專利名稱：大規(guī)模制備注射用中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗肝癌藥物制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及大規(guī)模制備中期因子反義寡合苷酸納米脂質(zhì)體的方法。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatoceIlular carcinoma, HCC)是一種高侵襲性、高轉(zhuǎn)移性的實(shí)體惡性腫瘤，但還缺乏理想的治療方法。 中期因子(midkine，MK)是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的促血管生成因子，它是一種具有促細(xì)胞轉(zhuǎn)化、促有絲分裂作用、促腫瘤血管生成、抗細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)纖維蛋白溶解等腫瘤形成相關(guān)活性的堿性肝素結(jié)合性蛋白質(zhì)，僅在胚胎中期和成年腎臟表達(dá)。已有的研究表明，在肝癌等許多人類腫瘤組織中MK mRNA及蛋白均呈高度表達(dá)，而各種正常組織僅有低水平表達(dá)或無(wú)表達(dá)，并與肝癌的發(fā)生、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，血管生成及預(yù)后密切相關(guān)，而血管生成是肝癌無(wú)限制侵襲，生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。因此，MK可能是抗血管生成治療肝癌的理想靶位。反義寡合苷酸是具有專一序列的寡聚脫氧核苷酸，能特異阻斷靶基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，是基因治療的一種方法。我們篩選的中期因子反義寡核苷酸(MK-AS0DN序列CCCCGGGCCGCCCTTCTTCA)已經(jīng)證實(shí)在體內(nèi)外具有明顯的抗肝癌作用，有希望成為一種新的肝癌治療靶點(diǎn)。但是，由于反義寡核苷酸為高度親水性物質(zhì)，表面帶有很強(qiáng)的負(fù)電荷，因此很難穿過(guò)細(xì)胞膜，并且在血液中容易被各種酶類降解而不穩(wěn)定，所以需要有合適的基因遞送載體將反義寡核苷酸遞送到靶細(xì)胞。脂質(zhì)體，是由磷脂雙層膜構(gòu)成的中空小球。早在1965年英國(guó)人Bangham就發(fā)現(xiàn)了脂質(zhì)體，此后人們發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體作為藥物載體有著巨大的價(jià)值，它能夠降低藥物本身的毒性并在一定程度上增強(qiáng)藥效。目前已經(jīng)上市的脂質(zhì)體藥物已有很多，如脂質(zhì)體兩性霉素(商品名AmBisome),脂質(zhì)體阿霉素(Myocet)和脂質(zhì)體柔紅霉素(DaunoXome),這些藥物都通過(guò)了 FDA的認(rèn)證，上市生產(chǎn)，因此，就脂質(zhì)體在臨床上使用的安全性已經(jīng)得到了肯定。1992年，Ropert首次將脂質(zhì)體用于ASODN的遞送，并制成了納米脂質(zhì)體。納米脂質(zhì)體是一種定向藥物載體，屬于靶向給藥系統(tǒng)的一種新劑型，不同粒徑大小的納米脂質(zhì)體可以聚積在不同的臟器，大部分的納米脂質(zhì)體會(huì)被動(dòng)靶向于肝臟，有利于MK-ASODN在肝臟中發(fā)揮作用。注射用中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體的規(guī)模化生產(chǎn)需要反義核酸和脂質(zhì)體都能進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)與制備。隨著DNA自動(dòng)合成儀的發(fā)展,反義寡核苷酸的一次合成量已經(jīng)達(dá)到lOOOmmol/L，完全可以達(dá)到規(guī)?；a(chǎn)的級(jí)別。而脂質(zhì)體的制備方法經(jīng)歷了 20多年的發(fā)展，分別有薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法，去污劑透析法、溶劑注入法等，很多方法都只能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的小試。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種大規(guī)模制備注射用中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體的方法，該方法主要是建立在溶劑注入法的基礎(chǔ)之上，形成一個(gè)自動(dòng)化的過(guò)程，還克服了傳統(tǒng)的溶劑注入法中規(guī)模小、根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的注射用中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體，粒徑在10(T500nm之間，性質(zhì)穩(wěn)定，抗肝癌作用顯著增強(qiáng)。過(guò)程簡(jiǎn)單，容易實(shí)現(xiàn)，且非常容易放大，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是該方法包括以下步驟 (1)制備脂質(zhì)溶液該脂質(zhì)溶液是由包含二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和 3-β-[Ν- (N’，Ν’ -二甲基氨基乙基)]氨甲酰基膽固醇(DC-Chol)的原料溶解到有機(jī)溶劑中，攪拌至溶液澄清透明，有機(jī)溶劑的用量使陽(yáng)離子脂質(zhì)和磷脂恰好完全溶解，得脂質(zhì)溶液，溶液溫度為2(T60°C，上述原料摩爾百分比組成為二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)5-95%、3-13 -[N- (N’，N’- 二甲基氨基乙基)]氨甲酰基膽固醇(DC-Chol) 95-5% ；(2)采用交叉流技術(shù)使脂質(zhì)溶液與水化溶劑按體積比1:50 3 17混合，混合后得到的粗脂質(zhì)體通過(guò)超聲儀超聲，初步分散，通過(guò)施壓將脂質(zhì)體通過(guò)鋪有聚碳酸脂膜的擠壓器統(tǒng)一粒徑；(3)流出的脂質(zhì)體混懸液通過(guò)超濾器超濾，除去有機(jī)溶劑，超濾時(shí)連續(xù)補(bǔ)充脂質(zhì)體水化溶劑，得到空白的納米脂質(zhì)體，制成的納米脂質(zhì)體過(guò)濾除菌分裝后備用或添加凍干保護(hù)劑后凍干，液體于在2-8°C保存，凍干品于_20°C以下保存；(4)將中期因子反義寡核苷酸(MK-ASODN)按照溶解在水化溶劑中，得MK-ASODN溶液，將步驟(3)得到脂質(zhì)體溶液和MK-ASODN溶液按照電荷比1:1 5 :1混合或是直接將 MK-ASODN溶液加入納米脂質(zhì)體凍干品混合得到MK-ASODN納米脂質(zhì)體，其中MK-ASODN的序列為 CCCCGGGCCGCCCTTCTTCA。
所述的MK-ASODN的序列是我們篩選到有效的中期因子反義寡核苷酸 CCCCGGGCCGCCCTTCTTCA。針對(duì)MK的反義核酸有不同的反義活性，但是它們之間的理化性質(zhì)很相似，如分子量大、水溶性高、帶負(fù)電荷，而且均需要載體才能發(fā)揮作用，本發(fā)明中所述交叉流技術(shù)是指水化溶劑與脂質(zhì)溶液在高速下產(chǎn)生交叉碰撞形成納米脂質(zhì)體，水化溶劑與脂質(zhì)混合物溶液經(jīng)過(guò)高速交叉碰撞后，再經(jīng)過(guò)具有超聲波功能的容器超聲形成粗脂質(zhì)體，初步分散，超濾除去納米脂質(zhì)體中的有機(jī)溶劑并可以將脂質(zhì)體濃縮到合適的濃度，擠壓器用于統(tǒng)一納米脂質(zhì)體的粒徑并當(dāng)膜的孔徑小于O. 22um的時(shí)候起到除菌的作用。
所述步驟(2)和步驟(4)中的水化溶劑為磷酸鹽緩沖液、水、Tris緩沖液或枸櫞酸緩沖液。
所述步驟(4)中MK-ASODN納米脂質(zhì)體pH為4. 0-9. O，所獲得的納米脂質(zhì)體帶正電荷。
所述步驟(I)中的有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、叔丁醇中的單一溶劑，或其中的兩種或兩種以上溶劑制成的混合溶劑；
進(jìn)一步，所述步驟(2)中使用的聚碳酸脂膜的孔徑為5(T400nm，層數(shù)f 10層。所述步驟(4)得到的脂質(zhì)體以液態(tài)保存或制為凍干品，凍干保護(hù)劑為乳糖、海藻糖、葡萄糖、蔗糖或甘露醇，凍干保護(hù)劑濃度在5%-25% (g/ml)。所述步驟(3)所述超聲儀為水浴超聲法或者探頭超聲。所述步驟(3)脂質(zhì)溶液與水化溶劑按體積比1:49混合。所述步驟(4)是將中期因子反義寡核苷酸(MK-ASODN)按照溶解在水化溶劑中，得MK-ASODN溶液，將步驟(3)得到脂質(zhì)體溶液和MK-ASODN溶液按照電荷比1:1混合。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備方法采用常用的設(shè)備如超聲儀、超濾器、擠壓器等連 接起來(lái)，在溶劑注入法的基礎(chǔ)上，建立了一種自動(dòng)化地可以大規(guī)模生產(chǎn)注射用中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體的方法，該脂質(zhì)體是由陽(yáng)離子脂質(zhì)、兩性磷脂和MK-ASODN組成的，顯著地提高了 MK-ASODN的療效，實(shí)現(xiàn)了 MK-ASODN的靶向運(yùn)輸。


圖1為中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體電鏡圖。圖2為中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體粒徑。圖3為中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體包封率電泳圖。(圖3 中泳道 I =Mark,泳道 2 :裸 ASODN，泳道 3 Lipo/AS0DN=l :1，泳道 4 =Lipo/AS0DN=2 :1，泳道 5 Lipo/AS0DN=3 :1，泳道 6 Lipo/AS0DN=4 :1，泳道 7 Lipo/AS0DN=5 :1，泳道 8 Lipo/AS0DN=6 :1。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，但并不將本發(fā)明局限于這些具體實(shí)施方式
。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明涵蓋了權(quán)利要求書范圍內(nèi)所可能包括的所有備選方案、改進(jìn)方案和等效方案。本發(fā)明中
DOPE :二油酰磷脂酰乙醇胺；
DC-Chol 3-β-[Ν- (N’，N’ -二甲基氨基乙基)]氨甲酰基膽固醇。MK-ASODN :中期因子反義寡核苷酸
實(shí)施例1:制備IOOml注射用中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體
原料DC-CholIOOmg
DOPEIOOmg
MK-ASODN5. 5g
甲醇+無(wú)水乙醇5ml
葡萄糖Sg。
制備方法
(I)將DC-Chol和DOPE在溫度45°C條件下，加甲醇無(wú)水乙醇(v/v=l:1)攪拌，至溶液澄清透明，得脂質(zhì)溶液，在45°C條件下保溫；(2)隨后采用交叉流技術(shù)使脂質(zhì)溶液與水按一定比例快速混合，體積比小于317,即低于15%的體積百分比濃度，混合后得到的脂質(zhì)體通過(guò)探頭式超聲儀超聲(功率為200w， 超聲100次，超聲ls，間歇2s)，再通過(guò)高壓輸液泵使脂質(zhì)體經(jīng)過(guò)鋪有I張O.1 μ m的聚碳酸脂膜的擠壓器擠壓5次來(lái)統(tǒng)一粒徑；(3)流出的脂質(zhì)體混懸液立即通過(guò)超濾器超濾，除去有機(jī)溶劑，中間不斷補(bǔ)充水溶液， 約為脂質(zhì)體的5倍體積，得到空白的納米脂質(zhì)體，制成的納米脂質(zhì)體添加8%的葡萄糖后凍干，于在2-8 °C保存。
(4)將5. 5g中期因子反義寡核苷酸(MK-ASODN)溶解在IOOml的水溶液中，pH為 7. 0，得MK-ASODN溶液，將MK-ASODN溶液直接加入凍干品中，使兩者按需求充分混合，一般地按照電荷比I ; I混合，重建脂質(zhì)體的過(guò)程中將MK-ASODN包封進(jìn)去，得到MK-ASODN納米脂質(zhì)體。
實(shí)施例2 :制備500ml注射用中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體原料DC-Chol500mgDOPE36.44mgMK-ASODN2. 79mg無(wú)水乙醇IOml甘露醇25g。
制備方法將DC-Chol和DOPE在溫度20°C條件下，滴加無(wú)水乙醇攪拌，至溶液澄清透明，得脂質(zhì)溶液，隨后采用交叉流技術(shù)使脂質(zhì)溶液與磷酸緩沖液按一定比例快速混合，混合后得到的脂質(zhì)體通過(guò)水浴超聲(功率為120w，超聲5min)，再通過(guò)高壓輸液泵使脂質(zhì)體經(jīng)過(guò)鋪有5張 O .1 μ m的聚碳酸脂膜的擠壓器擠壓2次統(tǒng)一粒徑；流出的脂質(zhì)體混懸液立即通過(guò)超濾器超濾，除去有機(jī)溶劑，中間不斷補(bǔ)充脂質(zhì)體水化液約為脂質(zhì)體的5倍體積，最后得到納米脂質(zhì)體，制成的納米脂質(zhì)體添加5%的甘露醇后凍干，于在_20°C保存。將中期因子反義寡核苷酸(MK-ASODN)溶解在500ml的磷酸鹽緩沖液中，pH為7. 4，得MK-ASODN溶液，溫度保持在 200C，將MK-ASODN溶液直接加入凍干品中，使兩者按一定比例充分混合。
實(shí)施例3 :制備IOOOml注射用中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體原料DC-CholIOOOmgDOPE72.88mgMK-ASODN5.58mg甲醇20ml。
制備方法將DC-Chol和DOPE在溫度40°C條件下，加無(wú)水乙醇攪拌，至溶液澄清透明，得脂質(zhì)溶液，隨后采用交叉流技術(shù)使脂質(zhì)溶液與Tris緩沖液按按一定比例快速混合，混合后得到的脂質(zhì)體通過(guò)水浴超聲(功率為120w，超聲IOmin)，再通過(guò)高壓輸液泵使MK-ASODN脂質(zhì)體經(jīng)過(guò)鋪有10張O. 2 μ m的聚碳酸脂膜的擠壓器統(tǒng)一粒徑；流出的脂質(zhì)體混懸液立即通過(guò)超濾器超濾，除去有機(jī)溶劑，中間不斷補(bǔ)充Tris緩沖液，約為脂質(zhì)體的6倍體積，最后得到納米脂質(zhì)體，于2-8°C保存；將中期因子反義寡核苷酸(MK-ASODN)溶解在Tris緩沖液中，pH 為9. 0，得MK-ASODN溶液，將MK-ASODN溶液直接按一定比例和納米脂質(zhì)體充分混合，得到MK-ASODN納米脂質(zhì)體。實(shí)施例4 :制備5L注射用中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體
權(quán)利要求
1.一種大規(guī)模制備注射用中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)制備脂質(zhì)溶液該脂質(zhì)溶液是由包含二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和 3-β-[Ν- (N’，Ν’ -二甲基氨基乙基)]氨甲酰基膽固醇(DC-Chol)的原料溶解到有機(jī)溶劑中，攪拌至溶液澄清透明，有機(jī)溶劑的用量使陽(yáng)離子脂質(zhì)和磷脂恰好完全溶解，得脂質(zhì)溶液，溶液溫度為2(T60°C，上述原料摩爾百分比組成為二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)5-95%、3-13 - [N- (N’，N’ - 二甲基氨基乙基)]氨甲?；懝檀?DC-Chol) 95-5% ；(2)采用交叉流技術(shù)使脂質(zhì)溶液與水化溶劑按體積比1:50 3 :17混合，混合后得到的粗脂質(zhì)體通過(guò)超聲儀超聲，初步分散，通過(guò)施壓將脂質(zhì)體通過(guò)鋪有聚碳酸脂膜的擠壓器統(tǒng)一粒徑；(3)流出的脂質(zhì)體混懸液通過(guò)超濾器超濾，除去有機(jī)溶劑，超濾時(shí)連續(xù)補(bǔ)充脂質(zhì)體水化溶劑，得到空白的納米脂質(zhì)體，制成的納米脂質(zhì)體過(guò)濾除菌分裝后備用或添加凍干保護(hù)劑后凍干，液體于在2-8°C保存，凍干品于_20°C以下保存；(4)將中期因子反義寡核苷酸(MK-ASODN)按照溶解在水化溶劑中，得MK-ASODN溶液，將步驟(3)得到脂質(zhì)體溶液和MK-ASODN溶液按照電荷比1:1 5 :1混合或是直接將 MK-ASODN溶液加入納米脂質(zhì)體凍干品混合得到MK-ASODN納米脂質(zhì)體，其中MK-ASODN的序列為 CCCCGGGCCGCCCTTCTTCA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大規(guī)模制備注射用中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體的方法，其特征在于所述步驟(2)和步驟(4)中的水化溶劑為磷酸鹽緩沖液、水、Tris緩沖液或枸櫞酸緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大規(guī)模制備注射用中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體的方法，其特征在于所述步驟(4)中MK-ASODN納米脂質(zhì)體pH為4. 0-9. 0，所獲得的納米脂質(zhì)體帶正電荷。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大規(guī)模制備注射用中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體的方法，其特征在于所述步驟(I)中的有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、叔丁醇中的單一溶劑，或其中的兩種或兩種以上溶劑制成的混合溶劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大規(guī)模制備注射用中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體的方法，其特征在于所述步驟(2)中使用的聚碳酸脂膜的孔徑為5(T400nm，層數(shù)f 10層。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的大規(guī)模制備注射用中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體的方法，其特征在于所述步驟(4)得到的脂質(zhì)體以液態(tài)保存或制為凍干品，凍干保護(hù)劑為乳糖、 海藻糖、葡萄糖、蔗糖或甘露醇，凍干保護(hù)劑濃度在5%-25% (g/ml)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的大規(guī)模制備注射用中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體的方法，其特征在于步驟(3)所述超聲儀為水浴超聲法或者探頭超聲。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的大規(guī)模制備注射用中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體的方法，其特征在于步驟(3)脂質(zhì)溶液與水化溶劑按體積比1:49混合。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的大規(guī)模制備注射用中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體的方法，其特征在于步驟(4)是將中期因子反義寡核苷酸(MK-ASODN)按照溶解在水化溶劑中， 得MK-ASODN溶液，將步驟(3)得到脂質(zhì)體溶液和MK-ASODN溶液按照電荷比1:1混合。
全文摘要
大規(guī)模制備注射用中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體的方法，本發(fā)明將陽(yáng)離子脂質(zhì)和磷脂的脂質(zhì)混合物溶解于有機(jī)溶劑中，得到脂質(zhì)溶液，然后用超聲儀對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行初步分散，并通過(guò)超濾除去有機(jī)溶劑，最后在高壓下用擠壓器擠壓統(tǒng)一粒徑，得到空白的納米脂質(zhì)體；然后和MK-ASODN溶液混合得到MK-ASODN納米脂質(zhì)體，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的注射用中期因子反義寡核苷酸納米脂質(zhì)體，粒徑在100～500nm之間，性質(zhì)穩(wěn)定，抗肝癌作用顯著增強(qiáng)。本工藝過(guò)程簡(jiǎn)單，容易實(shí)現(xiàn)，且非常容易放大，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102989007SQ201210226878
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月29日
發(fā)明者戴利成, 鐘婧 申請(qǐng)人:湖州市中心醫(yī)院