖2.雜交瘤細(xì)胞株5C11(A)、2G11(B)增殖曲線，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間，單位小時(shí)；縱坐標(biāo)代表活細(xì)胞數(shù)量，單位A×105細(xì)胞/毫升，B×104細(xì)胞/毫升。
圖3.為流式細(xì)胞儀分析圖。1XG2細(xì)胞株散點(diǎn)圖，橫坐標(biāo)表示側(cè)像散射熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)表示前像散射熒光強(qiáng)度；2XG2陰性對(duì)照，熒光素PE標(biāo)記的小鼠IgG直標(biāo)單抗；3XG2與抗CD40單抗5C11作用后，加熒光素PE標(biāo)記的鼠抗人CD40單抗MAB89；4XG2陽(yáng)性對(duì)照，熒光素PE標(biāo)記的鼠抗人CD40單抗MAB895XG2陽(yáng)性對(duì)照，一抗為5C11，二抗為熒光素FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG2；6Daudi細(xì)胞株散點(diǎn)圖，橫軸表示側(cè)像散射，縱軸表示前像散射；7Daudi陰性對(duì)照，熒光素PE標(biāo)記的小鼠IgG直標(biāo)單抗8Daudi與抗CD40單抗5C11作用后，加熒光素PE標(biāo)記的鼠抗人CD40單抗MAB89；9Daudi陽(yáng)性對(duì)照，熒光素PE標(biāo)記的鼠抗人CD40單抗MAB89；10Daudi陽(yáng)性對(duì)照，一抗為5C11、二抗為熒光素FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG。
圖4. 1分子量標(biāo)準(zhǔn)，單位是千道爾頓(KD)；2CD40分子表達(dá)陰性的Jurkat細(xì)胞株膜蛋白提取液；3XG2細(xì)跑株膜蛋白提取液；4CD40分子表達(dá)弱陽(yáng)性的Raji細(xì)胞株膜蛋白提取液；5Daudi細(xì)胞株膜蛋白提取液。
圖5.為流式細(xì)胞儀分析圖，陰影部分為陰性對(duì)照(一抗為小鼠IgG抗體，二抗為熒光素FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG)，空心部分為CD40表達(dá)情況(一抗為鼠抗人CD40單抗，二抗為熒光素FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG)。1外周血單個(gè)核細(xì)胞；2外周血T細(xì)胞；3外周血B細(xì)胞；4扁桃體B細(xì)胞；5Daudi細(xì)胞株；6xG2細(xì)胞株。
圖6.CD40培養(yǎng)體系中扁桃體B細(xì)胞成團(tuán)族狀生長(zhǎng)。
圖7.不同培養(yǎng)體系中B細(xì)胞的增殖作用。
圖8.橫坐標(biāo)為培養(yǎng)大數(shù)，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)量(×105/毫升)。1細(xì)胞因子組合為GM-CSF+IL-4+5C11；2細(xì)胞因子組合為單獨(dú)5C11；3細(xì)胞因子組合為GM-CSF+IL-4；4陰性對(duì)照，為單獨(dú)培養(yǎng)基。
圖9. 1外周血單個(gè)核細(xì)胞+臍帶血單個(gè)核細(xì)胞；2植物血凝素PHA+臍帶血單個(gè)核細(xì)胞；3GM-CSF聯(lián)合1L-4誘導(dǎo)的DCs+臍帶血單個(gè)核細(xì)胞；4抗CD40單抗5C11聯(lián)合GM-CSF與IL-4誘導(dǎo)的DCs+臍帶血單個(gè)核細(xì)胞。
圖10.放大倍數(shù)為250。1XG2細(xì)胞；2Daudi細(xì)胞。
圖11.AXG2細(xì)胞株BDaudi細(xì)胞株。1單獨(dú)培養(yǎng)基；2陰性對(duì)照單抗(小鼠IgG)；3抗CD40單抗5C11(10微克/毫升)。
圖12.流式細(xì)胞儀分析圖。橫坐標(biāo)為碘化丙碇(P1)對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為熒光素標(biāo)記的Annexin-V對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度。1XG2陰性對(duì)照；2加5C11培養(yǎng)48小時(shí)的XG2細(xì)胞；3.Daudi陰性對(duì)照4加5C11培養(yǎng)48小時(shí)的Daudi細(xì)胞。
圖13.經(jīng)抗CD40單抗5C11激發(fā)后，XG2(A)和Daudi(B)粘附分子的變化?？招拇硖幚砬埃幱按硖幚砗?。
圖14. 1為陰性對(duì)照，2為抗CD40單抗處理組。A為XG2，B為Daudi細(xì)胞。
實(shí)施例1。
激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體的制備方法，采用高表達(dá)CD40分子的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株(XG2)為免疫原、以不表達(dá)CD40分子的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株(XG7、XG1)為陰性對(duì)照，按Kohler和Milstein建立的方法進(jìn)行，Nature1975，256495-96。
1.XG1、XG2、XG6、XG7是蘇州大學(xué)生物技術(shù)研究所建立的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株系，置于含10％胎牛血清及rIL-6 3ng/ml的RPMI1640(Gibical公司)中常規(guī)培養(yǎng)，其中XG2的CD40分子的表達(dá)異常高(陽(yáng)性率為99％、熒光強(qiáng)度達(dá)625)，XG6有微弱的CD40分子表達(dá)，而XG1和XG7均不表達(dá)可檢測(cè)性CD40分子；B淋巴瘤細(xì)胞株Daudi，T急淋巴細(xì)胞株Jurkat(均購(gòu)自ATCC)用含10％胎牛血清的RPMI1640(Gibical公司)培養(yǎng)基中長(zhǎng)期培養(yǎng)。這些細(xì)胞株均無支原體污染。XG2作為免疫原細(xì)胞，而其它細(xì)胞作為陽(yáng)性或陰性篩選的靶細(xì)胞。
2.采用高表達(dá)CD40分子的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株(XG2)為免疫原，將XG2細(xì)胞107/500μl/只鼠(注射前經(jīng)絲裂霉素處理)加入等體積的福氏不完全佐劑，免疫Balb/C小鼠，間隔3周，共3次。在末次免疫的第四天取小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞株按常規(guī)方法進(jìn)行融合，共融合了20塊96孔板。以高表達(dá)CD40分子的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株XG2陽(yáng)性對(duì)照及不表達(dá)CD40分子的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株XG7陰性對(duì)照，用間接免疫熒光法對(duì)雜交瘤培養(yǎng)上清進(jìn)行初步篩選、蛋白鑒定及Ig亞類鑒定；繼而用高表達(dá)CD40分子的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株Daudi陽(yáng)性對(duì)照及不表達(dá)CD40分子的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株XG1陰性對(duì)照，作進(jìn)一步篩選和鑒定。陽(yáng)性克隆以有限稀釋法單克隆化，經(jīng)過三次有限稀釋法亞克隆，使克隆的陽(yáng)性率達(dá)99％，經(jīng)復(fù)篩及亞克隆后獲得穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CD40的雜交瘤細(xì)胞株，命名為2G11和5C11，并在體外持續(xù)傳代(40代)后，仍能穩(wěn)定分泌特異性抗體，分批凍存；規(guī)模化細(xì)胞培養(yǎng)或生產(chǎn)腹水、分離純化和單抗的特性鑒定并獲得激發(fā)型抗人CD40單抗純品。
雜交瘤細(xì)胞株2G11和5C11的特征雜交瘤細(xì)胞株2G11和5C11，其親本細(xì)胞為小鼠SP2/0骨髓瘤細(xì)胞株和多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株XG2免疫后的小鼠脾臟細(xì)胞，染色體分析這兩株雜交瘤染色體數(shù)目為92-108，并見中著絲粒標(biāo)記染色體1-2個(gè)，亞中著絲粒標(biāo)記染色體1個(gè)，微小體1-2個(gè)，如圖1所示。該細(xì)胞株的倍增時(shí)間是17小時(shí)，雜交瘤細(xì)胞株2G11和5C11增殖曲線，如圖2所示。該雜交瘤分泌特異性抗人CD40分子的單克隆抗體，抗體均為小鼠IgG1亞類。
3.單抗的特性鑒定方法(1)mAb效價(jià)測(cè)定誘生腹水按本室建立的常規(guī)方法進(jìn)行，效價(jià)測(cè)定采用間接免疫熒光法；(2)mAb的Ig亞類測(cè)定，采用試紙快速測(cè)定(Argen公司法國(guó))；(3)腹水型mAb的純化及定量按Phamacia公司方案采用Protein G柱分離純化，定量采用染料結(jié)合比色法(BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白作對(duì)照)(AnalBiochem，1996236302)；(4)CD40抗原在各類細(xì)胞系上的表達(dá)采用常規(guī)的間接免疫熒光法，用流式細(xì)胞儀分析；(5)抗體識(shí)別原位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)XG2及Daudi細(xì)胞1×106，先用純化后的mAb10ug/100ul孵育45min，PBS洗滌2次，加鼠抗人CD40-PE直標(biāo)單抗(克隆mAb89購(gòu)自法國(guó)Immunotech公司)2ug/100ul孵育30min，同時(shí)用CD40-PE 2ug/100ul作為陽(yáng)性對(duì)照，鼠IgG1-PE(購(gòu)自法國(guó)Immunotech公司)為陰性對(duì)照，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞膜熒光表達(dá)強(qiáng)度；(6)mAb的Western blot鑒定將XG2、Daudi、XG7、Raji、Jurkat細(xì)胞各1×107用PBS洗兩遍后，去除上清，加入50ul 1倍的加樣緩沖液，在水中煮沸15min，用10％SDS-PAGE凝膠進(jìn)行分離，一抗為5C11，二抗為羊抗鼠Ig-POD(購(gòu)自德國(guó)Boehringe公司)，顯色按該公司W(wǎng)estern blot Kit所提供的方法進(jìn)行。
單抗的特性鑒定結(jié)果(1)腹水效價(jià)免疫熒光測(cè)定腹水效價(jià)為11000；(2)mAb亞類鑒定為小鼠IgG1型；(3)5C11在各細(xì)胞系上的表達(dá)見表1(A、B)，表1A CD分子在淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞株傷的表達(dá)(陽(yáng)性率，熒光對(duì)數(shù))XG1 XG2 XG6 XG7 DaudiMAb89 - 99％ 625 30％20 - 99％ 235C11- 99％ 745 25.5％ 17 - 99％ 22表1B CD40分子在在淋巴細(xì)胞上的表達(dá)PBMN T MQ BDCTonsil BCMAb89 5％+ - 90％+ 98％+96％+++ 98％++5C11 5％+ - 90％+ 98％+96％+++ 98％++Note5C11 and mAb89 recognize the same CD40 distnbution pattern on aseries of cell lines and on lymphocytes(Fluorescence intensity+positive，++bright，+++very bright)結(jié)果表明5C11所識(shí)別的細(xì)胞譜系與Immunotech公司抗CD40mAb(克隆mAb89)相似；(4)單抗的抗體競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)結(jié)果，如圖3所示，5C11能將XG2及Daudi上的CD40抗原位點(diǎn)100％封閉，與法國(guó)Immunotech公司CD40mAb識(shí)別位點(diǎn)相似；(5)western blot顯示5C11能識(shí)別分子量在50KD左右的特異蛋白條帶，如圖4所示。
實(shí)施例2，激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體用于B細(xì)胞體外擴(kuò)增。
1.激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體5C11和2G11的制備，采用實(shí)施例1所述。LCD32為轉(zhuǎn)染FcγRII(人CD32)的鼠成纖維細(xì)胞，用含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)(法國(guó)B.Klein博士贈(zèng)送INSERM.U475)。扁桃體B細(xì)胞的制取，將外科手術(shù)的扁桃體除去包膜(標(biāo)本獲自蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院五官科)，壓碎并篩網(wǎng)過濾，所得的單細(xì)胞懸液經(jīng)兩次E花環(huán)及Ficoll分離去除T細(xì)胞，再經(jīng)貼壁培養(yǎng)2小時(shí)去除單核細(xì)胞，獲得純度＞98％的B細(xì)胞。
2.CD40體外培養(yǎng)系統(tǒng)的建立將LCD32經(jīng)絲裂霉素5×107、50ug絲裂霉素/ml處理，洗滌后調(diào)至5×104細(xì)胞/ml，分別加入5C11或2G111ug/ml及人重組IL-4 100U/ml(購(gòu)自Diaclone公司法國(guó))，人重組IL-2 500U/ml(購(gòu)自上海華新公司)，人重組IL-6 1ng/ml及人重組FL 50ng/ml(購(gòu)自Immugene公司美國(guó))的不同組合，B細(xì)胞最終濃度為2×105/ml，于24孔培養(yǎng)板中(購(gòu)自Nunc公司)培養(yǎng)。于培養(yǎng)的5、10、15天計(jì)數(shù)(胎盤蘭染色)。每隔5天在調(diào)整細(xì)胞濃度后，更換新鮮培養(yǎng)基、細(xì)胞因子及LCD32。每組作3個(gè)復(fù)孔。
結(jié)果表明1.CD40分子在B細(xì)胞和B細(xì)胞腫瘤的表達(dá)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC)中極少部分細(xì)胞呈CD40弱陽(yáng)性表達(dá)；而來源于外周血和扁桃體的B細(xì)胞均表達(dá)CD40分子；人MM細(xì)胞株異常高表達(dá)CD40，B淋巴細(xì)胞株細(xì)胞也均呈強(qiáng)陽(yáng)性，而外周血T細(xì)胞不表達(dá)CD40分子，如圖5所示。2.5C11+LCD32促進(jìn)扁桃體B細(xì)胞的存活和成團(tuán)族狀生長(zhǎng)在B細(xì)胞培養(yǎng)體系中，加入抗CD40mAb5C11和轉(zhuǎn)染人CD32(FcγR)的鼠L細(xì)胞，在培養(yǎng)的24小時(shí)后觀察到B細(xì)胞成同源型聚集，繼而呈大小不等的團(tuán)族狀，如圖6所示?？笴D40mAb2G11具有與5C11類似的效應(yīng)。3.5C11+LCD32培養(yǎng)體系雖能使B細(xì)胞在體外培養(yǎng)中存活和形成集落，但在擴(kuò)增數(shù)量上并不明顯。單在培養(yǎng)的24小時(shí)后即觀察到B細(xì)胞成同源性聚集，繼而呈大小不等變化，5C11+LCD32培養(yǎng)體系能夠使B細(xì)胞在體外培養(yǎng)中存活和形成集落，而在B細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入人重組IL-4(100U/ml)后，可顯著地促使培養(yǎng)細(xì)胞在體外較長(zhǎng)期的增殖，細(xì)胞數(shù)絕對(duì)值在培養(yǎng)后15天增加了3倍之多，而對(duì)照組的細(xì)胞在培養(yǎng)后第3天開始明顯下降，在培養(yǎng)的第15天時(shí)所有的細(xì)胞均死亡，如圖7所示。4.在B細(xì)胞培養(yǎng)體系中再加入人重組IL-2 500U/ml(購(gòu)自上海華新公司)，人重組IL-6 1ng/ml及人重組FL 50ng/ml(購(gòu)自Immugene公司美國(guó))的不同組合，在培養(yǎng)體系中加入其它的一些細(xì)胞因子如IL-2、IL-6、Flt3L等可協(xié)同IL-4使B細(xì)胞增殖，但這種增殖作用必須依賴IL-4的存在。
實(shí)施例3。
1.激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體5C11和2G11用于誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞分化成熟以及在體外激發(fā)T細(xì)胞的方法。
腫瘤患者或供血員新鮮外周血50～100ml用淋巴細(xì)胞分離液(F1coll/Paque)密度梯度離心分離得到單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC)，將PBMNC按1×107細(xì)胞/3ml/孔置于含10％胎牛血清的RPMI1640中培養(yǎng)(6孔培養(yǎng)板)，2小時(shí)后去除非貼壁細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)的單核細(xì)胞中加入下列組合的細(xì)胞因子人重組白細(xì)胞介素4(IL-4)100U/ml(購(gòu)自法國(guó)Diaclone公司)、粒巨細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)1000U/ml(購(gòu)自北京醫(yī)科大學(xué))、激發(fā)型抗人CD40D單克隆抗體CD40mAb-5C11 1μg/ml和TNFa 100U/ml(日本東京大學(xué)島治教授贈(zèng)送)，用相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，每隔3天計(jì)數(shù)細(xì)胞活率(胎盤蘭染色)，并更換新鮮培養(yǎng)基。于培養(yǎng)的第七天檢測(cè)DCs的誘導(dǎo)率及表型(CD11a和CD83表達(dá)陽(yáng)性率)。第八天收集獲得的樹突狀細(xì)胞DCs。
2.DCs對(duì)T細(xì)胞的激發(fā)。
混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(MLR)常規(guī)分離臍帶血單個(gè)核細(xì)胞，將用不同方法誘導(dǎo)的DCs與臍帶血單個(gè)核細(xì)胞按1∶20混合，即DCs1×104，臍帶血單個(gè)核細(xì)胞2×105加于96孔板，以與DCs來源同一供體的PBMNCs作為陰性對(duì)照、PHA作為陽(yáng)性對(duì)照。5％CO2、37℃培養(yǎng)72小時(shí)，加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，吸棄上清，酸化異丙醇溶解甲贊顆粒并測(cè)定570nm下的OD值。按下列公式計(jì)算刺激指數(shù)(Stimulate Index，SI)SI＝(實(shí)驗(yàn)組OD值)/(對(duì)照組OD值)。
5C11能代替TNFa和GM-CSF使外周單核細(xì)胞來源的DCs擴(kuò)增和分化成熟，如圖8所示；IL-4+GM-CSF與5C11不僅可以使外周單核細(xì)胞來源的DCs擴(kuò)增和分化成熟，還可以使誘導(dǎo)的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，所誘導(dǎo)的DCsCD1a陽(yáng)性率達(dá)80％，CD83陰性率達(dá)58％，證實(shí)5C11能通過對(duì)CD40分子的激發(fā)作用，介導(dǎo)外周單核細(xì)胞向DCs分化及增殖。用激發(fā)型抗人CD40單抗誘導(dǎo)的DCs具有明顯的激發(fā)T細(xì)胞的作用，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果顯示，如圖9所示，加用激發(fā)型抗CD40單抗后誘導(dǎo)的DCs具有明顯的激發(fā)T細(xì)胞的功能，其刺激指數(shù)高于用IL-4+GM-CSF+TNFα誘導(dǎo)的DCs及PHA。
2.樹突狀細(xì)胞的應(yīng)用方法獲得的DCs可直接回輸機(jī)體用于治療，或與腫瘤抗原共培養(yǎng)后回輸機(jī)體，或在體外先激發(fā)機(jī)體T淋巴細(xì)胞(與機(jī)體外周血單個(gè)核細(xì)胞或T細(xì)胞混合培養(yǎng))，激發(fā)后的T細(xì)胞再回輸人體。
實(shí)施例4，激發(fā)型抗CD40單克隆抗體用于誘導(dǎo)CD40表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、凋亡或提高其免疫原性的方法。
1.腫瘤病人CD40陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞株XG2是蘇州大學(xué)生物技術(shù)研究所建立的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株，置于含10％胎牛血清及rIL-6 3ng/ml的RPMI1640(Gibical公司)中常規(guī)培養(yǎng)；B淋巴瘤細(xì)胞株Daudi(購(gòu)自ATCC)，用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃，5％CO2中長(zhǎng)期培養(yǎng)。U266、8266為IL-6非依賴MM細(xì)胞株(均購(gòu)自ATCC)，用含10％小牛血清的RPMI1640(Gibical公司)培養(yǎng)。
2.激發(fā)型抗人CD40單抗處理腫瘤細(xì)胞將XG2、Daudi細(xì)胞株2×105/ml培養(yǎng)于24孔板，加1～10微克/毫升不同濃度的單抗5C11或2G11，于培養(yǎng)的24hrs、48hrs、72hrs、96hrs計(jì)數(shù)(胎盤蘭染色)以觀察細(xì)胞增殖。每組作3個(gè)復(fù)孔。
3.細(xì)胞凋亡分析PI檢測(cè)2005g 10min離心收獲1×106細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌2次后，加入1ml的70％乙醇4°固定過夜。離心收集細(xì)胞，以PBS洗滌2次，再加入100ug/ml Rnase A，于37°放置30min，繼而細(xì)胞置于含有34mmol/L的檸檬酸鈉、50ug/ml碘化丙啶(Propidiumiodide)液體500ul中，避光于4°共育30min，用流式細(xì)胞儀的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行分析。Annexin-V標(biāo)記按Boehringe公司的說明書進(jìn)行，簡(jiǎn)述之1×106細(xì)胞用PBS洗滌兩次，重懸于100ul標(biāo)記液中[HEPESbuffer(HEPES/NaoH，ph7.4；140mM NaCl；and 5mM CaCl2)含2μl annexin和2ul PI(50μg/ml)]，室溫放置20min，用HEPES buffer洗兩次，用流式細(xì)胞儀(Coulter)分析。
4.與免疫原性及抗原遞呈相關(guān)的表面分子分析包括MHC-II抗原、CD95(Fas)、CD80(B7)、CD54(ICAM-1)、CD58(ICAM-3)的分析。用單抗采用流式細(xì)胞儀測(cè)定。分別采用熒光素PE標(biāo)記的鼠抗人MHC-DR、抗人CD95、抗人CD80、抗人CD54、抗人CD58的直標(biāo)型單抗進(jìn)行(均購(gòu)自法國(guó)Immunotech公司)，陰性對(duì)照為熒光素PE標(biāo)記的小鼠IgG。
5.T淋巴細(xì)胞的激發(fā)用淋巴細(xì)胞分離液分離獲得患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，將其按10～20∶1與經(jīng)激發(fā)型抗人CD40單抗處理(步驟2)的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，同時(shí)加入人重組白細(xì)胞介素-2(rhIL-2)1000U/毫升。培養(yǎng)7天，收集激發(fā)的T細(xì)胞。激發(fā)后的T細(xì)胞可輸回機(jī)體以過繼免疫治療腫瘤。
6.T細(xì)胞體外殺傷試驗(yàn)用51Cr標(biāo)記法標(biāo)記腫瘤細(xì)胞(參考曹雪濤主編.白細(xì)胞介素2的基礎(chǔ)與臨床，北京科學(xué)技術(shù)出版社，1990.183)，將胎盤蘭染色有95％活力的XG2、Daudi細(xì)胞(1×106/ml)用100微居51Cr在37℃水浴中標(biāo)記1小時(shí)，再用含10％胎牛血清的RPM11640將細(xì)胞洗三遍，重懸于完全培養(yǎng)基中，按1∶10比例與新鮮分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞或經(jīng)步驟5收集的T細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板共培養(yǎng)，(即腫瘤細(xì)胞1×104，T細(xì)胞1×105/100μl)。陰性對(duì)照孔僅加腫瘤細(xì)胞，陽(yáng)性對(duì)照加入1％TritonX-100。于培養(yǎng)的72小時(shí)在γ記數(shù)儀上檢測(cè)。 結(jié)果表明1)抗CD40mAb 5C11使XG2及Daudi細(xì)胞發(fā)生同型聚集在IL-6依賴性MM細(xì)胞株XG2及B淋巴瘤細(xì)胞株Daudi細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入1μg的5C11，在培養(yǎng)后24hrs，光鏡下觀察腫瘤細(xì)胞均呈明顯的同型聚集，并在48hrs后細(xì)胞凝集成團(tuán)如圖10所示。2)5C11使XG2和Daudi細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制在單抗處理后的XG2和Daudi細(xì)胞，光鏡下其除發(fā)生同型聚集外，生長(zhǎng)緩慢，經(jīng)不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞計(jì)數(shù)和凋亡率分析表明，5C11對(duì)XG2和Daudi細(xì)胞呈劑量依賴性生長(zhǎng)抑制，在5μg/ml已達(dá)最大抑制劑量，如圖11所示。3)5C11介導(dǎo)XG2細(xì)胞的凋亡5C11處理后的XG2細(xì)胞，24hrs鏡下觀察其形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞膜開始皺縮，細(xì)胞漿顆粒增多。隨即用Annexln-V測(cè)定，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡，如圖12所示。4)5C11處理增加了Daudi細(xì)胞的免疫原性流式細(xì)胞儀分析顯示XG2和Daudi細(xì)胞在激發(fā)型抗人CD40單抗處理后，發(fā)生一系列與免疫原性相關(guān)的粘附分子變化，如圖13所示，XG2細(xì)胞株CD54明顯增加，Daudi細(xì)胞在CD40分子激發(fā)后，CD58、CD95增加表達(dá)。5)激發(fā)型抗人CD40單抗5C11處理腫瘤細(xì)胞，增加其免疫原性，獲得了具有特異性殺傷功能的T淋巴細(xì)胞。如圖14所示，T細(xì)胞殺傷能力明顯增加。
權(quán)利要求
1.一種激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體的制備方法，其特征在于將高表達(dá)CD40分子的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株(XG2)為免疫原，免疫Balb/C小鼠；免疫小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠SP2/0細(xì)胞株進(jìn)行融和，以高表達(dá)CD40分子的腫瘤細(xì)胞株陽(yáng)性對(duì)照和不表達(dá)CD40分子的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株(XG7、XG1)陰性對(duì)照，用間接免疫熒光法對(duì)雜交瘤培養(yǎng)上清進(jìn)行篩選、蛋白鑒定及Ig亞類鑒定，經(jīng)復(fù)篩及亞克隆后獲得穩(wěn)定分泌特異鼠抗人CD40雜交瘤細(xì)胞株，并再體外持續(xù)傳代，分批凍存；規(guī)模化細(xì)胞培養(yǎng)或生產(chǎn)腹水、分離純化和單抗的特性鑒定并獲得激發(fā)型抗人CD40單抗純品。
2.如權(quán)利要求1所述的CD40單克隆抗體的制備方法，其特征在于高表達(dá)CD40分子的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株XG2陽(yáng)性對(duì)照和不表達(dá)CD40分子的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株XG7陰性對(duì)照，用間接免疫熒光法對(duì)雜交瘤培養(yǎng)上清進(jìn)行初步篩選、蛋白鑒定及Ig亞類鑒定；繼而用高表達(dá)CD40分子的B淋巴瘤細(xì)胞株Daudi陽(yáng)性對(duì)照和不表達(dá)CD40分子的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株XG1陰性對(duì)照，作進(jìn)一步篩選和鑒定。
3.如權(quán)利要求1所述的CD40單克隆抗體的制備方法，其特征在于采用有限稀釋法亞克隆。
4.激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體(5C11和2G11)用于B細(xì)胞體外擴(kuò)增。
5.激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體(5C11和2G11)用于誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞DCs分化成熟以及在體外激發(fā)T細(xì)胞。
6.激發(fā)型抗CD40單克隆抗體(5C11和2G11)用于誘導(dǎo)CD40表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、凋亡和提高其免疫原性。
7.如權(quán)利要求4所述的抗人CD40單克隆抗體5C11或2G11用于B細(xì)胞體外擴(kuò)增的方法，其特征在于在B細(xì)胞培養(yǎng)體系中，加入經(jīng)絲裂霉素5×107、50ug絲裂霉素/ml處理洗滌后LCD32 5×104細(xì)胞/ml，5C11或2G11 1ug/ml及人重組IL-4 100U/ml(購(gòu)自Diaclone公司法國(guó))。
8.如權(quán)利要求7所述的抗人CD40單克隆抗體5C11或2G11用于B細(xì)胞體外擴(kuò)增的方法，其特征在于在B細(xì)胞培養(yǎng)體系中再加入人重組IL-2 500U/ml(購(gòu)自上海華新公司)，人重組IL-6 1ng/ml及人重組FL 50ng/ml(購(gòu)自Immugene公司美國(guó))的不同組合。
9.如權(quán)利要求5所述的激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體(5C11和2G11)用于誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞DCs分化成熟以及在體外激發(fā)T細(xì)胞的方法，其特征在于取腫瘤患者或供血員新鮮外周血50～100ml用淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll/Paque)分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC)，將PBMNC貼壁培養(yǎng)、去除非貼壁細(xì)胞，在貼壁生長(zhǎng)的單核細(xì)胞中加入細(xì)胞因子人重組IL-4 100～1000U/ml、粒巨細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF 1000U/ml和激發(fā)型抗人CD40單抗CD40mAb-5C11或2G11 1～10μg/ml，若干天后收集獲得樹突狀細(xì)胞(DCs)。
10.如權(quán)利要求6所述的激發(fā)型抗CD40單克隆抗體(5C11和2G11)用于誘導(dǎo)CD40表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、凋亡和提高其免疫原性的方法，其特征在于(1).在腫瘤病人CD40陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中加入激發(fā)型抗人CD40單抗5C11或2G11 1～10微克/毫升，培養(yǎng)24～96小時(shí)。(2).T淋巴細(xì)胞的激發(fā)用淋巴細(xì)胞分離液分離獲得患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，將其按10～20∶1與經(jīng)激發(fā)型抗人CD40單抗處理(步驟1)的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，同時(shí)加入人重組白細(xì)胞介素-2(rhIL-2)500～1000U/毫升，培養(yǎng)7～14天，激發(fā)后的T細(xì)胞可回輸機(jī)體以過繼免疫治療腫瘤。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于步驟(1)中激發(fā)型抗人CD40單抗5C11或2G11的加入量為5微克/毫升。
全文摘要
本發(fā)明提供一種激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體的制備方法以及應(yīng)用,以高表達(dá)CD40分子的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株為免疫原,以不表達(dá)CD40分子的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株為陰性對(duì)照,經(jīng)免疫,細(xì)胞融合、篩選、鑒定獲得穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CD40的雜交瘤細(xì)胞株,制備抗腫瘤生物制劑。它不僅可使B細(xì)胞擴(kuò)增,還可以使外圍血來源的單核細(xì)胞擴(kuò)增和分化成熟為樹突狀細(xì)胞,以及激發(fā)T細(xì)胞的功能,擴(kuò)增和誘導(dǎo)DCs成熟一步完成,使臨床應(yīng)用成為可能。用單抗誘導(dǎo)CD40表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、凋亡及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞免疫原性,用于體外激發(fā)T淋巴細(xì)胞,并用于過繼治療腫瘤。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1333373SQ0111807
公開日2002年1月30日 申請(qǐng)日期2001年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月18日
發(fā)明者張學(xué)光, 周照華, 王江方, 邱玉華, 施勤 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所