專利名稱：膠原蛋白水溶液靜電紡絲制備納米纖維的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種膠原蛋白水溶液靜電紡絲制備納米纖維的方法，屬于生物醫(yī)用材料、組織工程支架和藥物緩釋材料的制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
紡絲技術(shù)中膠原蛋白的靜電紡絲是最令人關(guān)注的問題之一。膠原蛋白是動物結(jié)締組織的重要組成部分，存在于組織與器官中。作為一種天然大分子，用作生物材料具有促進細胞生長、低抗原性、生物可降解性等等一系列的優(yōu)點。在組織工程、藥物緩釋以及醫(yī)療器 械等研究與開發(fā)中，獲得膠原蛋白納米級纖維富有吸引力，它是這些研究工作或產(chǎn)品開發(fā)的基礎(chǔ)。令人遺憾的是，膠原蛋白的靜電紡絲至今仍未找到滿意的技術(shù)方法。靜電紡絲技術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)之一就是大分子溶液的溶劑體系，對于易變性的蛋白質(zhì)(如膠原蛋白)來說尤為重要。2002年Jamil A. Matthews用六氟異丙醇(HFP)作溶劑，首次將膠原蛋白的六氟異丙醇溶液用靜電紡絲方法得到納米纖維(JamilA. Matthews, Gary E.Wnekj David G.Simpson,and Gary L.Bowlin. Electrospinningof Collagen Nanofibers. Biomacromolecules· 2002:3:232-238)。但隨后 Dimitrios等研究發(fā)現(xiàn)，用六氟異丙醇作溶劑得到的纖維部分喪失了膠原蛋白分子三螺旋結(jié)構(gòu)特性，以至于認為膠原蛋白含氟溶劑體系的靜電紡絲是一種昂貴的制備明膠纖維方法(Dimitrios I. Zeugolis, Shih T. Khew d, Elijah S. Y. Yew, Andrew K. Ekaputra, Yenff. Tong, Lin-Yue L. Yung, Dietmar ff. Hutmacher, Colin Sheppard, Michael Raghunat.Electro-spinning of pure collagen nano-fibres:Just an expensive way to makegelatin Biomaterials. 2008:29:2293-2305)。2009 年 Gary E Wnek 設(shè)討種新的憐酸鹽緩沖液(PBS)/乙醇溶劑體系進行膠原蛋白靜電紡絲，這種方法是想通過高濃度的PBS提高溶液的導(dǎo)電率，乙醇加快溶劑揮發(fā)速度(Bin Dong, Olivier Arnoult, Meghan E. Smith, GaryE. ffnek. Electrospinning of Collagen Nanofiber Scaffolds from Benign Solvents.MacromoI. Rapid Commun. 2009:30:539-542)。但是高濃度的PBS會很快使膠原蛋白凝膠化，并堵塞噴絲口。同時切除掉端肽之后的重建膠原，很容易在有機溶劑(乙醇等)中變性。靜電紡絲過程中溶劑及產(chǎn)品中殘余溶劑的毒性是用各種含氟溶劑面臨的極難解決的問題。無論靜電紡絲過程中加入細胞、細胞因子或生長因子，或紡絲產(chǎn)品作為藥物、基因載體、細胞支架及器械，溶劑或殘余溶劑的毒性(如各種含氟溶劑)都是不可忽視的問題，各種除去靜電紡絲產(chǎn)品殘余溶劑方法都可能導(dǎo)致膠原變性、生長因子失活、細胞死亡。由此可見，溶劑體系使膠原蛋白變性、殘留物細胞毒性、凝膠堵塞以及價格昂貴等等問題阻礙了膠原蛋白靜電紡絲，尋找或發(fā)明一種新的能保證膠原蛋白活性的，無細胞毒性的、價格低廉的溶劑體系用于膠原蛋白靜電紡絲有著十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種膠原蛋白水溶液靜電紡絲制備納米纖維的方法，其特點是該方法采用膠原蛋白的酸性水溶液進行靜電紡絲，制備得到膠原蛋白納米纖維，具有不變性、理化性質(zhì)穩(wěn)定、無細胞毒性、具生物活性以及成本低廉的優(yōu)點。本發(fā)明的目的由以下技術(shù)措施實現(xiàn)，其中所述原料份數(shù)除特殊說明外均為重量份數(shù)。
膠原蛋白納米纖維的制備方法包括以下步驟(I)膠原蛋白靜電紡絲原液的制備將分子量大于或等于250KDa的重建膠原蛋白纖維20 300重量份,加入到用酸調(diào)節(jié)pH值為2 4的酸性水溶液1000重量份中，在溫度4 30°C，采用磁力或機械攪拌溶解成均勻的溶液，制得靜電紡絲原液；(2)膠原蛋白納米纖維的靜電紡絲將上述靜電紡絲原液在電場強度為140 360KV/m ;噴絲孔直徑為5 7mm ;接收距離為5 9cm ;紡絲速率為O. 2 O. 5ml/h的條件下進行靜電紡絲，獲得膠原蛋白納米纖維。所述重建膠原蛋白纖維的分子量大于或等于250KDa。所述的酸為檸檬酸、甲酸、醋酸、草酸、乳酸、磷酸、鹽酸、硝酸、硫酸及其上述酸的金屬鹽中的至少一種。所述膠原蛋白納米纖維的制備方法制備得到的膠原蛋白納米纖維。所述膠原蛋白納米纖維用于生物醫(yī)用材料、組織工程、藥物緩釋、納米傳感器和過濾領(lǐng)域。性能測試I、采用掃描電鏡觀察膠原纖維如圖I所示，結(jié)果表明膠原纖維為納米級纖維。2、采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的方法分析如圖2所示，結(jié)果表明膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)較完整，與未經(jīng)過靜電紡絲過程的膠原蛋白比較，變性率小于10%。3、采用紅外光譜分析如圖3所示，結(jié)果表明膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)較完整，與未經(jīng)過靜電紡絲過程的膠原蛋白比較，變性率小于20%。本發(fā)明具有如下優(yōu)點膠原蛋白納米纖維的制備過程無毒、無污染，制備得到的膠原蛋白納米纖維變性程度低、理化性質(zhì)穩(wěn)定、無細胞毒性、具有生物活性及成本低廉的優(yōu)點。


圖I為膠原蛋白靜電紡絲纖維掃描電鏡照片純膠原納米纖維，纖維直徑范圍為60_300nm。圖2為酸性溶液和HFP溶液靜電紡絲后膠原蛋白材料的SDS-PAGE分析圖a :膠原對照樣，b :主要溶劑為六氟異丙醇(HFP)，c :主要溶劑為醋酸。d, e, f分別是a，b，c胃蛋白酶處理后的樣品材料。
變性率的計算方法為胃蛋白酶處理后α I帶含量減少的百分比。圖3為酸性溶液和HFP溶液靜電紡絲膠原蛋白后材料的紅外光譜分析圖NC :膠原對照樣，HFP :主要溶劑為六氟異丙醇，HAc :主要溶劑為醋酸，Gelatin 明膠。變性率的計算方法以A( 123501^)/^(14500^1)的比值在I. O左右時，膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)保持完整，完全降解的明膠(認為三螺旋結(jié)構(gòu)不存在)R = A(1235cm-1)/A(1450cm-1)比值在O. 5為基準(zhǔn)計算。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，有必要在此指出的是本實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容對本發(fā)明做出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。 實施例I膠原蛋白納米纖維的制備方法包括以下步驟(I)膠原蛋白靜電紡絲原液的制備將分子量大于或等于250KDa的重建膠原蛋白纖維20mg，加入到用醋酸調(diào)節(jié)pH值為2的酸性水溶液Ig中，在溫度30°C，采用磁力或機械攪拌溶解成均勻的溶液，制得靜電紡絲原液；(2)膠原蛋白納米纖維的靜電紡絲將上述靜電紡絲原液在電場強度為360KV/m ;噴絲孔直徑為5mm ;接收距離為9cm ；紡絲速率為O. 2ml/h，進行靜電紡絲，獲得膠原蛋白納米纖維。實施例2膠原蛋白納米纖維的制備方法包括以下步驟(I)膠原蛋白靜電紡絲原液的制備將分子量大于或等于250KDa的重建膠原蛋白纖維25mg，加入到用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2的酸性水溶液Ig中，在溫度20°C，采用磁力或機械攪拌溶解成均勻的溶液，制得靜電紡絲原液；(2)膠原蛋白納米纖維的靜電紡絲將上述靜電紡絲原液在電場強度為340KV/m ;噴絲孔直徑為6mm ;接收距離為7cm ；紡絲速率為O. 4ml/h，進行靜電紡絲，獲得膠原蛋白納米纖維。實施例3膠原蛋白納米纖維的制備方法包括以下步驟(I)膠原蛋白靜電紡絲原液的制備將分子量大于或等于250KDa的重建膠原蛋白纖維lOOmg，加入到用檸檬酸調(diào)節(jié)pH值為3的酸性水溶液Ig中，在溫度10°C，采用磁力或機械攪拌溶解成均勻的溶液，制得靜電紡絲原液；(2)膠原蛋白納米纖維的靜電紡絲將上述靜電紡絲原液在電場強度為280KV/m ;噴絲孔直徑為7mm ;接收距離為8cm ；紡絲速率為O. 3ml/h，進行靜電紡絲，獲得膠原蛋白納米纖維。
實施例4膠原蛋白納米纖維的制備方法包括以下步驟(I)膠原蛋白靜電紡絲原液的制備將分子量大于或等于250KDa的重建膠原蛋白纖維200mg，加入到用磷酸調(diào)節(jié)pH值為2. 5的酸性水溶液Ig中，在溫度4°C，采用磁力或機械攪拌溶解成均勻的溶液，制得靜電紡絲原液；(2)膠原蛋白納米纖維的靜電紡絲將上述靜電紡絲原液在電場強度為220KV/m ;噴絲孔直徑為5mm ;接收距離為8cm ；紡絲速率為O. 4ml/h，進行靜電紡絲，獲得膠原蛋白納米纖維。
實施例5膠原蛋白納米纖維的制備方法包括以下步驟(I)膠原蛋白靜電紡絲原液的制備將分子量大于或等于250KDa的重建膠原蛋白纖維250mg，加入到用醋酸和醋酸鈉調(diào)節(jié)PH值為3. 5的酸性水溶液Ig中，在溫度15°C，采用磁力或機械攪拌溶解成均勻的溶液，制得靜電紡絲原液；(2)膠原蛋白納米纖維的靜電紡絲將上述靜電紡絲原液在電場強度為180KV/m ;噴絲孔直徑為6mm ;接收距離為7cm ；紡絲速率為O. 5ml/h，進行靜電紡絲，獲得膠原蛋白納米纖維。實施例6膠原蛋白納米纖維的制備方法包括以下步驟(I)膠原蛋白靜電紡絲原液的制備將分子量大于或等于250KDa的重建膠原蛋白纖維300mg，加入到用乳酸調(diào)節(jié)pH值為4的酸性水溶液Ig中，在溫度25°C，采用磁力或機械攪拌溶解成均勻的溶液，制得靜電紡絲原液；(2)膠原蛋白納米纖維的靜電紡絲將上述靜電紡絲原液在電場強度為140KV/m ;噴絲孔直徑為7mm ;接收距離為9cm ；紡絲速率為O. 4ml/h，進行靜電紡絲，獲得膠原蛋白納米纖維。
權(quán)利要求
1.膠原蛋白納米纖維的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟 (1)膠原蛋白靜電紡絲原液的制備 將分子量大于或等于250KDa的重建膠原蛋白纖維20 300重量份，加入到用酸調(diào)節(jié)PH值為2 4的酸性水溶液1000重量份中，在溫度4 30°C，采用磁力或機械攪拌溶解成均勻的溶液，制得靜電紡絲原液； (2)膠原蛋白納米纖維的靜電紡絲 將上述靜電紡絲原液在電場強度為14(T360KV/m，噴絲孔直徑為5 7mm，接收距離為5 9cm，紡絲速率為O. 2 O. 5ml/h的條件下進行靜電紡絲，獲得膠原蛋白納米纖維。
2.如權(quán)利要求I所述膠原蛋白納米纖維的制備方法，其特征在于所述重建膠原蛋白纖維的分子量大于或等于250KDa。
3.如權(quán)利要求I所述膠原蛋白納米纖維的制備方法，其特征在于所述的酸為檸檬酸、甲酸、醋酸、草酸、乳酸、磷酸、鹽酸、硝酸、硫酸及其上述酸的金屬鹽中的至少一種。
4.如權(quán)利要求I所述膠原蛋白納米纖維的制備方法制備得到的膠原蛋白納米纖維。
5.如權(quán)利要求4所述膠原蛋白納米纖維用于生物醫(yī)用材料、組織工程、藥物緩釋、納米傳感器和過濾領(lǐng)域。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種膠原蛋白水溶液靜電紡絲制備納米纖維的方法，其特點是將分子量大于或等于250KDa的重建膠原蛋白纖維20～300重量份，加入到用酸調(diào)節(jié)pH值為2~4的酸性水溶液1000重量份中，在溫度4~30℃，采用磁力或機械攪拌溶解成均勻的溶液，制得靜電紡絲原液；再將上述靜電紡絲原液在電場強度為140~360kV/m；噴絲孔直徑為5~7mm；接收距離為5～9cm；紡絲速率為0.2～0.5ml/h，進行靜電紡絲，獲得膠原蛋白納米纖維。該膠原蛋白納米纖維的制備過程無毒、無污染，制備得到的膠原蛋白納米纖維變性程度低、理化性質(zhì)穩(wěn)定、無細胞毒性、具有生物活性及成本低廉的優(yōu)點。
文檔編號D01D5/00GK102877147SQ201210355709
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月24日
發(fā)明者蔣波, 萬法盛, 李霞, 陳露, 李莉莉 申請人:四川大學(xué)