一種獼猴桃廢棄物抗腫瘤提取物的制備方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用微生物發(fā)酵提取軟棗獼猴桃抗腫瘤物質(zhì)的方法，屬于微生物利用技術(shù)領(lǐng)域。所述方法包括如下步驟：(1)向軟棗獼猴桃或其近緣種的廢棄物碎粒中加入黑曲霉，調(diào)節(jié)濕度1～8％，pH 6.0～6.5，混勻發(fā)酵；(2)向步驟(1)所得物加入丙酮，浸提2～3次，每次浸提2～3h；(3)浸提后過濾，將濾液進行減壓蒸餾除去丙酮，冷卻至室溫，得到析出產(chǎn)物；(4)將析出產(chǎn)物溶于90～95％的乙醇中，攪拌均勻，加入石油醚萃取，收集萃取液，將萃取液減壓蒸餾，得到萃取產(chǎn)物，將所得萃取產(chǎn)物重復(fù)步驟(4)的操作一次，得到抗腫瘤提取物。本發(fā)明的方法提取效率高，產(chǎn)品純度高，產(chǎn)品收率大幅度提高，所得提取物對多種腫瘤細胞具有抑制作用。
【專利說明】
一種獼猴桃廢棄物抗腫瘤提取物的制備方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物利用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用微生物發(fā)酵從獼猴桃廢棄物 中提取天然抗腫瘤物質(zhì)的方法及該抗腫瘤提取物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤一直以來對人類健康和生命產(chǎn)生著嚴重的威脅，是人類最主要的死因之 一。目前化學藥物的治療，均伴隨著嚴重的毒副反應(yīng)，甚至免疫力極度下降，癌細胞迅速擴 散而不能達到治療作用。隨著生命科學研究的飛速發(fā)展，人們對腫瘤機制的研究不斷深入， 腫瘤細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期調(diào)控、細胞凋亡、血管生成以及細胞轉(zhuǎn)移、浸潤等各種基本 過程正在被逐步闡明，在尋求導(dǎo)向治療、基因治療、綜合治療等多途徑方法的同時，在天然 藥物中尋找有效的抗腫瘤藥物，已在國內(nèi)外醫(yī)藥界達成了共識，對天然藥物的研究占有相 當大的比例。這些天然藥物除通過抑制增殖或誘導(dǎo)凋亡等直接殺傷外，還通過免疫調(diào)節(jié)、抑 制轉(zhuǎn)移等間接調(diào)節(jié)作用于腫瘤細胞，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡。
[0003] 軟棗獼猴桃是我國一種分布較為廣泛的野生果樹，這種獼猴桃品種在我國有五十 多種，大多分布于東北、華北、西北、西南及長江流域，其中以西南的資源最為豐富，主要分 布于四川多地。國內(nèi)外研究結(jié)果表明，軟棗獼猴桃具有天然的抗腫瘤成分，侯玉芳等對長白 山產(chǎn)軟棗獼猴桃莖多糖的抗腫瘤和抗感染作用進行了體內(nèi)外試驗研究，結(jié)果表明，軟棗獼 猴桃莖多糖具有明顯的抗腫瘤和抗感染作用;方永璋等對黑龍江省產(chǎn)軟棗獼猴桃進行了抗 癌作用試驗，結(jié)果表明，在擬胃液條件下，軟棗獼猴桃果汁能夠阻斷N-亞硝基嗎啉的形成， 其阻斷率達79.52%，好于等量的抗壞血酸溶液，說明軟棗獼猴桃桃汁具有良好的抗癌作 用;翟延君等通過藥理試驗研究表明，軟棗獼猴桃根具有抗癌作用。
[0004] 目前對于從軟棗獼猴桃中提取天然抗腫瘤成分的研究已有相關(guān)文獻報道，如王小 平等采用甲醇索氏提取法提取藤梨根中總黃酮，得到的總黃酮含量為〇.〇830g，總黃酮百分 含量為7.93%;王菲采用超聲輔助提取軟棗獼猴桃中黃酮類化合物，黃酮類化合物的得率 為0.297mg/g(濕重）。王嵐等報道藤梨根正丁醇提取物對A549肺癌細胞的生長抑制作用明 顯，抑制率達78.44%;杜慶聰?shù)葘μ倮娓宜嵋阴ヌ崛∥镞M行了研究，結(jié)果表明藤梨根乙 酸乙酯提取物可以明顯抑制肺癌A549細胞的生長、增殖。
[0005] 然而，上述利用有機溶劑提取軟棗獼猴桃中抗腫瘤成分的方法，普遍存在提取效 率不高，有效成分含量低的問題，往往在提取過后，還需要對粗提物進行反復(fù)的純化過程， 步驟較為繁瑣，且對設(shè)備要求高、成本較高。提供一種新的軟棗獼猴桃中抗腫瘤物質(zhì)的提取 方法，提高有效成分含量和提取效率，充分發(fā)揮其抗腫瘤作用，成為亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是為了解決上述技術(shù)問題，而提供一種軟棗獼猴桃中抗腫瘤物質(zhì) 的提取方法，采用該方法得到的抗腫瘤提取物，具備有效成分含量高，提取效率高，產(chǎn)品收 率大幅提升，且工藝簡單，運行成本較低。
[0007] 本發(fā)明的目的之一是提供一種抗腫瘤提取物的制備方法，所述方法包括如下步 驟：
[0008] (1)將采集的軟棗獼猴桃或其近緣種的廢棄物，粉碎成不大于3mm的碎粒，向上述 碎料原料中加入黑曲霉，調(diào)節(jié)濕度為1~8%，pH為6.0~6.5,混勻后進行發(fā)酵，發(fā)酵時間不 少于48h;所述廢棄物為果實、莖、葉和果渣中的至少一種；
[0009] (2)向步驟(1)的發(fā)酵所得物中加入丙酮，所述丙酮的加入量與發(fā)酵所得物的重量 比為1.5~3:1，充分攪拌，浸提2~3次，每次浸提的時間為2~3h;
[0010] (3)浸提結(jié)束后進行過濾，將所得濾液進行減壓蒸餾除去丙酮，將剩余物冷卻至室 溫，得到析出產(chǎn)物；
[0011] (4)將析出產(chǎn)物溶于90~95 %的乙醇溶液中，攪拌均勻，向其中加入石油醚進行萃 取，所述石油醚與乙醇溶液的體積比為1~3:1，收集萃取液，將萃取液進行減壓蒸餾，得到 萃取產(chǎn)物，將萃取產(chǎn)物重復(fù)步驟(4)的操作一次，即得抗腫瘤提取物。
[0012] 經(jīng)紫外分光光度法檢測發(fā)現(xiàn)，上述得到的抗腫瘤提取物為葉綠素衍生物，經(jīng)MTT比 色法測定該軟棗獼猴桃的提取物對多種腫瘤細胞具有一定的抑制作用，特別是對有代表性 的人類白血病細胞系中U937和HL-60細胞凋亡，具有較好的抗腫瘤活性。本發(fā)明的方法，很 好地提取到了該抗腫瘤葉綠素衍生物，并且提取效率高，有效成分含量高，產(chǎn)品收率大幅提 高。本發(fā)明通過對材料的預(yù)處理，再經(jīng)過微生物發(fā)酵處理，提高了材料的穩(wěn)定性，降低分離 難度，加速有效成分的釋放和提取，更利于分離純化提取抗腫瘤物質(zhì)，本發(fā)明提供的方法具 備提取物收率高，葉綠素衍生物純度高的特點。
[0013] 進一步的，所述步驟（1)中黑曲霉的保藏號為CICC 40273,所述黑曲霉的種子液培 養(yǎng)5-10h后，按重量百分比計為廢棄物碎粒的1~8%加入。
[0014] 進一步的，所述步驟(1)中發(fā)酵溫度為25~28°C。
[0015] 進一步的，所述步驟(2)中的丙酮為體積含量80~90%的丙酮。
[0016]進一步的，所述步驟(2)中浸提的溫度為45~50°C。
[0017] 進一步的，所述步驟(3)中進行減壓蒸餾的溫度為不高于40°C。
[0018] 進一步的，所述步驟(4)中乙醇溶液的用量為，按步驟（1)中的廢棄物碎粒與乙醇 溶液的m/v比為1:1~2g/mL。
[0019] 進一步的，所述步驟(4)中進行減壓蒸餾的溫度為不超過50°C。
[0020] 本發(fā)明的目的之二是提供一種由上述方法制備得到的抗腫瘤提取物在抗腫瘤中 的應(yīng)用，具體是將上述抗腫瘤提取物作為活性成分與可接受的藥物載體結(jié)合制成用于治療 各種腫瘤的口服制劑，或注射單方以及復(fù)方制劑。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：提供了一種軟棗獼猴桃或其近緣種抗腫 瘤物質(zhì)的提取制備方法，經(jīng)檢測該物質(zhì)為葉綠素衍生物;采用本發(fā)明的提取方法，葉綠素衍 生物的提取效果好，產(chǎn)品純度高，產(chǎn)品收率大幅度提高，經(jīng)MTT比色法檢測表明該葉綠素衍 生物具有較好的抗腫瘤活性，能夠有效抑制多種腫瘤細胞的生長，并能引起細胞凋亡，可以 制成各種抗腫瘤藥劑。
【附圖說明】
[0022] 圖1為實施例1中軟棗獼猴桃近緣種抗腫瘤提取物的紫外分光光度法測定的吸光 度曲線；
[0023] 圖2為實施例1中軟棗獼猴桃近緣種抗腫瘤提取物對U937細胞和HL-60細胞的半抑 制濃度IC5Q值。
【具體實施方式】
[0024] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明 進行具體描述，有必要指出的是，以下實施例僅僅用于對本發(fā)明進行解釋和說明，并不用于 限定本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
所做出的一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整，仍屬 于本發(fā)明的保護范圍。
[0025] 實施例1
[0026] 按以下方法制備得到抗腫瘤提取物：
[0027] (1)選取軟棗獼猴桃的近緣種，即紫果獼猴桃，將其廢棄的莖、葉和果實，粉碎成不 大于3mm的碎粒，取Ikg上述碎粒的混合物，向其中加入黑曲霉(保藏號為CICC 40273)，調(diào)節(jié) 濕度為8%，pH為6.5，混勻后采用曲盒進行發(fā)酵，控制發(fā)酵溫度為28°C，發(fā)酵48h;
[0028] (2)向步驟(1)的發(fā)酵所得物中加入體積含量85%的丙酮，丙酮的加入量與發(fā)酵所 得物的重量比為2:1，充分攪拌，在50°C下浸提2次，每次浸提的時間為2h;
[0029] (3)浸提結(jié)束后進行過濾，將所得濾液進行減壓蒸餾除去丙酮，將剩余物冷卻至室 溫，得到析出產(chǎn)物40g;
[0030] (4)將40g析出產(chǎn)物溶于IL體積含量為95 %的乙醇溶液中，攪拌均勻，向其中加入 石油醚進行萃取，所述石油醚與乙醇溶液的體積比為2:1，收集萃取液，將萃取液進行減壓 蒸餾，得到萃取產(chǎn)物，將萃取產(chǎn)物重復(fù)步驟(4)的操作一次，得到紫果獼猴桃提取物300mg。
[0031] 經(jīng)檢測，該紫果獼猴桃提取物的純度達96.5%以上，與僅僅只用有機溶劑提取的 方法相比（不經(jīng)過微生物發(fā)酵），產(chǎn)品收率提高50 %以上。
[0032] 實施例2
[0033]按以下方法制備得到抗腫瘤提取物：
[0034] (1)取紫果獼猴桃果實榨汁后的果渣200g，向其中加入黑曲霉（保藏號為CICC 40273)，調(diào)節(jié)濕度為4%，pH為6.2,混勻后采用堆料方式進行發(fā)酵，控制發(fā)酵溫度為26°C，發(fā) 酵 60h;
[0035] (2)向步驟(1)的發(fā)酵所得物中加入體積含量90%的丙酮，丙酮的加入量與發(fā)酵所 得物的重量比為3:1，充分攪拌，在45°C下浸提3次，每次浸提的時間為2h;
[0036] (3)浸提結(jié)束后進行過濾，將所得濾液進行減壓蒸餾除去丙酮，將剩余物冷卻至室 溫，得到析出產(chǎn)物4g;
[0037] (4)將4g析出產(chǎn)物溶于400mL體積含量為90 %的乙醇溶液中，攪拌均勻，向其中加 入石油醚進行萃取，所述石油醚與乙醇溶液的體積比為2:1，收集萃取液，將萃取液進行減 壓蒸餾，得到萃取產(chǎn)物，將萃取產(chǎn)物重復(fù)步驟(4)的操作一次，得到紫果獼猴桃提取物40mg。
[0038] 經(jīng)檢測，該紫果獼猴桃提取物的純度達97.1%，與僅僅只用有機溶劑提取的方法 相比（不經(jīng)過微生物發(fā)酵），產(chǎn)品收率提高34%以上。
[0039] 實施例3
[0040]按以下方法制備得到抗腫瘤提取物：
[00411 (1)將采集的軟棗獼猴桃的葉，粉碎成不大于3mm的碎粒，取500g碎粒，向其中加入 黑曲霉(保藏號為CICC 40273)，調(diào)節(jié)濕度為1%，ρΗ為6.0,混勻后采用曲盒進行發(fā)酵，控制 發(fā)酵溫度為25°C，發(fā)酵96h;
[0042] (2)向步驟(1)的發(fā)酵所得物中加入體積含量80%的丙酮，丙酮的加入量與發(fā)酵所 得物的重量比為1.5:1，充分攪拌，在48°C下浸提3次，每次浸提的時間為3h;
[0043] (3)浸提結(jié)束后進行過濾，將所得濾液進行減壓蒸餾除去丙酮，將剩余物冷卻至室 溫，得到析出產(chǎn)物15g;
[0044] (4)將15g析出產(chǎn)物溶于IL體積含量為95 %的乙醇溶液中，攪拌均勻，向其中加入 石油醚進行萃取，所述石油醚與乙醇溶液的體積比為1:1，收集萃取液，將萃取液進行減壓 蒸餾，得到萃取產(chǎn)物，將萃取產(chǎn)物重復(fù)該步驟1次，得軟棗獼猴桃提取物120mg。
[0045] 經(jīng)檢測，該軟棗獼猴桃提取物的純度達96.9%以上，與僅僅只用有機溶劑提取的 方法相比（不經(jīng)過微生物發(fā)酵），產(chǎn)品收率提高40 %以上。
[0046] 實施例4
[0047]按以下方法制備得到抗腫瘤提取物：
[0048] (1)將采集的軟棗獼猴桃廢棄的莖和葉的混合物，粉碎成不大于3mm的碎粒，取 500g上述碎粒，向其中加入黑曲霉(保藏號為CICC 40273)，調(diào)節(jié)濕度為2%，pH為6.0,混勻 后采用堆料方式進行發(fā)酵，控制發(fā)酵溫度為25 °C，發(fā)酵96h;
[0049] (2)向步驟(1)的發(fā)酵所得物中加入體積含量85%的丙酮，丙酮的加入量與發(fā)酵所 得物的重量比為2:1，充分攪拌，在50°C下浸提3次，每次浸提的時間為2h;
[0050] (3)浸提結(jié)束后進行過濾，將所得濾液進行減壓蒸餾除去丙酮，將剩余物冷卻至室 溫，得到析出產(chǎn)物17g;
[0051 ] (4)將17g析出產(chǎn)物溶于IL體積含量為95 %的乙醇溶液中，攪拌均勻，向其中加入 石油醚進行萃取，所述石油醚與乙醇溶液的體積比為1.5:1，收集萃取液，將萃取液進行減 壓蒸餾，得到萃取產(chǎn)物，將萃取產(chǎn)物重復(fù)步驟（4)的操作一次，得到軟棗獼猴桃提取物 125mg〇
[0052] 經(jīng)檢測，該軟棗獼猴桃提取物的純度達97.2%以上，與僅僅只用有機溶劑提取的 方法相比（不經(jīng)過微生物發(fā)酵），產(chǎn)品收率提高42 %以上。
[0053] 實施例5
[0054]按以下方法制備得到抗腫瘤提取物：
[0055] (1)將廢棄的軟棗獼猴桃的果實，粉碎成不大于3mm的碎粒，與果實榨汁后的果渣 的混合物共計200g，向其中加入黑曲霉(保藏號為CICC 40273)，調(diào)節(jié)濕度為4%，pH為6.5， 混勻后采用曲盒進行發(fā)酵，控制發(fā)酵溫度為28°C，發(fā)酵72h;
[0056] (2)向步驟(1)的發(fā)酵所得物中加入體積含量85%的丙酮，丙酮的加入量與發(fā)酵所 得物的重量比為2:1，充分攪拌，在45°C下浸提2次，每次浸提的時間為3h;
[0057] (3)浸提結(jié)束后進行過濾，將所得濾液進行減壓蒸餾除去丙酮，將剩余物冷卻至室 溫，得到析出產(chǎn)物3.Sg;
[0058] (4)將3.8g析出產(chǎn)物溶于400mL體積含量為90 %的乙醇溶液中，攪拌均勻，向其中 加入石油醚進行萃取，所述石油醚與乙醇溶液的體積比為2:1，收集萃取液，將萃取液進行 減壓蒸餾，得到萃取產(chǎn)物，將萃取產(chǎn)物重復(fù)該步驟1次，得到軟棗獼猴桃提取物45mg。
[0059] 經(jīng)檢測，該軟棗獼猴桃提取物的純度達97.4%以上，與僅僅只用有機溶劑提取的 方法相比（不經(jīng)過微生物發(fā)酵），產(chǎn)品收率提高38 %以上。
[0060] 測試例1
[0061 ]軟棗獼猴桃及其近緣種抗腫瘤提取物的鑒定
[0062]取實施例1中得到的獼猴桃提取物Iyg溶解于ImL甲醇中，采用紫外分光光度計測 量在200~800nm下的吸光度曲線，得到的曲線圖如附圖1所示，實施例2-5中得到的提取物 檢測結(jié)果與實施例1相似，均為同一種物質(zhì)。
[0063]從圖1可以看出，實施例中得到的抗腫瘤提取物在410nm和665nm處有葉綠素的典 型吸收峰，證明該提取物是一種葉綠素衍生物。測試例2
[0064]采用MTT比色法測定實施例1中得到的抗腫瘤提取物在各步驟處理后對人體白血 病細胞株中U937細胞和HL-60細胞的半抑制濃度IC5q情況。
[0065] 檢測結(jié)果如圖2所示，從圖2可以看出，在浸提過后得到的析出產(chǎn)物已經(jīng)表現(xiàn)出對 U937細胞和HL-60細胞具有很好的抑制作用，能夠迅速誘導(dǎo)細胞凋亡，二者的半抑制濃度 IC50值均降到40yg/mL以下，證明該析出產(chǎn)物的抗腫瘤活性成分含量高，提取效率高。最終 得到的獼猴桃提取物對人體白血病細胞株中U937細胞和HL-60細胞表現(xiàn)出強烈的誘導(dǎo)凋亡 能力。
[0066] 測試例3
[0067] 獼猴桃提取物對腫瘤細胞株生長的抑制作用研究。
[0068]將上述實施例中得到的獼猴桃提取物配制成濃度為2.Oyg/mL的溶液，采用MTT比 色法測定上述實施例中得到的獼猴桃提取物對各種腫瘤細胞株生長抑制的影響，以波長為 550nm，參比波長為450nm測定OD值，計算各種腫瘤細胞的生長抑制率，各腫瘤細胞株的OD值 測定結(jié)果如表1所示，從表1可以看出，本發(fā)明得到的軟棗獼猴桃及其近緣種的抗腫瘤提取 物對各種腫瘤細胞均有較好的抑制作用。
[0069] 按下式計算獼猴桃提取物溶液對腫瘤細胞生長的抑制率：
[0070] 腫瘤細胞生長抑制奉（％)= 1---TT-x100 %〇 V 對照組平均OD值」
[0071] 表1
【主權(quán)項】
1. 一種利用微生物發(fā)酵制備抗腫瘤提取物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步 驟： (1) 將采集的軟棗獼猴桃或其近緣種的廢棄物，粉碎成不大于3mm的碎粒，向廢棄物碎 粒中加入黑曲霉，調(diào)節(jié)濕度為1~8%，pH為6.0~6.5,混勻后進行發(fā)酵，發(fā)酵時間不少于 48h;所述廢棄物為果實、莖、葉和果渣中的至少一種； (2) 向步驟(1)的發(fā)酵所得物中加入丙酮，所述丙酮的加入量與發(fā)酵所得物的重量比為 1.5~3:1，充分攪拌，浸提2~3次，每次浸提的時間為2~3h; (3) 浸提結(jié)束后進行過濾，將所得濾液進行減壓蒸餾除去丙酮，將剩余物冷卻至室溫， 得到析出產(chǎn)物； (4) 將析出產(chǎn)物溶于90~95 %的乙醇溶液中，攪拌均勻，向其中加入石油醚進行萃取， 所述石油醚與乙醇溶液的體積比為1~3:1，收集萃取液，將萃取液進行減壓蒸餾，得到萃取 產(chǎn)物，將萃取產(chǎn)物重復(fù)步驟(4)的操作一次，即得抗腫瘤提取物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中黑曲霉的保藏號為CICC 40273,所述黑曲霉的種子液培養(yǎng)5-10h后，按重量百分比計為廢棄物碎粒的1~8%加入。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中發(fā)酵溫度為25~28°C。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2)中的丙酮為體積含量80~ 90%的丙酮。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中浸提的溫度為45~50°C。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中進行減壓蒸餾的溫度為不 高于40°C。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中乙醇溶液的用量為，按步驟 (1)中的廢棄物碎粒與乙醇溶液的m/v比為1:1~2g/mL。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中進行減壓蒸餾的溫度為不 超過50°C。9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述的方法制備得到的抗腫瘤提取物在抗腫瘤中的應(yīng)用。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，是將上述抗腫瘤提取物作為活性成分與 可接受的藥物載體結(jié)合制成用于治療腫瘤的口服制劑，或注射單方以及復(fù)方制劑。
【文檔編號】A61P35/00GK105943571SQ201610548395
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月13日
【發(fā)明人】秦小波, 彭彤, 張國珍, 時小東, 閆曉雪, 張樹梅, 李世麗, 向麗
【申請人】秦小波, 四川省自然資源科學研究院