專利名稱：靜電紡絲制備納米纖維酶膜的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米材料制備技術(shù)和生物合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種靜電紡絲制備納米纖維酶膜的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
茶氨酸是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的生理、生化功能外，還具有很好的保健功能和藥理作用，具有抗腫瘤、抗癌功效，還能夠有效預(yù)防腦栓塞、腦中風(fēng)、腦缺血以及老年癡呆疾病等，因此有廣泛的應(yīng)用前景。由于茶氨酸的自然資源有限，所以茶氨酸的合成與制備一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。在國(guó)外，目前茶氨酸主要以酶法轉(zhuǎn)化工業(yè)化生產(chǎn)，而國(guó)內(nèi)，除了有化學(xué)合成的制品外，天然茶葉中提取的產(chǎn)品，純度不高于40%，所以高純度生物制品主要依賴進(jìn)口。日本已利用固定化微生物細(xì)胞技術(shù)酶法工業(yè)化大量合成茶氨酸，通過κ-卡拉膠固定假單胞菌，利用谷氨酰胺酶催化合成茶氨酸，但是轉(zhuǎn)化效率低，所以仍存在如何進(jìn)一步提高催化效率、降低成本等問題。因此，選擇先進(jìn)的細(xì)胞固定化技術(shù)提高催化效率，是實(shí)現(xiàn)茶氨酸高效合成的研究關(guān)鍵。由于用靜電紡絲的方法制備納米纖維具有多孔性和連通性等諸多優(yōu)勢(shì)，在納米纖維制備領(lǐng)域備受青睞。目前，由于納米纖維在催化、生物醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等方面的廣泛用途，其越來越被人們關(guān)注。這些應(yīng)用不僅取決于靜電紡絲技術(shù)的一些參數(shù)設(shè)計(jì)，更加取決于用靜電紡絲技術(shù)制備的納米纖維作為載體所固定化的物質(zhì)。已經(jīng)報(bào)道的用靜電紡絲的方法制備納米纖維固定化脂肪酶的方法，主要通過共紡的方法將酶固定在聚合物載體上，來提高酶的回收率重復(fù)利用率。目前未見有報(bào)道關(guān)于用靜電紡絲的方法制備的納米纖維固定化谷氨酰胺合成酶方面的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種靜電紡絲制備納米纖維酶膜的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提出的靜電紡絲制備納米纖維酶膜的方法，具體步驟如下
(1)稱取聚乙烯醇(PVA)溶解于去離子水中，控制PVA濃度為5-12%(w/v，g/ml), 80°C下攪拌1-4小時(shí)至完全溶解，冷卻至室溫，加入谷氨酰胺合成酶(GQ水溶液，得到GS/ PVA混合紡絲液，室溫?cái)嚢?，谷氨酰胺合成酶水溶液與聚乙烯醇溶液的體積比為1:9-1 1 ；
(2)將步驟(1)所得的振蕩均勻的溶液分別加入注射器內(nèi)，裝上直徑0.6-1. 2mm針頭， 調(diào)整針頭到接收器的距離為5-20cm，調(diào)節(jié)電壓在10-23kv，紡絲溶液流速控制在0. 2_6ml/ h，紡絲l_8h，將制備的薄膜放入真空干燥箱，4°C真空干燥12小時(shí)以上，即得所需產(chǎn)品。本發(fā)明中，步驟(1)中所述攪拌時(shí)間為25-35分鐘。本發(fā)明提出的納米纖維酶膜用于生物催化合成茶氨酸，具體步驟如下
將納米纖維酶膜(l-5g)加入到含有10-50 mmol L—1谷氨酸鈉，5_15 mmol L—1鹽酸乙胺，10-50 mmol I71 氯化鎂，10-50 mmol Γ1 2-巰基乙醇和5-20 mmol Γ1 ATP二鈉鹽的 100mrnolL-1 Tris-HCl緩沖溶液中，在水浴中50_150rpm振蕩反應(yīng)10_60min ；然后在 10000rpm，4°C下離心8-12min，除去沉淀，收集上清液，即得所需產(chǎn)品。本發(fā)明中，Tris-HCl緩沖溶液的pH值為6-9。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于
1. 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了利用靜電紡絲技術(shù)制備谷氨酰胺合成酶膜納米纖維生物催化合成茶氨酸的方法，為靜電紡絲技術(shù)提供了新的應(yīng)用領(lǐng)域。2.本發(fā)明采用的聚合物是最終能夠降解，對(duì)環(huán)境污染小，是一種環(huán)保的工藝。3.本發(fā)明的工藝簡(jiǎn)單，整個(gè)制備系統(tǒng)容易構(gòu)建，操作簡(jiǎn)便，條件易控，成本低廉， 產(chǎn)物的生態(tài)學(xué)特征容易調(diào)控，且可以回收方便，可以重復(fù)利用，適合于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。4.本發(fā)明制備的酶膜納米纖維具有較好的生物相容性，在生物催化，組織工程有較為廣闊的發(fā)展前景和應(yīng)用空間。


圖1為實(shí)施例1的GS/PVA靜電紡絲納米纖維的掃描電鏡圖。圖2為實(shí)施例3溫度對(duì)固定化酶活性的影響。圖3為實(shí)施例4的pH對(duì)固定化酶活性的影響。圖4為實(shí)施例5催化反應(yīng)時(shí)間對(duì)固定化酶活性的影響。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例1
(1)稱取聚乙烯醇(PVA)溶解于去離子水中，控制PVA濃度為8% (w/v，g/ml)，80°C 下攪拌2小時(shí)至完全溶解，冷卻至室溫，加入谷氨酰胺合成酶(GQ水溶液，得到GS/PVA混合紡絲液，室溫?cái)嚢?0分鐘。(2)將振蕩均勻的溶液分別加入注射器內(nèi)，裝上直徑0.9 mm針頭，調(diào)整針頭到接收器的距離為12cm，調(diào)節(jié)電壓在21kv，紡絲溶液流速控制在0. 5ml/h，紡絲4 h，得到谷氨酰胺合成酶膜納米纖維(見圖1)，將制備的薄膜放入真空干燥箱，4°C真空干燥過夜。(3)將上述制備的納米纖維加入到含有25 mmol廠1谷氨酸鈉，10 mmol L—1鹽酸乙胺，25讓ol L4氯化鎂，25讓ol Γ1 2-巰基乙醇和10讓ol Γ1 ATP 二鈉鹽的100 mmolL"1 Tris-HCl (pH 7. 5)緩沖溶液中，在30°C水浴中IOOrpm振蕩反應(yīng)20min ；然后在IOOOOrpm, 4°C下離心lOmin，除去沉淀，收集上清液。實(shí)施例2
(1)稱取聚乙烯醇(PVA)溶解于去離子水中，控制PVA濃度為8% (w/v，g/ml)，80°C 下攪拌2小時(shí)至完全溶解，冷卻至室溫，加入谷氨酰胺合成酶(GQ水溶液，得到GS/PVA混合紡絲液(GS:PVA體積比為3:7)，室溫?cái)嚢?0分鐘。(2)將振蕩均勻的溶液分別加入注射器內(nèi)，裝上直徑0.9 mm針頭，調(diào)整針頭到接收器的距離為12cm，調(diào)節(jié)電壓在21kv，紡絲溶液流速控制在0. 5ml/h，紡絲4 h，將制備的薄膜放入真空干燥箱，4 °C真空干燥過夜。(3)將上述制備的納米纖維加入到含有25 mmol廠1谷氨酸鈉，10 mmol L—1鹽酸乙胺，25讓ol L4氯化鎂，25讓ol Γ1 2-巰基乙醇和10讓ol Γ1 ATP 二鈉鹽的100 mmolL-1 Tris-HCl (pH 7. 5)緩沖溶液中，在30°C水浴中IOOrpm振蕩反應(yīng)20min ；然后在IOOOOrpm, 4°C下離心lOmin，除去沉淀，收集上清液，得到茶氨酸。實(shí)施例3
將實(shí)施例2中制備的納米纖維加入到含有25 mmol L—1谷氨酸鈉，10 mmol L—1鹽酸乙胺，25匪ol L4氯化鎂，25匪ol Γ1 2-巰基乙醇和10匪ol Γ1 ATP 二鈉鹽的100 mrnolL"1 Tris-HCKpH 7.5)緩沖溶液中，在水浴中IOOrpm振蕩反應(yīng)20min ；然后在 10000rpm，4°C下離心lOmin，除去沉淀，收集上清液；得到茶氨酸，通過實(shí)驗(yàn)顯示最適反應(yīng)溫度為30°C (見圖2)。實(shí)施例4
將實(shí)施例2中制備的納米纖維加入到含有25 mmol L—1谷氨酸鈉，10 mmol L—1鹽酸乙胺，25讓ol L4氯化鎂，25讓ol Γ1 2-巰基乙醇和10讓ol Γ1 ATP 二鈉鹽的100 mmolL"1 Tris-HCKpH 6-9)緩沖溶液中，在30°C水浴中IOOrpm振蕩反應(yīng)20min ；然后在lOOOOrpm， 4°C下離心lOmin，除去沉淀，收集上清液；得到茶氨酸，通過實(shí)驗(yàn)顯示最適pH為7. 5 (見圖 3)。實(shí)施例5
將實(shí)施例2中制備的納米纖維加入到含有25 mmol L—1谷氨酸鈉，10 mmol L—1鹽酸乙胺，25讓ol L4氯化鎂，25讓ol Γ1 2-巰基乙醇和10讓ol Γ1 ATP 二鈉鹽的100 mmolL"1 Tris-HCKpH 7. 5)緩沖溶液中，在30°C水浴中IOOrpm振蕩反應(yīng)30-120 min;然后在 lOOOOrpm，4°C下離心lOmin，除去沉淀，收集上清液，得到茶氨酸；通過實(shí)驗(yàn)顯示最適pH為 7. 5 ；通過實(shí)驗(yàn)顯示最適反應(yīng)時(shí)間60 min (見圖4)。
權(quán)利要求
1.一種靜電紡絲制備抗菌納米纖維酶膜的方法，其特征在于具體步驟如下(1)稱取聚乙烯醇溶解于去離子水中，控制PVA濃度為5-12%，80°C下攪拌1_4小時(shí)至完全溶解，冷卻至室溫，加入谷氨酰胺合成酶水溶液，得到GS/PVA混合紡絲液，室溫?cái)嚢?0 分鐘，谷氨酰胺合成酶水溶液與聚乙烯醇溶液的體積比為1:9-1:1 ；(2)將振蕩均勻的溶液分別加入注射器內(nèi)，裝上直徑0.6-1.2mm針頭，調(diào)整針頭到接收器的距離為5-20cm，調(diào)節(jié)電壓在10-23kv，紡絲溶液流速控制在0. 2_6ml/h，紡絲l_8h，將制備的薄膜放入真空干燥箱，4°C真空干燥12小時(shí)以上，即得所需產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靜電紡絲制備抗菌納米纖維酶膜的方法，其特征在于步驟 (1)中所述攪拌時(shí)間為25-35分鐘。
3.—種如權(quán)利要求1所述的納米纖維酶膜用于生物催化合成茶氨酸的應(yīng)用，其特征在于具體步驟如下(1)將納米纖維酶膜l_5g加入到含有10-50mmol L—1谷氨酸鈉，5_15 mmol L-1鹽酸乙胺，10-50匪ol L4氯化鎂，10-50匪ol Γ1 2-巰基乙醇和5-20匪ol Γ1 ATP 二鈉鹽的 100 mmoir1 Tris-HCl緩沖溶液中，在洸_34°C水浴中50_150rpm振蕩反應(yīng)30_120min ；(2)然后在10000rpm，4°C下離心8-12min，除去沉淀，收集上清液，即得所需產(chǎn)品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于Tris-HCl緩沖溶液的pH值為6_9。
全文摘要
本發(fā)明屬于納米材料制備技術(shù)和生物合成技術(shù)領(lǐng)域，一種靜電紡絲制備納米纖維酶膜的方法及其應(yīng)用。將谷氨酰胺合成酶水溶液與聚乙烯醇混合，利用靜電紡絲技術(shù)制備納米纖維酶膜，以谷氨酸鈉和乙胺為底物合成茶氨酸，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，在最適條件下，其酶活保留率為92.3%。
文檔編號(hào)D01D5/00GK102206623SQ20111009883
公開日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月20日
發(fā)明者劉博 , 孫立明, 張晨璐, 李平 申請(qǐng)人:同濟(jì)大學(xué)