專利名稱：含有模擬視黃酸皮膚作用的化合物的皮膚調(diào)理組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有某些模擬視黃酸的皮膚作用的化合物的皮膚調(diào)理化妝品組合物。
視黃醇(維生素A)是一種天然存在于人體中的內(nèi)源性化合物，并且是正常上皮細(xì)胞分化所必需的。天然和合成的維生素A衍生物業(yè)已廣泛應(yīng)用在多種皮膚疾病的治療中并且用作皮膚修復(fù)或更新劑。視黃酸已經(jīng)用來治療多種皮膚疾病，例如痤瘡、皺紋、牛皮癬、老年斑和變色。參見譬如Vahlquist，A.等，J.Invest.Dermatol.，94卷，Holland D.B.和Cunliffe，W.J.(1990)，496-498頁；Ellis，C.N.等，″皮膚中視黃醇的藥理學(xué)″，Vasel，Karger，3卷，(1989)，249-252頁；Lowe，N.J.等，″皮膚中視黃醇的藥理學(xué)″，3卷，(1989)，240-248頁；PCT專利申請WO 93/19743。
人們相信視黃醇酯和視黃醇在酶作用下按照下列機理在皮膚內(nèi)轉(zhuǎn)化為視黃酸視黃醇在表皮中的代謝酶名稱 本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)了某些提高視黃酯和視黃醇向視黃酸的轉(zhuǎn)化作用的化合物。所述的化合物總稱為″增效劑″并且按照具體化合物的增效機理劃分為B1-B5組。增效劑組的機理如下所述抑制ARAT/LRAT(脂酰輔酶A(CoA)視黃醇?；D(zhuǎn)移酶/卵磷脂視黃醇酰基轉(zhuǎn)移酶)活性(B1)，增強視黃醇脫氫酶活性(B2)，抑制視黃醛還原酶活性(B3)，拮抗視黃酸的CRABP-II(細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白II)結(jié)合(B4)，和抑制細(xì)胞色素P450依賴性視黃酸的氧化(B5)。
所述的增效劑單獨或彼此組合可以通過提高類維生素A向視黃酸的轉(zhuǎn)化作用和防止視黃酸的降解來加強類維生素A的作用。所述的增效劑與類維生素A(例如視黃醇、視黃酯、視黃醛、視黃酸)聯(lián)合作用，后者內(nèi)源性存在于皮膚中。然而，優(yōu)選的組合物，在組合物中包括與增效劑或增效劑的組合共存的類維生素A，使性能最佳化。
Granger等的若干專利描述了類維生素A增效劑在化妝品組合物中提高視黃醇和視黃酯的功效的用途(美國專利號5759556，5756109，5747051，5716627，5811110，5536740，5747051，5599548，5955092，5885595，5759556，5693330)。這些專利中描述的增效劑局限在B1和B5類。此外，Johnson & Johnson持有一系列的專利，它們描述了屬于第5類增效劑分子的分子的用途(U.S.5028628；U.S.5037829；U.S.5151421；U.S.476852；U.S.5500435；U.S.5583136；U.S.5612354)。
起類維生素A增效劑作用的分子是化妝品中的普通組分?，F(xiàn)有技術(shù)大量描述了其在化妝品組合物中的用途。大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)公開了兩種或多種此類分子在相同組合物中的用途?，F(xiàn)有技術(shù)的一些實例是US5,665,367，US 5747049，US 5853705，US 5766575，和US 5849310。
然而，現(xiàn)有技術(shù)沒有闡述過由增效劑分子的組合所導(dǎo)致的協(xié)同作用。觀察到增效劑分子的組合對類維生素A活性的協(xié)同增效是意外發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)有技術(shù)沒有公開增效劑分子的最佳濃度或比例或增效劑分子與類維生素A的比例。所以，在通過將化妝用類維生素A與增效劑分子以最適當(dāng)濃度或比例組合從而顯著提高類維生素A的功效方面，本發(fā)明是有新穎性的。
適合在本發(fā)明中使用的增效劑種類包括但不限于下表所列的B1-B5的增效劑。
最佳增效劑組B1化合物
B2化合物
B3化合物
B4化合物
B5化合物
本發(fā)明部分地包括一種皮膚調(diào)理組合物，其含有占該組合物約0.0001％-約50％(重量)，優(yōu)選0.001％-10％(重量)，最優(yōu)選0.001％-5％(重量)的增效劑或增效劑的組合和化妝可接受載體。
含在本發(fā)明組合物中的所述增效劑或其組合選自(a)選自B2；B3；B4組的增效劑；(b)選自下組的二元增效劑組合B1/B2；B1/B3；B1/B4；B1/B5；B2/B3，B2/B4；B2/B5，B3/B4；B3/B5；B4/B5(c)選自下組的增效劑的三元組合B1/B2/B3；B1/B2/B4；B1/B2/B5；B1/B3/B4；B1/B3/B5；B1/B4/B5；B2/B3/B4；B2/B3/B5；B2/B4/B5；B3/B4/B5(d)選自下組的增效劑的四元組合B1/B2/B3/B4；B1/B2/B3/B5；B1/B2/B4/B5；B1/B3/B4/B5；B2/B3/B4/B5；和(e)五組增效劑的組合B1/B2/B3/B4/B5。
優(yōu)選的組合物含有占該組合物約0.001％-約10％(重量)的類維生素A。
本發(fā)明中所合作為增效劑的化合物是基于這些化合物在表A所列的某些濃度下通過在下文部分2.1-2.7中所述對特定酶的體外試驗的能力來選擇的。此類增效劑包含在本發(fā)明中，即使在此沒有作詳細(xì)描述。換言之，如果化合物在下述試驗中充分抑制或增強酶，它將與類維生素A組合起模擬視黃酸對角質(zhì)細(xì)胞(皮膚細(xì)胞)的作用，并因此屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在此所用的術(shù)語″調(diào)理″是指對干燥皮膚、痤瘡、光損傷皮膚、皺紋的出現(xiàn)、老年斑、老化皮膚的預(yù)防和治療，提高角質(zhì)層彈性，使膚色增亮，控制皮脂分泌和全面提高皮膚的質(zhì)量。所述的組合物可以用來改善皮膚脫落和表皮分化。
選定化合物在本發(fā)明產(chǎn)品中的存在顯著提高了類維生素A的性能。
本發(fā)明組合物含有類維生素A作為優(yōu)選成分，其選自視黃酯、視黃醇、視黃醛和視黃酸，優(yōu)選視黃醇或視黃酯。術(shù)語″視黃醇″包括下列視黃醇的異構(gòu)體全反式視黃醇，13-順式-視黃醇，11-順式-視黃醇，9-順式-視黃醇，3，4-二脫氫視黃醇，3，4-二脫氫-13-順式-視黃醇；3，4-二脫氫-11-順式-視黃醇；3，4-二脫氫-9-順式-視黃醇。優(yōu)選的異構(gòu)體是全反式視黃醇，13-順式-視黃醇，3，4-二脫氫-視黃醇，9-順式-視黃醇。最優(yōu)選全反式視黃醇，因為其可以廣泛商購。
視黃酯是視黃醇的酯。術(shù)語″視黃醇″業(yè)已在上文定義。適用于本發(fā)明的視黃酯是視黃醇的C1-C30酯，優(yōu)選C2-C20酯，并且最優(yōu)選C2、C3和C16酯，因為它們更容易商購。視黃酯的酯包括但不限于棕櫚酸視黃酯、甲酸視黃酯、乙酸視黃酯、丙酸視黃酯、丁酸視黃酯、戊酸視黃酯、異戊酸視黃酯、己酸視黃酯、庚酸視黃酯、辛酸視黃酯、壬酸視黃酯、癸酸視黃酯、十一烷酸視黃酯、十二烷酸視黃酯、十三烷酸視黃酯、肉豆蔻酸視黃酯、十五烷酸視黃酯、十七烷酸視黃酯、硬脂酸視黃酯、異硬脂酸視黃酯、十九烷酸視黃酯、花生四烯酸視黃酯、山崳酸視黃酯、亞油酸視黃酯和油酸視黃酯。
適用于本發(fā)明的優(yōu)選的酯選自棕櫚酸視黃酯、乙酸視黃酯和丙酸視黃酯，因為這些是最容易商購，且因此最便宜。亞油酸視黃酯和油酸視黃酯也因其功效而成為優(yōu)選。
視黃醇或視黃酯在本發(fā)明組合物中的用量是約0.001％-約10％，優(yōu)選用量是約0.01％-約1％，最優(yōu)選用量是約0.01％-約0.5％。
本發(fā)明組合物的基本成分是通過下列部分2.1-2.7所述體外試驗的化合物。適用于本發(fā)明的化合物在表A所列的濃度下抑制或提高酶達(dá)到表A中所列的百分寬度。
部分A增效劑的鑒定表A增效劑試驗濃度和％抑制率/增高率ARAT/LRAT試驗(鑒定B1增效劑)
視黃醇脫氫酶試驗(鑒定B2增效劑)
視黃醛還原酶試驗(鑒定B3增效劑)
CRABPII拮抗劑試驗(鑒定B4增效劑)
視黃酸氧化試驗(鑒定B5增效劑)
利用下列體外微粒體試驗來測定本發(fā)明組合物含有所述化合物的適合性1.材料全反式-視黃醇、全反式-視黃酸、棕櫚酰-CoA、二月桂?；字Ｄ憠A、NAD和NADPH購自Sigma Chemical Company。微粒體試驗所用的類維生素A的儲備液用HPLC級乙腈制成。HPLC分析所用的全部類維生素A標(biāo)準(zhǔn)儲備液是在乙醇中配制，儲藏在N2和-70℃下并當(dāng)不儲藏時在琥珀色光照下保持在冰上。其它化學(xué)品和抑制劑購自化妝品材料供應(yīng)商或化學(xué)公司例如Aldrich或International Flavours andFragrances。
2.方法2.1 RPE微粒體的分離(由(1)修飾)50個冷凍的切半牛視杯(除去視網(wǎng)膜和房水)得自W.L.LawsonCo.，Lincoln，NE，USA。眼睛融化過夜并用鑷子剝下有色的虹膜。各視杯用2×0.5mL冷緩沖液(0.1M PO4/1mM DTT/0.25M蔗糖，pH 7)沖洗用畫刷或橡膠淀帚擦去深色細(xì)胞。將細(xì)胞混懸液加入到虹膜并在燒杯中將該混懸液用聚四氟乙烯攪拌棒攪拌數(shù)分鐘。該混懸液經(jīng)粗糙濾膜(Spectra/Por 925μ孔徑聚乙烯篩)過濾除去大微粒，并將所得深色混懸液用Glas-Col馬達(dá)驅(qū)動的聚四氟乙烯均化器勻漿化。
將細(xì)胞勻漿在20,000g下離心30分鐘(Sorvaal型RC-5B離心機，帶有SS34轉(zhuǎn)子，在2.5×10cm管中，14,000RPM下)。將所得上清液在150,000g下進(jìn)一步離心60分鐘(Beckman型L80超離心機，帶有SW50.1轉(zhuǎn)子，在13×51mm管中，40,000RPM下)。所得小球用Heat Systems Ultrasonics，Inc.的W185D型Sonifier細(xì)胞破裂器分散到約5mL 0.1M PO4/5mM DTT，pH 7緩沖液中，所得微粒體分散體等分到小管中并儲藏在-70℃下。通過BioRad染料結(jié)合試驗、用BSA作標(biāo)準(zhǔn)測定微粒體的蛋白濃度。
2.2 大鼠肝臟微粒體的分離(4)約6g的冷凍大鼠肝臟(得自Accurate Chemical & ScientificCorp.的Harlan Sprague Dawley大鼠)在3個體積的0.1M三羥甲基氨基甲烷/0.1M KCl/1mM EDTA/0.25M蔗糖，pH 7.4緩沖液中用Brinkmann Polytron均化。所得的組織混懸液進(jìn)一步在上述馬達(dá)驅(qū)動的聚四氟乙烯均化器中均化。得到的勻漿依次在10,000g下離心30分鐘、在20,000g下離心30分鐘和在30,000g下離心15分鐘，得到的上清液在在105,000g下超速離心80分鐘。小球在上述約5mL的0.1MPO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2，pH 7.4緩沖液中超聲處理并等份儲藏在-70℃下。按照上述方法測定蛋白濃度。
2.3 ARAT和LRAT活性的試驗(鑒定B1)下面的方法是文獻(xiàn)(2)中所述方法的改進(jìn)。制備下列緩沖液并儲藏在4℃下0.1M PO4/5mM二硫蘇糖醇，pH 7.0(PO4/DTT)。在試驗當(dāng)天，加入2mg BSA/mL緩沖液得到PO4/DTT/BSA工作緩沖液。在乙腈中制備1mM視黃醇底物并在氮氣和-20℃下儲藏在琥珀瓶中。制備4mM棕櫚酰-CoA在工作緩沖液(等份儲藏)中的溶液和4mM二月桂?；字Ｄ憠A在乙醇中的溶液并儲藏在-20℃。將抑制劑在H2O、乙醇、乙腈或DMSO中制成10mM儲備液。用純乙醇制備驟冷液，其含有50μg/mL丁基化羥基甲苯(BHT)，并且用含有50μg/mL BHT的己烷溶液進(jìn)行提取。
向2英錢的玻璃杯依次加入下列物質(zhì)PO4/DTT/BSA緩沖液至總體積為500μL，5μL?；w(4mM棕櫚酰-CoA和/或二月桂酰基磷脂酰膽堿)，5μL抑制劑或空白溶劑(10mM儲備液或進(jìn)一步的稀釋液)，隨后約15μg的RPE微粒體蛋白(約15μL的約1mg/mL微粒體蛋白等份試樣)。該混合物在37℃下溫育5分鐘至平衡反應(yīng)溫度并隨后加入5μL的1mM視黃醇。將瓶子加蓋，渦旋5秒且在37℃下溫育30-90分鐘。通過加入0.5mL乙醇/BHT終止該反應(yīng)。加入3mL己烷/BHT提取類維生素A，渦旋試管數(shù)秒若干次并在低速下離心該管5分鐘以使各層快速分離。將己烷上層轉(zhuǎn)移到干凈瓶中，水層按照上述方法再用3mL己烷/BHT提取。合并己烷層，在37℃氮氣流下在加熱鋁塊上進(jìn)行烘干而蒸發(fā)己烷。干燥的殘余物儲藏在-20℃下直至HPLC分析。通過如下整合HPLC信號，分別用棕櫚酸視黃酯和十二烷酸視黃酯的量定量測定ARAT和LRAT活性。
注意，溫育溶液含有40μM?；w、100μM或更少的抑制劑、10μM視黃醇、約30μg/mL微粒體蛋白和約0.1MPO4/pH 7/5mM DTT/2mg/mLBSA。所有在加入視黃醇之后的步驟是在無光或在琥珀光下進(jìn)行。
2.4 視黃醇脫氫酶活性的試樣(鑒定B2)制備下面儲備液50mM KH2PO4，pH 7.4緩沖液，經(jīng)無菌過濾。
10mM全反式視黃醇(Sigma R7632)于DMSO中。
200mM煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽，鈉鹽(NADP)(Sigma N0505)于滅菌水中。
40mM于適當(dāng)溶劑(水、緩沖液、乙醇、氯仿或DMSO)中的試驗化合物。
大鼠肝臟微粒體在50mM KH2PO4，pH 7.4緩沖液(4μg/μl)中的1∶10稀釋液。
在帶有螺旋蓋的2英錢玻璃瓶中，依次加入下列物質(zhì)緩沖液使終體積為400ul
25μl稀釋微粒體(終量＝100μg)-煮沸的微粒體用作對照且正常微粒體用作試驗樣本。
4μl的200mM NADP(終濃度＝2mM)1μl的40mM試驗化合物(終濃度＝100μM)8μl的10mM視黃醇(終濃度＝200μM)瓶子在37℃的振蕩水浴中溫育45分鐘。向各瓶內(nèi)加入500μl冰冷的乙醇以終止該反應(yīng)。用冰冷的己烷(2.7ml/提取)提取2次類維生素A。在第一次提取過程中將乙酸視黃酯(5μl的900μM儲備液)加入到各瓶內(nèi)作為監(jiān)測各樣本提取效率的手段。將樣本渦旋10秒，隨后在1000rpm、5℃下在Beckman GS-6R離心機中輕度離心5分鐘。在每次提取之后將含有類維生素A的己烷上層自水層取出置于一個干凈的2英錢瓶內(nèi)。在輕微的氮氣流下蒸發(fā)己烷。干燥的殘余物隨后儲藏在-20℃下直至HPLC分析。
2.5 視黃醛還原酶活性的試驗(鑒定B3)按照下列替換如上制備全部儲備液10mM于DMSO中的全反式視黃醛(Sigma R2500)代替視黃醇。
用200mM于滅菌水中的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽，還原形式，四鈉鹽(NADPH)(Sigma N7505)代替NADP。
在帶有螺旋蓋的2英錢玻璃瓶中依次加入下列物質(zhì)緩沖液至終體積為400μl25μl的稀釋微粒體(最終量＝100μg)-用煮沸的微粒體作為對照且用正常微粒體作為試驗樣本。
4μl的200mM NADPH(終濃度＝2mM)1μl的40mM試驗化合物(終濃度＝100μM)3μl的10mM視黃醛(終濃度＝75μM)按照與上文相同的方法進(jìn)行溫育和提取。
2.6 CRABPII 拮抗劑的試驗(鑒定B4)2.6.1.CRABPII的合成a.表達(dá)體系把基因CRABPII克隆在pET 29a-c(+)質(zhì)粒(Novagen)中?？寺〉幕蛱幱趶姶笫删wT7轉(zhuǎn)錄和翻譯信號的控制之下。T7聚合酶的來源是由宿主細(xì)胞大腸桿菌BLR(DE3)pLysS(Novagen)提供。后者具有一個在lacUV5控制下的通過IPTG的存在誘導(dǎo)的T7聚合酶的染色體拷貝。
按照制造商說明通過轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到大腸桿菌BLR(DE3)pLysS細(xì)胞中。
b.誘導(dǎo)將轉(zhuǎn)移細(xì)胞的過夜培養(yǎng)物以1∶100稀釋到含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的2×YT中。使該細(xì)胞生長，同時在37℃下振搖直至在600nm下的OD達(dá)到0.6-0.8。隨后加入IPTG至終濃度為1mM且培養(yǎng)物繼續(xù)溫育2小時。通過在5,000g室溫下離心10分鐘收獲細(xì)胞。將顆粒儲藏在-20℃。
2.6.2.純化純化是按照Norris和Li，1997所述方法進(jìn)行。
a.細(xì)胞溶解將冷凍的顆粒在室溫下融化并重新懸浮在1-2個顆粒體積的新制溶胞緩沖液(50mM Tris-HCl，pH 8，10％(w/v)蔗糖，1mM EDTA，0.05％(w/v)疊氮化鈉，0.5mM DTT，10mM MnCl2，2.5mM苯甲基磺酰氟，2.5mM苯甲脒，6ug/mL DNase)中。溶胞產(chǎn)物在室溫下溫育30分鐘。通過超聲處理進(jìn)一步完成溶胞(在10,000psi下六次30秒脈沖，與在冰上五次30秒的延遲交替進(jìn)行)。通過在15,000rpm下4℃離心1小時除去溶胞產(chǎn)物的不溶部分，并將上清液儲藏在-20℃下。
b.在Sephacryl S300上的凝膠過濾室溫下將步驟a所得的上清液加載在sephacryl S-300的2.5×100cm柱(Pharmacia)上。洗脫緩沖液是20mM Tris-HCl，pH8，0.5mM DTT，0.05％疊氮化鈉(緩沖液A)。流速為2mL/分鐘。對收集的2-mL餾分來檢測在280nm下的紫外吸光度。通過SDS-page測定代表峰的餾分以確定CRABPII的存在。
c.陰離子交換色譜2mL的含CRABPII的凝膠過濾餾分加載在季銨陰離子交換柱FPLC(快速蛋白液體色譜)型monoQ(Pharmacia)上。在室溫下約20分鐘內(nèi)用100％緩沖液A-30％緩沖液B(100％緩沖液B＝緩沖液A+250mM NaCl)的梯度緩沖液洗脫下CRABPII。每1分鐘收集1mL餾分。再次，通過SDS記錄檢查CRABPII的存在。將CRABPII儲藏在4℃下，隨后用帶有瓶子平臺附件的Micromodulyo 1.5K(Edwards HighVacuum International)冷凍干燥。干燥樣本儲藏在室溫下直至其用于結(jié)合試驗中。
d.檢測CRABPII的存在CRABPII的表達(dá)和純化是利用變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)試驗、在7-15％聚丙烯酰胺凝膠(Biorad)上驗證。10μL樣本與10μL的2X加載緩沖液(100mM Tris-HCl pH 6.8，4％SDS，0.2％BPB，20％甘油，1mM DTT)混合并通過加熱變性(2分鐘，80℃下)。將樣本加載在凝膠上，該凝膠浸漬在1X Tris-甘氨酸緩沖液(Biorad)中并在室溫下施加一個恒定電流(25mA)1小時。在用考馬斯藍(lán)染色之后，根據(jù)用Benchmark預(yù)染色的蛋白梯(Gibco BRL)測定的分子量鑒定蛋白。
用蛋白質(zhì)印跡確定CRABPII的存在。用Biorad盒將在SDS-PAGE上分離的蛋白轉(zhuǎn)移到Immobilon-P轉(zhuǎn)移膜(Millipore)。轉(zhuǎn)移發(fā)生在1X Tris-甘氨酸緩沖液(Biorad)+10％甲醇中。施加電流(60mA)3小時使蛋白遷移穿過膜。此后，室溫下該膜用1X TBS中的5％奶粉封阻1小時且用CRABPII的初級抗體(小鼠抗克隆5-CRA-B3的1/1000稀釋液)在相同緩沖液中4℃下探測過夜。次日，膜用PBS(3×5分鐘)沖洗，隨后用次級抗體，偶聯(lián)抗小鼠抗體的過氧化物酶(ECLTM，Amersham)的1∶2000稀釋液在室溫下溫育1小時。膜用1×PBS(3×5分鐘)洗滌并用ECL檢測試劑盒按照制造商說明(Amersham)檢測蛋白。
純化CRABPII的濃度用BSA試劑盒(Pierce)測定。
2.6.3.放射性結(jié)合試驗220pmol的CRABPII在20mM Tris-HCl緩沖液pH 7.4中與15pmol的放射性全反式視黃酸(NEN)以70μL的總體積溫育。對于競爭試驗，向混合物中加入過量的另一種配體(6670∶1，670∶1或70∶1)。室溫下無光下該反應(yīng)進(jìn)行1小時。為了將未結(jié)合的全反式視黃酸與結(jié)合的全反式視黃酸分開，使用6kD截斷的微型色譜柱(Biorad)。用Microplex歧管按照制造商說明(Pharmacia)棄去儲藏緩沖液。將樣本加載在色譜柱上并在30分鐘內(nèi)借助于重力進(jìn)行分離。與CRABPII結(jié)合的視黃酸(″RA″)出現(xiàn)在濾液中，同時游離RA殘留在柱中。通過閃爍計數(shù)器測量濾液的放射性。
2.7 NADPH依賴性視黃酸氧化的試驗(鑒定B5)
下列方法是文獻(xiàn)(4)所述方法的一個改進(jìn)方法。制備下列試驗緩沖液并儲藏在4℃下0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2，pH 7.4。在試驗當(dāng)天，制備60mM NADPH在緩沖液中的溶液。按照上述方法制備抑制劑儲備液、酸化的乙醇/BHT終止液，和己烷/BHT。1mM視黃酸工作溶液是通過用乙醇稀釋15mM儲備液(在DMSO中)來制成。
向2英錢瓶中，依次加入下列物質(zhì)試驗緩沖液使終體積為500μL，20μL的60mM NADPH，5μL抑制劑或溶劑空白，隨后約2mg的大鼠肝臟微粒體蛋白。
該混合物在37℃下溫育5分鐘，隨后加入5μL的1mM視黃酸工作溶液。繼續(xù)在37℃下溫育60分鐘-瓶子不加蓋，因為該氧化過程除了NADPH以外還需要分子O2。用酸化的乙醇/BHT進(jìn)行終止且用上述己烷/BHT提取?？焖傧疵摰臉O性視黃酸代謝產(chǎn)物(假設(shè)為4-氧代視黃酸)的定量是通過整合下述HPLC信號來完成。
加入視黃酸之后的所有步驟是在無光或在琥珀色光下進(jìn)行。最終的溫育溶液含有2.4mM NADPH，100μM或更少的抑制劑，10μM視黃酸，約4mg/mL大鼠肝臟微粒體蛋白和約0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2。
各種類維生素A的HPLC分析通過將各瓶中的殘余物溶解在100μL甲醇中來制備用于HPLC定量分析類維生素A的樣本。將溶液轉(zhuǎn)移到1ml外殼瓶內(nèi)的150μL玻璃圓錐形管中，蓋緊，并且置于Waters 715自動取樣儀中。即刻注射60μL的等份試樣并分析類維生素A的含量。
色譜儀由Waters 600梯度控制器/泵、Waters 996光電二極管數(shù)組檢測器和Waters 474掃描熒光檢測器組成。采用兩種HPLC方案進(jìn)行類維生素A分析。對于ARAT和LRAT試驗，用Waters 3.9×300mm C18Novapak反相分析柱和Waters Sentry NovaPak C18防護(hù)柱用流速調(diào)整至1mL/分鐘的80∶20(v/v)甲醇/THF等度流動相進(jìn)行10分鐘的視黃醇和視黃醇酯的分離。監(jiān)測洗脫液在325nm下的吸光度和325ex/480em下的熒光。
用較短的Waters 3.9×150mm C18 Novapak反相分析柱和WatersSentry NovaPak C18防護(hù)柱、采用Barua(5)所述的梯度體系的一個改進(jìn)體系分離視黃醇和視黃醇氧化試驗的類維生素A酸和醇類。該體系由自含10mM乙酸銨的68∶32(v/v)甲醇/水至4∶1(v/v)甲醇∶二氯甲烷的20分鐘線性梯度和隨后以1mL/分鐘的流速的5分鐘保持組成。在300nm-400nm下監(jiān)測柱洗脫液。
這些方案的選擇基于其明確地解析各試驗中有關(guān)類維生素A酸、醇類、醛類和/或酯類的性能和相對較快速的分離。通過HPLC鑒定各種類維生素A是基于未知峰的保留時間與可得的可信類維生素A標(biāo)準(zhǔn)品的精確比對以及未知峰相對于可得的可信類維生素A的UV光譜分析(300-400nm)。
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適用于本發(fā)明的增效劑包括但不限于下表B1-B5所列的增效劑。下表給出增效劑種類(B1-B5)，化合物的化學(xué)名，由鑒定增效劑的適當(dāng)試驗獲得的結(jié)果(即ARAT/LRAT用于鑒定B1，視黃醇脫氫酶用于鑒定B2，視黃醛抑制作用用于鑒定B3，CRABP結(jié)合用于鑒定B4并且視黃酸氧化抑制作用用于鑒定B5)。
ARAT/LRAT抑制劑(B1)種類 化合物％抑制率總TG ％抑制率 ％抑制率％抑制率 ％抑制率總TG(IC50)ARAT ARATLRAT LRAT(-ROH/RE) (10μm)(100μm)(10μm)(100μm)類胡蘿卜素番紅花酸 3.75E-05 15％ 34％0 15％脂肪酸&其它表面 乙酰基鞘氨醇 6.78E-06 19％+/-12 62％+/-11 10％+/-10 50％+/-18活性劑脂肪酸酰胺&其它 C13β-羥基酸/酰胺 17％ 28％ 25％表面活性劑脂肪酸酰胺&其它 蓖麻油MEA 3.25E-05表面活性劑脂肪酸酰胺&其它 椰油酰胺丙基甜菜堿 25％表面活性劑脂肪酸酰胺&其它 椰油羥乙基咪唑啉 2.84E-07 68％ 65％表面活性劑脂肪酸酰胺&其它 椰油酰胺-MEA(或椰油 11％ 13％ 34％表面活性劑基單乙醇酰胺)脂肪酸酰胺&其它 甘油-PCA-油酸酯41％+/-6 58％+/-2表面活性劑脂肪酸酰胺&其它 己酰胺 20％表面活性劑脂肪酸酰胺&其它 己酰鞘氨醇 9.99E-05 28％+/-437％+/-9表面活性劑脂肪酸酰胺&其它 羥乙基-2-羥基-C12 3.29E-05 35％35％表面活性劑 酰胺脂肪酸酰胺&其它 羥乙基-2-羥基-C1625％30％表面活性劑 酰胺脂肪酸酰胺&其它 月桂?；“彼? 20％表面活性劑脂肪酸酰胺&其它 利多卡因 12％0表面活性劑脂肪酸酰胺&其它 亞油酰胺-DEA(或亞油59％ 12％+/-3 43％+/-311％+/-951％+/-15表面活性劑 酰基二乙醇酰胺)脂肪酸酰胺&其它 亞油酰胺-MEA(或亞油1.61E-05 14％ 35％20％+/-835％表面活性劑 ?；鶈我掖减０?脂肪酸酰胺&其它 亞油酰氨基丙基二甲胺 69％+/-18 75％+/-4表面活性劑脂肪酸酰胺&其它 亞油甲芐胺 64％+/-1543％+/-21其它表面活性劑脂肪酸酰胺&其它 肉豆蔻?；“彼?41％+/-1411％+/-11表面活性劑脂肪酸酰胺&其它 油酰甜菜堿 2.80E-05 47％表面活性劑脂肪酸酰胺&其它 棕櫚酰胺-MEA 6％ 23％ 12％33％表面活性劑脂肪酸酰胺&其它 硬脂基羥基酰胺 10％ 10％表面活性劑脂肪酸酰胺&其它 Utrecht-121％43％54％ 51％48％+/-6表面活性劑脂肪酸酰胺&其它 Utrecht-2 3.47E-06 42％83％+/-9 51％92％+/-3表面活性劑黃烷類化合物 柑桔素 33％ 14％香料 烯丙基α-紫羅蘭酮 16％+/-1422％+/-23 17％+/-1036％/-7香料 α-二氫大馬酮3.35E-04 67％+/-2783％+/-12 87％+/-6 98％+/-1(damascone)
香料α-紫羅蘭酮 9.27E-04 45％+/-2749％+/-30香料α-甲基紫羅蘭酮 67％ 77％香料α-松油醇 26％ 25％香料β-二氫大馬酮 45％ 84％52％ 92％香料Brahmanol 70％ 75％香料大馬酮 23％ 70％29％ 79％香料δ-二氫大馬酮 58％ 87％64％ 95％香料二氫α-紫羅蘭酮 13％ 18％香料乙基Saffranate51％ 49％香料茴香醇12％ 4％香料γ-甲基紫羅蘭酮 21％ 38％香料異丁基紫羅蘭酮8％ 45％香料異環(huán)香葉醇18％ 16％香料異二氫大馬酮 80％ 92％香料Lyral1.27E-04 76％ 71％香料檀香酮23％ 12％香料檀香醇15％ 43％香料Timberol 34％ 33％香料Tonalid 50％ 33％
香料 Traseolide 41％ 21％其它 椰油三甲基銨C1- 27％其它 Urosolic酸 1.46E-0621％ 28％非環(huán)狀香料檸檬醛 20％非環(huán)狀香料香茅醇 30％ 0非環(huán)狀香料法呢醇 9.35E-05 23％+/-1853％+/-18 10％+/-7 53％+/-19非環(huán)狀香料香葉醇 7.83E-03 13％ 32％非環(huán)狀香料香葉草基香葉醇 38％+/-1281％+/-6 16％+/-9 77％+/-13非環(huán)狀香料沉香醇 28％ 0非環(huán)狀香料壬二烯醛 20％非環(huán)狀香料假紫羅蘭酮 12％ 37％磷脂 二辛基磷脂酰乙醇胺 23％ 50％+/-20 17％+/-17脲二甲基咪唑啉酮22％脲咪唑啉基脲35％
視黃醇脫氫酶活化劑(B2)種類 化合物％增高率視黃醇脫氫酶磷脂 磷脂酰膽堿 增高21％磷脂 鞘磷脂 增高26％
視黃醛還原酶抑制劑(B3)種類化合物 總TG(IC50) ％抑制率視黃醛還原酶醛 香草醛 9.70E-036％脂肪酸 花生酸 20％脂肪酸 花生四烯酸 49％脂肪酸 亞油酸 1.63E-0462％+/-2脂肪酸 亞麻酸 1.34E-0454％+/-16脂肪酸 肉豆蔻酸1.72E-0526％其它安吖啶 6.26E-0622％+/-8其它甘珀酸 3.61E-0726％+/-2其它甘草次酸8.64E-0638％+/-1磷脂磷脂酰乙醇胺37％
CRABPII拮抗劑(B4)種類 化合物總TG(IC50) ％抑制率CRABPII脂肪酸反油酸 6.50E-05 ＞50％脂肪酸十六烷二酸 1.30E-04 ＞50％脂肪酸12-羥基硬脂酸 2.91E-05 ＞50％脂肪酸異硬脂酸 6.88E-05 ＞50％脂肪酸亞麻子油＞50％
視黃酸氧化抑制劑(B5)種類 化合物 總TG(IC50) ％抑制率 ％抑制率視黃酸(10μM) 視黃酸(100μM)咪唑 聯(lián)苯芐唑89％ 100％咪唑 苯咪丁酮4.47E-0680％ 92％咪唑 克霉唑 76％ 85％咪唑 益康唑 88％ 100％咪唑 酮康唑 1.85E-0784％ 84％咪唑 咪康唑 2.78E-0774％ 86％脂肪酸酰胺&其它表面活性劑月桂基羥乙基咪唑啉 4.67E-07脂肪酸酰胺&其它表面活性劑油基羥乙基咪唑啉3.02E-0554％ 80％黃烷類化合物 槲皮素 6.29E-0540％ 74％香豆素 香豆素喹啉 (7H-苯并咪唑并[2，1-a]苯并 8.59E-07[de]-異喹啉-7-酮喹啉 羥基喹啉(2-羥基喹啉)3.64E-04喹啉 美替拉酮(2-甲基-1，2-二-3- 47％吡啶基-1-丙烷)
部分B.增效劑組合的作用為了評估增效劑分子的組合物的作用，需要一種包括5類增效劑的各種的作用的試驗。單一酶試驗不適合這種目的，因為它只對一類的增效劑分子具有特異性。反映角質(zhì)細(xì)胞中的類維生素A濃度的試驗必需使單一增效劑分子與增效劑分子的組合的作用相聯(lián)系。因此，采用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Tgase)試驗。Tgase類是鈣依賴性酶，其催化蛋白中共價交聯(lián)的形成。若干Tgase酶在角質(zhì)細(xì)胞中與膜結(jié)合，這對于表皮細(xì)胞的成熟至關(guān)重要。這種酶受到視黃酸抑制。視黃酸的濃度越高，對Tgase表達(dá)的抑制作用越大。所以，Tgase同時是角質(zhì)細(xì)胞分化和類維生素A對角質(zhì)細(xì)胞作用的良好標(biāo)識。
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作為皮膚分化的一種標(biāo)識在表皮中末期分化過程中，在細(xì)胞四周的內(nèi)表面形成厚15nm的蛋白層(稱作角質(zhì)化包膜(CE))。CE由許多不同的蛋白組成，這些蛋白業(yè)已在至少兩種不同的表皮內(nèi)表達(dá)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGases)的催化下通過N∑-(γ-谷?；?賴氨酸異二肽(isodipeptide)鍵的形成交聯(lián)在一起。Tgase I大量表達(dá)在表皮的分化層尤其是顆粒層中，但不存在于未分化基底表皮中。所以TGase I是具有高TGase I水平的表皮角質(zhì)細(xì)胞分化的有用標(biāo)識，其指示出較高的分化狀態(tài)。用基于ELISA的TGase I試驗、使用TGase I抗體在下列實施例中來評估培養(yǎng)角質(zhì)細(xì)胞的分化狀態(tài)。
將角質(zhì)細(xì)胞(按照上述方法培養(yǎng))鋪板在96孔平板中200μl培養(yǎng)基內(nèi)達(dá)到4,000-5,000細(xì)胞/孔的密度。溫育2-3天后，或直至細(xì)胞約50％融合之后，將培養(yǎng)基更換為含有試驗化合物的培養(yǎng)基(每種試驗一式五份)。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)96小時，此后吸出培養(yǎng)基并將平板儲藏在-70℃。從冰箱中取出平板，并且細(xì)胞用200μl的1×PBS沖洗2次。細(xì)胞在室溫(R/T)下與TBS/5％BSA(洗滌緩沖液，牛血清白蛋白)一起溫育1小時。此后加入TGase初級抗體50μl在洗滌緩沖液中1∶2000稀釋的單克隆抗Tgase I Ab B.C.。初級抗體在37℃下溫育2小時且隨后用洗滌緩沖液漂洗6次。細(xì)胞繼續(xù)與50μl在洗滌緩沖液中1∶4,000稀釋的次級抗體(Fab片段，得自Amersham的過氧化物酶的偶聯(lián)抗小鼠IgG)在37℃下溫育2小時，此后用洗滌緩沖液漂洗3次。用洗滌緩沖液漂洗后，細(xì)胞用PBS漂洗3次。為了比色顯影，在R/T和黑暗(在鋁箔覆蓋下)下，將細(xì)胞與100μl底物溶液(4mg鄰苯二胺和3.3μl的30％H2O2于10ml 0.1M檸檬酸鹽緩沖液pH 5.0中)精確溫育5分鐘。通過加入50μl的4N H2SO4終止該溶液。在96孔平板UV分光光度計中492nm下讀取樣本的吸光度。在5份復(fù)制試驗中，其中4份用兩種抗體處理，第5份用作Tgase背景對照。測定TGase水平并表示為對照的百分比。
Tgase試驗細(xì)節(jié)在開始試驗之前，為了測定增效劑分子的組合的作用，先研究標(biāo)準(zhǔn)Tgase試驗條件。建立一個如下所述的全面有效的Tgase試驗A.試劑細(xì)胞人角質(zhì)細(xì)胞(P2在T75燒瓶中； 新生兒包皮P3在96孔試驗平板中)初級抗體TGm特異性單克隆Ab B.C1 Biogenesis(Cat#5560-6006)次級抗體過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠Ig Amersham(Cat#NA9310)F(ab)2底物溶液對于10ml磷酸鹽檸檬酸鹽緩沖液4.0mg鄰苯二胺SigmaP-72883.3μl的30％H2O2SigmaH-1909B.培養(yǎng)基/緩沖液角質(zhì)細(xì)胞生長培養(yǎng)基(KGM) Clonetics(Cat#3111)磷酸鹽緩沖鹽水；Dulbecco氏培養(yǎng)基 Life Technology(Cat#不含Ca/MgCl2) 14200-075)Tris緩沖鹽水封阻緩沖液(1×TBS+5％奶粉) BioRad(Cat#170-6404)洗滌緩沖液(1％奶粉在TBS+0.05％ Sigma(Cat#P-7949)Tween20中)磷酸鹽檸檬酸鹽緩沖液0.2M磷酸氫二鈉 Sigma(Cat#S-9763)和0.1M檸檬酸的1∶1混合物 Sigma(Cat#C-1909)4N H2SO4
C.培養(yǎng)器具96孔聚丙烯微量滴定平板 Costar(Cat#3595)96孔聚丙烯U底平板Costar(Cat#3794)T75-開口蓋 Costar(Cat#3376)D儀器/設(shè)備Biotek Model EL 340微板讀數(shù)器Bio-tek Instuments Inc.
復(fù)合探針I(yè)I PackardE細(xì)胞培養(yǎng)方法角質(zhì)細(xì)胞在96孔平板中的接種1.制備一種角質(zhì)細(xì)胞的混懸液，其在KGM培養(yǎng)基中的濃度為3000細(xì)胞/200μl/孔(各微量滴定平板使用3×105細(xì)胞/12ml培養(yǎng)基)2.將200μl的角質(zhì)細(xì)胞混懸液只轉(zhuǎn)移到內(nèi)部60個孔的各個孔中。
3.把200μl的KGM培養(yǎng)基吸移至外孔中(以保持熱平衡)。
4.各平板在37℃和5％CO2下溫育3天或直至細(xì)胞約50％融合為止。
含樣本的角質(zhì)細(xì)胞的處理5.在DMSO中制備樣本的儲備液。
6.將樣本稀釋至所需濃度，使DMSO的最終試驗濃度為0.1％。
7.將20μl的樣本轉(zhuǎn)移到孔中且加入180μl的KGM培養(yǎng)基使最終的試驗體積為200μl。
8.平板在37℃和5％CO2下溫育72小時。
9.從各孔中取出全部培養(yǎng)基。
10.孔用200μl的1×PBS漂洗2次。
11.最后將它們在-70℃下冷凍至少1.5小時。
F轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶試驗1.封阻平板在室溫下用200μl/孔的封阻緩沖液溫育1小時。
2.初級抗體抽吸封阻緩沖液。用100μl/孔的TGm特異性單克隆抗體B.C1(以1∶2000在洗滌緩沖液中稀釋)在37℃下溫育至少2小時。背景對照孔中不加入初級抗體。
3.用洗滌緩沖液漂洗孔6次。
4.次級抗體用100μl/孔過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠IgF(ab)2片段(1∶4000在洗滌緩沖液中稀釋)在37℃下溫育2小時。
5.孔用洗滌緩沖液(加入200μl)漂洗3次且在每次漂洗后吸出。
6.孔用PBS(無Tween)漂洗3次。
7.100μl/孔底物溶液在室溫下精確溫育5分鐘。
8.用50μl/孔4N H2SO4終止該反應(yīng)。
9.在492nm在Bio-tek平板讀取器中讀取吸光度。
I.最佳化研究a.轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶產(chǎn)生的時程在96孔平板(4000細(xì)胞/孔)中進(jìn)行時程試驗從而測定角質(zhì)細(xì)胞生長中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶生產(chǎn)的最佳溫育時間。該時程研究使用多個變量進(jìn)行，包括視黃酸和視黃醇的劑量反應(yīng)分析以及在1.2mM CaCl2存在下的溫育。雖然轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶生產(chǎn)在對照細(xì)胞(0.1％DMSO)中沒有改變，但視黃酸和視黃醇兩者在5天的溫育期內(nèi)表現(xiàn)出對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的劑量依賴性抑制作用。最顯著的類維生素A作用是在第2天和第3天觀察到。在第2天觀察到最低抑制作用，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的生產(chǎn)在最高濃度(1μM)的視黃酸和視黃醇的存在下分別被抑制85％和55％。還通過改變細(xì)胞密度(3000細(xì)胞/孔和5000細(xì)胞/孔)進(jìn)行相同的試驗且觀察到可比較的結(jié)果。
BDMSO敏感性用在0-2％內(nèi)的不同濃度的DMSO測試在角質(zhì)細(xì)胞中對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶生產(chǎn)的影響。高于0.5％DMSO時，該試驗對DMSO濃度敏感并且對活性的抑制作用非常顯著。所以，選擇0.1％的最終試驗濃度來進(jìn)行隨后的樣本濃度研究。
C劑量反應(yīng)曲線視黃酸和視黃醇基于數(shù)據(jù)，選擇第3天作為最佳時間并選擇0.1％DMSO作為進(jìn)一步試驗的濃度。用視黃酸和視黃醇在0.1％DMSO的存在下進(jìn)行另一個劑量反應(yīng)試驗，并且在第3天分析轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的生產(chǎn)。對于視黃酸和視黃醇的Tgase抑制作用可以觀察到一個良好的劑量反應(yīng)。10-7M的視黃醇在線性范圍的濃度內(nèi)產(chǎn)生Tgase的抑制作用。所以，選擇視黃醇的這個濃度來評估增效劑組合物。
D.用于試驗增效劑或增效劑的組合的最終條件用視黃醇和多種增效劑培養(yǎng)角質(zhì)細(xì)胞的天數(shù)-3天DMSO終濃度 -小于0.1％視黃醇濃度 -10-7M(0.1μM)增效劑濃度 -10mM至0.1nM利用上述條件，測試所有不同增效劑(B1-B5)的劑量反應(yīng)以鑒定以組合試驗的增效劑的最佳濃度。
測定轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶水平并在表B1-B5中表示為(i)％(增效劑+視黃醇抑制/對照抑制)-％(ROH抑制/對照抑制)，它測定出與視黃醇單用相比的增效劑+視黃醇所誘導(dǎo)的TGase抑制作用的附加作用，或(ii)當(dāng)測定多種增效劑濃度的抑制作用時表示為IC50值-這提供了與10-7M的恒定視黃醇濃度組合抑制50％TGase時的增效劑的濃度。
增效劑組合和增效劑比例現(xiàn)在驚奇地發(fā)現(xiàn)某些化合物可以通過不同的機理提高由視黃醇或視黃酯形成視黃酸的內(nèi)源性水平。這些化合物在此總稱為″類維生素A增效劑″。這些包括ARAT/LRAT的抑制劑(B1增效劑)，視黃醛還原酶的抑制劑(B3增效劑)，結(jié)合CRABP-2的視黃酸抑制劑(B4增效劑)和細(xì)胞色素P450酶催化的視黃酸氧化的抑制劑(B5增效劑)，或某些其它提高或激活視黃醇脫氫酶的化合物(B2增效劑)。這些增效劑編號為B1-B5組，如上表1所述。
所述增效劑單用或彼此組合，可以通過增加可用于轉(zhuǎn)化為視黃酸的視黃醇的量并抑制視黃酸的降解來加強類維生素A的作用。所述增效劑與類維生素A(例如視黃醇、視黃酯、視黃醛、視黃酸)聯(lián)合作用，后者內(nèi)源性存在于皮膚中。然而，優(yōu)選的組合物包括在組合物中與增效劑共存的類維生素A，以使性能最佳化。
本發(fā)明部分涉及第二種組合物，該組合物含有占組合物重量約0.0001％-約50％，優(yōu)選0.001％-10％，最優(yōu)選0.001％-5％(重量)的至少一種增效劑化合物，或二元、三元、四元或五元增效劑組合物的組合，和化妝可接受載體。增效劑組合物以下列比例特定的0.001％-5％的合并濃度，在體外轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶試驗中可以抑制轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶超過50％。
本發(fā)明組合物所包括的增效劑選自a.兩種增效劑，其中兩者均選自B2、B3和B4；b.增效劑的二元組合，選自B1/B2；B1/B3，B1/B4；B1/B5；B2/B3，B2/B4；B2/B5；B3/B4，B3/B5；B4/B5c.增效劑的三元組合，選自B1/B2/B3；B1/B2/B4；B1/B2/B5；B1/B3/B4；B1/B3/B5；B1/B4/B5；B2/B3/B4；B2/B3/B5；B2/B4/B5；B3/B4/B5d.增效劑的四元組合，選自B1/B2/B3/B4；B1/B2/B3/B5；B1/B2/B4/B5；B1/B3/B4/B5；B2/B3/B4/B5；和e.5組的增效劑的組合B1/B2/B3/B4/B5。
增效劑與增效劑的比例如上所述的不同種類(B1-B5)組合的增效劑在化妝品中以下述特定比例具有介于0.001％-5％內(nèi)的抑制Tgase活性至少低于50％的最佳濃度本發(fā)明 增效劑與增效劑的比例濃度寬泛1∶10,000-10,000∶1 100mM-1nM優(yōu)選的 1∶1000-1000∶1 10mM-10nM最優(yōu)選的1∶100-100∶1 1mM-100nM最佳1∶10-10∶1 0.1mM-1μM類維生素A與增效劑的比例優(yōu)選的組合物包括組合物中與增效劑或增效劑的組合共存的類維生素A(例如視黃醇，視黃酯，和視黃醛)，從而使性能最佳化。
為了使性能最佳化，類維生素A與增效劑的濃度應(yīng)該以下列比例存在于組合物中
本發(fā)明增效劑與類維生素A的比例 濃度寬泛 10,000∶1-1∶10,000 100mM-1nM增效劑；0.001-10％類維生素A優(yōu)選的1000∶1-1∶1000 10mM-10nM增效劑；0.001-10％類維生素A最優(yōu)選的 100∶1-1∶1001mM-100nM增效劑；0.01-1％類維生素A實施例中所用各種增效劑的濃度由于目的在于通過活性化合物與視黃醇的組合來建立對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶表達(dá)的協(xié)同抑制，所以當(dāng)分別在視黃醇的存在下進(jìn)行測試時，必需測定活性化合物的劑量反應(yīng)分布(IC20和IC50值)。屬于B2-B4的增效劑的詳細(xì)劑量反應(yīng)在下表中給出，之前為IC50和IC20表。這個數(shù)據(jù)用來鑒定各活性化合物的適當(dāng)次最大抑制濃度，最終可以鑒定在視黃醇存在下活性化合物的混合物的推定協(xié)同作用。下表中的數(shù)據(jù)表示IC50和IC20(對照的80％)值和測試增效劑的組合的協(xié)同性時所用的濃度。
為了證明兩種化合物的協(xié)同作用，必需選擇至多為IC20的濃度來測試，也就是說，獨自使視黃醇對Tgase表達(dá)的抑制作用增效20％時的化合物濃度。兩種這樣的化合物應(yīng)該具有40％的附加抑制作用。利用這種策略來測定濃度保留下40-100％的進(jìn)一步抑制的窗口以測定兩種試驗化合物的協(xié)同作用。
更具挑戰(zhàn)性的濃度標(biāo)準(zhǔn)將是選擇化合物單用沒有抑制作用，但組合時表現(xiàn)出抑制作用時的濃度。然而在這樣的研究中，我們選擇更具挑戰(zhàn)性的標(biāo)準(zhǔn)。我們選擇了化合物的比最小有效Tgase抑制濃度低10-1000倍的濃度。利用這樣非常低濃度鑒定協(xié)同性組合應(yīng)該意味著鑒定出最有效的協(xié)同組合。

ND沒有測定或沒有觀察到一個確定的劑量反應(yīng)。對于協(xié)同作用，測試寬范圍的濃度(4個數(shù)量級10-5至10-9M)。
B2-B4類增效劑的劑量反應(yīng)下列各表包括有關(guān)屬于B2-B4類的增效劑的劑量反應(yīng)的數(shù)據(jù)。增效劑的濃度是以摩爾濃度計；4個復(fù)制品的平均Tgase水平和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示為對照(0.1％DMSO和10-7M視黃醇)的百分比(％)。較高數(shù)值(接近100或大于100)表示沒有Tgase的抑制作用。數(shù)值越低，抑制劑該濃度下的效價越高。由這個劑量反應(yīng)表計算出IC50和IC20值并表示在上表中。
B2類增效劑磷酯酰膽堿(B2)
鞘磷酯(B2)
TCC(B2)
1，2-二辛酰基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺(B2)
B3類增效劑安吖啶B3
甘珀酸(B3)
甘草次酸(B3)
亞油酸(B3)
亞麻酸(B3)
肉豆蔻酸(B3)
香蘭素(B3)
B4類增效劑十六烷二酸(B4)
12-羥基硬脂酸(B4)
反油酸(B4)
亞麻子油(B4)
異硬脂酸(B4)
2-羥基硬脂酸(B4)
增效劑的二元組合對Tgase抑制作用的協(xié)同效果為了研究兩種不同種類的增效劑的組合與視黃醇對Tgase表達(dá)的協(xié)同抑制作用，在上表給出的濃度下測試化合物的選定組合。測試濃度比Tgase活性最低抑制所需濃度(即IC20)小一個對數(shù)數(shù)量級。所述化合物單獨和以組合方式進(jìn)行測試并給出各化合物和各組合的Tgase的％抑制率。
下列實施例給出所有可能的二元組合的協(xié)同組合(B1/B2；B1/B3，B1/B4；B1/B5；B2/B3，B2/B4；B2/B5；B3/B4，B3/B5；B4/B5)。當(dāng)組合物的％抑制率大于各化合物加和在一起的抑制率時，表示具有協(xié)同作用(即組合物的抑制率大于化合物1的抑制率+化合物2的抑制率)。下表中所有二元組合實施例均協(xié)同抑制Tgase。

增效劑的三元組合對Tgase抑制作用的協(xié)同效果為了研究三種不同種類的增效劑的組合與視黃醇對Tgase表達(dá)的協(xié)同抑制作用，在上表給出的濃度下測試化合物的選定組合。測試濃度比Tgase活性最低抑制所需濃度(即IC20)小一個對數(shù)數(shù)量級。所述化合物單獨和以組合方式進(jìn)行測試并給出各化合物和各組合的Tgase的％抑制率。下列實施例給出所有可能的三元組合的協(xié)同組合(B1/B2/B3；B1/B2/B4；B1/B2/B5；B1/B3/B4；B1/B3/B5；B1/B4/B5；B2/B3/B4；B2/B3/B5；B2/B4/B5；B3/B4/B5)。當(dāng)組合物的％抑制率大于各化合物加和在一起的抑制率時，則表示具有協(xié)同作用(即組合物的抑制率大于化合物1的抑制率+化合物2的抑制率+化合物3的抑制率)。下表中所有三元組合實施例在10-7M視黃醇的存在下均協(xié)同抑制Tgase。
化合物1化合物2 化合物3TG作TG作TG作TG作為％C 為％C 為％C 為％C化合物 化合物 化合物 組合1 2 3B1/B2/B3組合磷脂酰膽堿 甘草次酸 蓖麻油甲酯酸 88 91 85 53(MEA)磷脂酰膽堿 甘草次酸 Echinacea 88 91 119 52磷脂酰膽堿 甘草次酸 柑桔素 88 91 94 52磷脂酰膽堿 甘草次酸 乙酰鞘氨醇 88 91 99 58(C2神經(jīng)酰胺)磷脂酰膽堿 甘草次酸 法呢醇 88 91 118 491，2-二辛酰甘草次酸 α-二氫大馬81 91 89 58基-sn-甘油 酮基-3-二氧磷基乙醇酰胺1，2-二辛酰磷脂酰膽堿柑桔素 81 88 94 66基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺
1，2-二辛酰安吖啶-HCl亞油?；灰? 81 79 127 60基-sn-甘油 醇酰胺基-3-二氧磷 (LAMEA)基乙醇酰胺1，2-二辛酰安吖啶-HCl棕櫚酸酰胺一 81 79 95 63基-sn-甘油 乙醇酰胺基-3-二氧磷基乙醇酰胺1，2-二辛酰甘草次酸 α-二氫大馬 81 91 89 58基-sn-甘油 酮基-3-二氧磷基乙醇酰胺1，2-二辛酰甘草次酸 柑桔素81 91 94 75基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺1，2-二辛酰甘草次酸 Echinacea 81 91 119 77基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺1，2-二辛酰甘草次酸 二甲基咪唑啉 81 91 87 67基-sn-甘油 酮基-3-二氧磷基乙醇酰胺蓖麻油甲酯酸 甘珀酸磷脂酰膽堿85 95 88 63(MEA)B1/B2/B4組合B1/B2/B5組合磷脂酰膽堿 苯咪丁酮 Echinacea 88 84 119 75
磷脂酰膽堿苯咪丁酮柑桔素 88 84 94 83磷脂酰膽堿苯咪丁酮香葉醇 88 84 105 76磷脂酰膽堿苯咪丁酮法呢醇 88 84 118 82磷脂酰膽堿苯咪丁酮乙酰鞘氨醇 88 84 99 82(C2神經(jīng)酰胺)磷脂酰膽堿咪康唑 α-紫羅蘭酮 88 92 88 70磷脂酰膽堿咪康唑 蓖麻油甲酯酸88 92 85 72(MEA)B1/B3/B4組合安吖啶-HCl二甲基咪唑啉反油酸 79 87 93 0酮α-紫羅蘭酮 安吖啶-HCl 12-羥基硬脂 68 79 95 62酸Lyrial十六烷二酸 香蘭素 97 90 134 81己?；拾贝? 異硬脂酸甘草次酸104 87 91 58(C6神經(jīng)酰胺)B1/B3/B5組合安吖啶-HCl二甲基咪唑啉2-羥基喹啉 79 87 95 32酮 (2-羥基喹啉)安吖啶-HCl二甲基咪唑啉月桂基羥乙基79 87 52 -13酮 咪唑啉安吖啶-HCl二甲基咪唑啉槲皮素 79 87 92 -24酮安吖啶-HCl二甲基咪唑啉油酰基羥乙基79 87 76 39酮 咪唑啉安吖啶-HCl 二甲基咪唑啉 7H-苯并咪唑 79 87 94 32酮并[2，1-a]苯并[de]-異喹啉-7-酮安吖啶-HCl 二甲基咪唑啉 香豆素79 87 80 30酮己?；拾贝? 甘珀酸油酰基羥乙基 104 88 76 64(C6神經(jīng)酰咪唑啉胺)己?；拾贝? 3，4，-二氫- 香蘭素104 90 134 62(C6神經(jīng)酰 2(1H)-喹啉胺)酮(氫化喹諾酮)安吖啶-HCl 氨基苯并三唑 Echinacea 79 105 119 48己酰基鞘氨醇 氨基苯并三唑 鞘磷脂104 105 60 69(C6神經(jīng)酰胺)安吖啶-HCl 氨基苯并三唑 乙酰鞘氨醇79 105 99 -7(C2神經(jīng)酰胺)α-紫羅蘭酮安吖啶-HCl7H-苯并咪唑 68 79 94 54并[2，1-a]苯并[de]-異喹啉-7-酮Utrecht-2 甘珀酸槲皮素76 88 92 74Utrecht-2 甘珀酸油酰基羥乙基 76 88 76 69咪唑啉Utrecht-2 甘珀酸7H-苯并咪唑 76 88 94 73并[2，1-a]苯并[de]-異喹啉-7-酮
Utrecht-2 甘珀酸3，4-二氫- 76 88 90702(1H)-喹啉酮(氫化喹諾酮)肉豆蔻酸 苯咪丁酮 香葉醇 79 84 105 74肉豆蔻酸 苯咪丁酮 α-二氫大馬79 84 8973酮肉豆蔻酸 苯咪丁酮 乙酰鞘氨醇 79 84 9970(C2神經(jīng)酰胺)油基甜菜堿酮康唑甘珀酸 62 85 8878油基甜菜堿酮康唑甘草次酸 62 85 9171油基甜菜堿酮康唑亞油酸 62 85 1183油基甜菜堿酮康唑亞麻酸 62 85 208 80己?；拾贝? 3，4，-二氫 香蘭素 104 90 134 62(C6神經(jīng)酰 2(1H)-喹啉胺) 酮(氫化喹諾酮)B1/B4/B5組合反油酸2-羥基喹啉蓖麻油甲酯酸 93 95 8575(2-羥基喹 (MEA)啉)反油酸2-羥基喹啉柑桔素 93 95 9486(2-羥基喹啉)反油酸2-羥基喹啉α-二氫大馬93 95 8980(2-羥基喹 酮啉)
反油酸 2-羥基喹啉法呢醇 93 95 118 82(2-羥基喹啉)反油酸 2-羥基喹啉番紅花酸93 95 90 78(2-羥基喹啉)B2/B3/B4組合1，2-二辛酰甘草次酸 12-羥基硬脂 81 91 95 57基-sn-甘油 酸基-3-二氧磷基乙醇酰胺1，2-二辛酰甘草次酸 亞麻子油81 91 103 62基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺1，2-二辛酰甘草次酸 反油酸 81 91 93 75基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺磷脂酰膽堿 2-羥基硬脂花生四烯酸 88 83 78 60酸(Na+鹽)B2/B3/B5組合磷脂酰膽堿 苯咪丁酮 亞麻酸 88 84 208 84磷脂酰膽堿 苯咪丁酮 花生四烯酸 88 84 78 83(Na+鹽)1，2-二辛酰安吖啶-HCl苯咪丁酮81 79 84 58基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺
1，2-二辛酰 安吖啶-HCl7H-苯并咪唑 81 79 94 59基-sn-甘油 并[2，1-a]苯基-3-二氧磷并[de]-異喹基乙醇酰胺 啉-7-酮1，2-二辛酰 甘草次酸 3，4，-二氫- 81 91 90 56基-sn-甘油 2(1H)-喹啉基-3-二氧磷酮(氫化喹諾基乙醇酰胺 酮)1，2-二辛酰 甘草次酸 2-羥基喹啉 81 91 95 75基-sn-甘油 (2-羥基喹基-3-二氧磷啉)基乙醇酰胺1，2-二辛酰 甘草次酸 氨基苯并三唑 81 91 10572基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺1，2-二辛酰 甘草次酸 月桂基羥乙基 81 91 52 79基-sn-甘油 咪唑啉基-3-二氧磷基乙醇酰胺l，2-二辛酰 甘草次酸 槲皮素 81 91 92 73基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺1，2-二辛酰 甘草次酸 苯咪丁酮 81 91 84 54基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺
1，2-二辛酰 甘草次酸克霉唑81 91 7942基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺1，2-二辛酰 甘草次酸咪康唑81 91 8243基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺B2/B4/B5組合磷脂酰膽堿2-羥基硬脂 氨基苯并三唑 88 83 105 77酸磷脂酰膽堿2-羥基硬脂 月桂基羥乙基 88 83 5274酸 咪唑啉磷脂酰膽堿2-羥基硬脂 槲皮素88 83 9269酸磷脂酰膽堿2-羥基硬脂 油?；u乙基 88 83 7675酸 咪唑啉磷脂酰膽堿2-羥基硬脂 7H-苯并咪唑 88 83 9479酸 并[2，1-a]苯并[de]-異喹啉-7-酮磷脂酰膽堿苯咪丁酮反油酸88 84 9381B3/B4/B5組合反油酸2-羥基喹啉 甘珀酸93 95 8869(2-羥喹啉)反油酸2-羥基喹啉 香蘭素93 95 134 81(2-羥喹啉)安吖啶-HC1氨基苯并三唑亞麻子油 79 105 103 45
肉豆蔻酸苯咪丁酮 12-羥基硬脂 79 84 95 81酸肉豆蔻酸苯咪丁酮 亞麻子油 79 84 103 81反油酸 2-羥基喹啉花生四烯酸 93 95 78 63(2-羥喹啉)(Na+鹽)增效劑的四元組合對Tgase抑制作用的協(xié)同效果為了研究四種不同種類的增效劑的組合與視黃醇對Tgase表達(dá)的協(xié)同抑制作用，在上表給出的濃度下測試化合物的選定組合。試驗濃度比Tgase活性最低抑制所需濃度(即IC20)小一個對數(shù)數(shù)量級。
所述化合物單獨和以組合方式進(jìn)行測試并給出各化合物和各組合的Tgase的％抑制率。下列實施例給出所有可能的三元組合的協(xié)同組合(B1/B2/B3/B4；B1/B2/B3/B5；B1/B2/B4/B5；B1/B3/B4/B5；B2/B3/B4/B5；)。如果(4種增效劑)的組合的％抑制率差別比3種增效劑組合的抑制率差別大于30％(即4種增效劑組合物的％抑制率等于或大于3中增效劑組合的％抑制率+30％)，則證明具有協(xié)同作用。下表中增效劑的所有四元組合均表現(xiàn)出協(xié)同作用。
化合物1 化合物2化合物3 化合物4 四元三元差異TG (1-3(＜30％(％C) 組 ＝協(xié)合；TG 同)％C)B1/B2/B3/B4組合蓖麻油甲酯磷脂酰膽堿甘草次酸12-羥基-硬21 64 42酸(MEA) 脂酸柑桔素磷脂酰膽堿甘草次酸12-羥基-硬15 57 41脂酸亞油酰基一1，2-二辛酰甘草次酸12-羥基-硬 -34043乙醇酰胺 基-sn-甘油 脂酸(LAMEA) 基-3-二氧磷基乙醇酰胺亞油酰基一1，2-二辛酰甘草次酸異硬脂酸5 4035乙醇酰胺 基-sn-甘油(LAMEA) 基-3-二氧磷基乙醇酰胺亞油?；?，2-二辛酰安吖啶-HCl 12-羥基-硬 -34245乙醇酰胺 基-sn-甘油 脂酸(LAMEA) 基-3-二氧磷基乙醇酰胺亞油?；?，2-二辛酰安吖啶-HCl 反油酸 8 4234乙醇酰胺 基-sn-甘油(LAMEA) 基-3-二氧磷基乙醇酰胺己?；拾盩CC甘草次酸異硬脂酸754 47醇(C6神經(jīng)酰胺)LyrialTCC香蘭素 十六烷二酸 10 48 38椰油基羥乙1，2-二辛酰甘草次酸異硬脂酸037 37基咪唑啉 基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺椰油基羥乙磷脂酰膽堿花生四烯酸 2-羥基-硬-1 37 38基咪唑啉(Na+鹽)脂酸椰油基羥乙1，2-二辛酰 甘草次酸 亞麻子油 -2 45 47基咪唑啉 基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺B1/B2/B3/B5組合蓖麻油甲酯磷脂酰膽堿甘草次酸 苯咪丁酮 20 64 44酸(MEA)蓖麻油甲酯磷脂酰膽堿甘草次酸 克霉唑 26 64 38酸(MEA)蓖麻油甲酯磷脂酰膽堿甘草次酸 咪康唑 9 64 55酸(MEA)蓖麻油甲酯磷脂酰膽堿甘草次酸 酮康唑 5 64 59酸(MEA)蓖麻油甲酯磷脂酰膽堿甘草次酸 月桂基羥乙 15 64 49酸(MEA)基咪唑啉蓖麻油甲酯磷脂酰膽堿甘草次酸 油?；u乙 2 64 61酸(MEA)基咪唑啉蓖麻油甲酯磷脂酰膽堿甘草次酸 7H-苯并咪25 64 39酸(MEA)唑并[2，1-a]苯并[de]-異喹啉-7-酮Echinacea磷脂酰膽堿甘草次酸12-羥基硬18 62 44脂酸Echinacea磷脂酰膽堿甘草次酸苯咪丁酮 22 62 40Echinacea磷脂酰膽堿甘草次酸克霉唑 24 62 38Echinacea磷脂酰膽堿甘草次酸咪康唑 13 62 50
Echinacea磷脂酰膽堿甘草次酸 酮康唑 12 62 50Echinacea磷脂酰膽堿甘草次酸 月桂基羥乙 14 62 49基咪唑啉Echinacea磷脂酰膽堿甘草次酸 油?；u乙 3 62 59基咪唑啉Echinacea磷脂酰膽堿甘草次酸 7H-苯并咪 24 62 39唑并[2，1-a]苯并[de]-異喹啉-7-酮柑桔素磷脂酰膽堿甘草次酸咪康唑 1 57 56柑桔素磷脂酰膽堿甘草次酸酮康唑 22 57 34柑桔素磷脂酰膽堿甘草次酸月桂基羥乙 10 57 46基咪唑啉柑桔素磷脂酰膽堿甘草次酸油酰基羥乙 2 57 54基咪唑啉柑桔素磷脂酰膽堿甘草次酸7H-苯并咪 15 57 42唑并[2，1-a]苯并[de]-異喹啉-7-酮棕櫚酸酰胺磷脂酰膽堿甘草次酸咪康唑 -2 39 41一乙醇酰胺棕櫚酸酰胺磷脂酰膽堿甘草次酸油?；u乙 6 39 33一乙醇酰胺 基咪唑啉法呢醇磷脂酰膽堿甘草次酸咪康唑 3 43 40法呢醇磷脂酰膽堿甘草次酸油?；u乙 6 43 37基咪唑啉香葉醇1，2-二辛酰安吖啶-HCl咪康唑11 47 36基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺香葉醇1，2-二辛酰安吖啶-HCl油?；u乙3 47 44基-sn-甘油 基咪唑啉基-3-二氧磷基乙醇酰胺亞油?；?，2-二辛酰甘草次酸 苯咪丁酮 2 40 37乙醇酰胺 基-sn-甘油(LAMEA) 基-3-二氧磷基乙醇酰胺亞油?；?，2-二辛酰甘草次酸 咪康唑5 40 35乙醇酰胺 基-sn-甘油(LAMBA) 基-3-二氧磷基乙醇酰胺亞油?；?，2-二辛酰甘草次酸 酮康唑0 40 40乙醇酰胺 基-sn-甘油(LAMEA) 基-3-二氧磷基乙醇酰胺亞油酰基一1，2-二辛酰甘草次酸 月桂基羥乙-2 40 41乙醇酰胺 基-sn-甘油 基咪唑啉(LAMEA) 基-3-二氧磷基乙醇酰胺亞油酰基一1，2-二辛酰甘草次酸 油酰基羥乙5 40 35乙醇酰胺 基-sn-甘油 基咪唑啉(LAMEA) 基-3-二氧磷基乙醇酰胺亞油?；?，2-二辛酰甘草次酸 7H-苯并咪 1 40 39乙醇酰胺 基-sn-甘油 唑并[2，1-(LAMEA) 基-3-二氧a]苯并磷基乙醇酰 [de]-異喹胺 啉-7-酮亞油?；?，2-二辛酰安吖啶-HCl苯咪丁酮 7 42 35乙醇酰胺 基-sn-甘油(LAMEA) 基-3-二氧磷基乙醇酰胺亞油?；?，2-二辛酰安吖啶-HCl克霉唑1042 32乙醇酰胺 基-sn-甘油(LAMEA) 基-3-二氧磷基乙醇酰胺亞油?；?，2-二辛酰安吖啶-HCl咪康唑5 42 37乙醇酰胺 基-sn-甘油(LAMEA) 基-3-二氧磷基乙醇酰胺亞油?；?，2-二辛酰安吖啶-HCl酮康唑1142 32乙醇酰胺 基-sn-甘油(LAMEA) 基-3-二氧磷基乙醇酰胺亞油?；?1，2-二辛酰安吖啶-HCl月桂基羥乙-44246乙醇酰胺 基-sn-甘油 基咪唑啉(LAMEA)基-3-二氧磷基乙醇酰胺亞油?；?1，2-二辛酰安吖啶-HCl油酰基羥乙5 4237乙醇酰胺 基-sn-甘油 基咪唑啉(LAMEA)基-3-二氧磷基乙醇酰胺亞油?；?1，2-二辛酰安吖啶-HCl7H-苯并咪 8 4235乙醇酰胺 基-sn-甘油 唑并[2，1-(LAMEA)基-3-二氧a]苯并磷基乙醇酰 [de]-異喹胺 啉-7-酮棕櫚酸酰胺 1，2-二辛酰安吖啶-HCl咪康唑134330一乙醇酰胺 基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺棕櫚酸酰胺 1，2-二辛酰安吖啶-HCl油?；u乙3 4340一乙醇酰胺 基-sn-甘油 基咪唑啉基-3-二氧磷基乙醇酰胺α-二氫大馬1，2-二辛酰安吖啶-HCl咪康唑114837酮 基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺
α-二氫大馬 1，2-二辛酰 安吖啶-HCl 酮康唑 13 48 34酮基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺α-二氫大馬 1，2-二辛酰 安吖啶-HCl 月桂基羥乙 15 48 33酮基-sn-甘油基咪唑啉基-3-二氧磷基乙醇酰胺α-二氫大馬 1，2-二辛酰 安吖啶-HCl 油?；u基 3 48 45酮基-sn-甘油咪唑啉基-3-二氧磷基乙醇酰胺蓖麻油甲酯磷脂酰膽堿甘珀酸 12-羥基硬 3 55 52酸(MEA) 脂酸蓖麻油甲酯磷脂酰膽堿甘珀酸 苯咪丁酮 6 55 49酸(MEA)蓖麻油甲酯磷脂酰膽堿甘珀酸 咪康唑 -2 55 57酸(MEA)蓖麻油甲酯磷脂酰膽堿甘珀酸 酮康唑 1 55 54酸(MEA)蓖麻油甲酯磷脂酰膽堿甘珀酸 月桂基羥乙 4 55 51酸(MEA) 基咪唑啉蓖麻油甲酯磷脂酰膽堿甘珀酸 油?；u乙 3 55 52酸(MEA) 基咪唑啉蓖麻油甲酯磷脂酰膽堿 甘珀酸7H-苯并咪 11 55 44酸(MEA) 唑并[2，1-a]苯并[de]-異喹啉-7-酮柑桔素磷脂酰膽堿 亞油酸苯咪丁酮 -1 45 46香葉醇磷脂酰膽堿 亞油酸苯咪丁酮 140 39乙酰鞘氨醇磷脂酰膽堿 亞油酸苯咪丁酮 040 40(C2神經(jīng)酰胺)乙酰鞘氨醇磷脂酰膽堿 亞麻酸苯咪丁酮 10 40 30(C2神經(jīng)酰胺)二甲基咪唑TCC 安吖啶-HCl反油酸 14 47 33啉酮二甲基咪唑TCC 安吖啶-HCl槲皮素 12 44 32啉酮二甲基咪唑TCC 安吖啶-HCl香豆素 14 58 44啉酮己?；拾盩CC 甘草次酸 氨基苯并三 848 40醇(C6神經(jīng) 唑酰胺)α-二氫大馬 TCC 肉豆蔻酸 苯咪丁酮 10 44 34酮B1/B2/B4/B5組合Lyrial香蘭素 十六烷二酸咪康唑 12 48 36Lyrial香蘭素 十六烷二酸油酰基羥乙 448 45基咪唑啉番紅花酸 TCC 反油酸2-羥基喹啉 11 48 37(2-羥喹啉)
己?；拾备什荽嗡? 12-羥基硬 氨基苯并三 14 48 33醇(C6神經(jīng) 脂酸 唑酰胺)二甲基咪唑磷脂酰膽堿2-羥基硬脂7H-苯并咪 2 44 42啉酮酸唑并[2，1-a]苯并[de]-異喹啉-7-酮亞油甲芐胺磷脂酰膽堿2-羥基硬脂7H-苯并咪 5 44 39酸唑并[2，1-a]苯并[de]-異喹啉-7-酮香葉草基香磷脂酰膽堿2-羥基硬脂7H-苯并咪 9 44 35葉醇酸唑并[2，1-a]苯并[de]-異喹啉-7-酮椰油基羥乙磷脂酰膽堿2-羥基硬脂7H-苯并咪 -8 44 52基咪唑啉酸唑并[2，1-a]苯并[de]-異喹啉-7-酮乙酰鞘氨醇磷脂酰膽堿2-羥基硬脂7H-苯并咪 10 44 34(C2神經(jīng)酰 酸唑并[2，1-胺) a]苯并[de]-異喹啉-7-酮番紅花酸 磷脂酰膽堿 2-羥基硬脂 7H-苯并咪 10 44 34酸 唑并[2，1-a]苯并[de]-異喹啉-7-酮N，N-二乙基 磷脂酰膽堿 2-羥基硬脂 7H-苯并咪 4 44 40椰油酰胺 酸 唑并[2，1-(椰油酰胺 a]苯并DEA) [de]-異喹啉-7-酮椰油羥乙基磷脂酰膽堿 反油酸 苯咪丁酮-4 30 34咪唑啉B1/B3/B4/B5組合二甲基咪唑安吖啶-HCl 反油酸 咪康唑 7 47 40啉酮二甲基咪唑安吖啶-HCl 反油酸 酮康唑 6 47 41啉酮二甲基咪唑安吖啶-HCl 反油酸 油?；u乙 3 47 44啉酮 基咪唑啉己酰基鞘氨甘草次酸異硬脂酸克霉唑 20 54 34醇(C6神經(jīng)酰胺)己?；拾备什荽嗡岙愑仓徇淇颠? 10 54 43醇(C6神經(jīng)酰胺)己?；拾备什荽嗡岙愑仓嵩鹿鸹u乙 20 54 33醇(C6神經(jīng) 基咪唑啉酰胺)
己酰基鞘氨甘草次酸 異硬脂酸 油?；u乙5 54 48醇(C6神經(jīng) 基咪唑啉酰胺)番紅花酸 亞油酸反油酸2-羥基喹啉0 48 48(2-羥喹啉)番紅花酸 亞麻酸反油酸2-羥基喹啉-2 48 50(2-羥喹啉)蓖麻油甲酯亞油酸反油酸2-羥基喹啉-1 31 32酸(MEA) (2-羥喹啉)椰油基羥乙甘珀酸反油酸2-羥基喹啉-6 28 34基咪唑啉 (2-羥喹啉)B2/B3/B4/B5組合1，2-二辛酰 甘草次酸 異硬脂酸 酮康唑4 37 33基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺1，2-二辛酰 甘草次酸 異硬脂酸 油?；u乙6 37 31基-sn-甘油基咪唑啉基-3-二氧磷基乙醇酰胺磷脂酰膽堿花生四烯酸2-羥基硬脂咪康唑6 37 31(Na+鹽) 酸磷脂酰膽堿花生四烯酸2-羥基硬脂油酰基羥乙5 37 32(Na+鹽) 酸基咪唑啉
1，2-二辛酰 甘草次酸 亞麻于油咪康唑 -145 47基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺1，2-二辛酰 甘草次酸 亞麻子油油?；u乙 7 45 38基-sn-甘油 基咪唑啉基-3-二氧磷基乙醇酰胺磷脂酰膽堿 甘珀酸2-羥基硬脂 7H-苯并咪 8 44 36酸 唑并[2，1-a]苯并[de]-異喹啉-7-酮磷脂酰膽堿 亞油酸2-羥基硬脂 7H-苯并咪 -344 47酸 唑并[2，1-a]苯并[de]-異喹啉-7-酮磷脂酰膽堿 甘草次酸 反油酸 苯咪丁酮 -330 33磷脂酰膽堿 亞油酸反油酸 苯咪丁酮 -230 32化妝可接受載體本發(fā)明的組合物還含有化妝可接受載體以在組合物中發(fā)揮活性成分的稀釋劑、分散劑或載體的作用，從而在將組合物涂敷在皮膚上時使它們易于分布。
非水或除水以外的載體可以包括液體或固體潤膚劑、溶劑、保濕劑、增稠劑和散劑。尤其優(yōu)選的非水載體是聚二甲基硅氧烷和/或聚二甲基苯基硅氧烷。本發(fā)明的聚硅氧烷可以是那些25℃下粘度介于約10-10,000,000厘沲內(nèi)的聚硅氧烷。尤其希望是低粘度和高粘度聚硅氧烷的混合物。這些聚硅氧烷購自General Electric Company，商標(biāo)名為Vicasil、SE和SF，和購自Dow Corning Company的200和550系列。聚硅氧烷在本發(fā)明組合物中可以使用的量介于組合物重量的5-95％，優(yōu)選25-90％(重量)。
任選的皮膚有益原料和化妝品輔劑油或油性原料可以與乳化劑一起存在以提供油包水乳液或水包油乳液，這大部分取決于所用乳化劑的平均親水-親脂平衡(HLB)。
本發(fā)明的化妝品組合物中可以存在不同種類的活性成分?；钚詣┍欢x為除潤膚劑和其它只改善組合物物理特性的組分之外的皮膚或毛發(fā)有益劑。雖然不限于這種分類，一般性實例包括防曬劑、亮膚劑和曬褐劑。
防曬劑包括那些常用于阻斷紫外光的物質(zhì)。示例化合物是PABA、肉桂酸酯和水楊酸酯的衍生物。譬如，可以使用甲氧基肉桂酸辛酯和2-羥基-4-甲氧基二苯酮(也稱作羥苯甲酮)。甲氧基肉桂酸辛酯和2-羥基-4-甲氧基二苯酮分別以商標(biāo)Parsol MCX和Benzophenone-3銷售。
防曬劑在乳液中的精確用量可以根據(jù)對太陽紫外輻射所需的防護(hù)程度而變化。
另一種優(yōu)選的優(yōu)選組分選自必需脂肪酸(EFAs)，也就是那些所有細(xì)胞的質(zhì)膜形成中所必需的脂肪酸，在角質(zhì)細(xì)胞中EFA缺乏導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖。補充EFA可以校正這種現(xiàn)象。EFA也可以提高表皮的脂質(zhì)生物合成并為表皮的屏障形成提供脂質(zhì)。所述的必需脂肪酸優(yōu)選自亞油酸、γ-亞麻酸、高-γ-亞麻酸、columbinic酸、二十碳-(n-6，9，13)-三烯酸、花生四烯酸、γ-亞麻酸、二十碳五烯酸、己烯酸及其混合物。
潤膚劑常常摻混在本發(fā)明的化妝品組合物中。此類潤膚劑的水平可以是組合物總重量的約0.5％-約50％，優(yōu)選約5％-30％(重量)。潤膚劑在通用化學(xué)目錄下可以劃分為酯類、脂肪酸和醇類，多元醇，和烴類。
酯可以是單-或二-酯。脂肪酸二酯的可接受實例包括己二酸二丁酯、癸二酸二乙酯、二聚酸二異丙酯，和琥珀酸二辛酯?？山邮艿闹ф溨觉グㄈ舛罐⑺?-乙基-己酯、硬脂酸異丙酯和棕櫚酸異硬脂基酯?？山邮艿娜狨グㄈ齺営退崛惐ズ蜋幟仕崛鹿瘐??？山邮艿闹辨溨觉グㄗ貦八嵩鹿瘐ァ⑷樗崛舛罐Ⅴ?、芥酸油酯和油酸硬脂基酯。優(yōu)選的酯包括椰油辛酸酯/癸酸酯(椰油辛酸酯和椰油癸酸酯的混合物)、丙二醇肉豆蔻基醚乙酸酯、己二酸二異丙酯和辛酸鯨蠟酯。
適當(dāng)?shù)闹敬己退岚ň哂?0-20個碳原子的那些化合物。尤其優(yōu)選此類化合物例如鯨蠟基、肉豆蔻基、棕櫚基和硬脂基醇類和酸類。
在可以起潤膚劑作用的多元醇中是直鏈或支鏈烷基多羥基化合物。例如，優(yōu)選丙二醇、山梨糖醇和甘油。也可以使用聚合多元醇，例如聚丙二醇和聚乙二醇。丁二醇和丙二醇也尤其優(yōu)選作為滲透促進(jìn)劑。
可以起潤膚劑作用的烴類實例是那些具有12-30個碳原子的烴鏈的烴類。具體實例包括礦物油、礦脂、角鯊烯和異鏈烷烴。
本發(fā)明化妝品組合物中的另一類功能組分是增稠劑。增稠劑的含量一般是組合物重量的0.1-20％(重量)，優(yōu)選約0.5％-10％(重量)。增稠劑實例是B.F.Goodrich公司以商品名Carbopol出售的交聯(lián)聚丙烯酸酯材料。也可以使用樹膠，例如黃原膠、角叉菜膠、明膠、梧桐膠、果膠和槐樹豆膠。在某些情形下作為聚硅氧烷或潤膚劑的材料也可以發(fā)揮增稠功能。譬如，大于10厘沲的聚硅氧烷膠和酯如硬脂酸甘油酯具有雙重功能。
本發(fā)明的化妝品組合物中可以摻混粉末。這些粉末包括白堊粉、滑石粉、漂白土、高嶺土、淀粉、綠土粘土、化學(xué)改性的硅酸鎂鋁、有機改性的蒙脫石粘土、水合硅酸鋁、煅燒硅石、辛烯基琥珀酸淀粉鋁和它們的混合物。
其它次要輔助成分也可以摻混在所述的化妝品組合物中。這些組分可以包括著色劑、遮光劑和香精。這些物質(zhì)的含量可以是組合物重量的0.001％-20％(重量)。
組合物的使用本發(fā)明的組合物主要意在作為局部涂敷在人皮膚上的產(chǎn)品，尤其是作為調(diào)理和平撫皮膚的試劑，和防止和減少皺紋和老化皮膚出現(xiàn)的試劑。
在使用中，從合適的容器或涂敷器將少量的組合物，例如1-5ml，涂敷在皮膚的暴露區(qū)域，并且如果必要，隨后用手或手指或適當(dāng)裝置鋪展和/或摩擦到皮膚內(nèi)。
產(chǎn)品形式和包裝本發(fā)明的局部皮膚處理組合物可以配制為洗劑、流體霜劑、霜劑或凝膠。所述的組合物可以包裝在適合其粘度和消費者用途的適當(dāng)容器中。例如，洗劑或流體霜劑包裝在瓶或滾珠涂敷器，或膠囊，或發(fā)生劑驅(qū)動氣溶膠裝置或帶有適合手指操作的泵的容器中。當(dāng)組合物是霜劑時，可以簡單儲藏在不變形瓶或擠壓式容器如管或有蓋的罐內(nèi)。
本發(fā)明因此還提供含有化妝上可接受的本發(fā)明定義組合物的密閉容器。
權(quán)利要求
1.一種護(hù)膚組合物，含有a.0.001％-10％的類維生素A；b.至少兩種屬于B1-B5類的含量為0.0001％-50％的類維生素A增效劑的組合物，其中兩種增效劑相互的比例范圍為1∶1000-1000∶1；c.化妝可接受載體。
2.權(quán)利要求1的護(hù)膚組合物，其中所述增效劑的組合物含有至少三種屬于B1-B5類的含量為0.0001％-50％的增效劑。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的護(hù)膚組合物，其中所述第二組合物具有至少四種屬于B1-B5類的含量為0.0001％-50％的增效劑的組合。
4.上述權(quán)利要求任一項所述的護(hù)膚組合物，其中所述第二組合物具有全部五種屬于B1-B5類的增效劑的組合。
5.一種調(diào)理皮膚的美容方法，該方法包括將權(quán)利要求1-5中任一項的產(chǎn)品局部涂敷在皮膚上。
6.一種模擬視黃酸對皮膚的作用的美容方法，該方法包括將權(quán)利要求1-5中任一項的產(chǎn)品涂敷在皮膚上。
7.一種護(hù)膚組合物，含有a.至少兩種屬于B1-B5類的含量為0.0001％-50％的類維生素A增效劑的組合物，其中兩種增效劑相互的比例范圍為1∶1000-1000∶1；b.化妝可接受載體。
全文摘要
一種護(hù)膚產(chǎn)品，含有約0.001％－約10％的類維生素A，與0.0001％－約50％的類維生素A增效劑的組合物。
文檔編號A61Q19/08GK1662216SQ01814860
公開日2005年8月31日 申請日期2001年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月30日
發(fā)明者S·P·格蘭格爾, I·R·斯科特, R·M·多諾文, S·T·伊奧布斯特, L·利卡梅利 申請人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司