的血纖蛋白和熱休克蛋白，將血纖蛋白加入培養(yǎng)液中制備血纖蛋白溶液，將熱休克蛋白加入培養(yǎng)液中制備熱休克蛋白溶液。
[0034]本實施例中制備皮膚干細胞液的過程為:
[0035]①取患體包皮皮膚一小塊，然后將皮膚組織剪碎，用含2000u/L青霉素、200mg/L鏈霉素及2.5mg/L兩性霉素B的無鈣鎂離子PBS液反復(fù)沖洗3次;②將沖洗干凈的皮片組織置于
0.25 %中性蛋白酶Π中消化20min，再置于0.25 %胰蛋白酶和0.02% EDTA中，37 °C消化30min，200目金屬網(wǎng)過濾，收獲細胞懸液，100r/min離心5?1min，再用無I丐鎂的Hanks液洗滌離心2次;③將消化洗滌后的細胞加入含有15%胎牛血清、4mmol/L谷氨酰胺、0.4yg/mL氫化可的松、5yg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、5yg/mL胰島素、1ng/mL表皮生長因子、1.8 X 10-4mmo I/L腺嘌呤、100u/mL青霉素和lOOyg/mL鏈霉素的DMEM和F12(V:V = 3:1)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)瓶底用IV型膠原包被，于37°C、5% 二氧化碳孵育箱中孵育，次日吸出培養(yǎng)液及未貼壁細胞，再加入新鮮培養(yǎng)液，2-3天換液I次，細胞長至70 %?80 %時取出細胞，加入PSB緩沖液，配置成104-107cells/ml的細胞液。
[0036]本實施例中制備蛋白質(zhì)溶液的過程為:
[0037]從患體體內(nèi)提取出出血纖細胞，培養(yǎng)數(shù)代，提取出血纖蛋白待用。從患體體內(nèi)提取出熱休克細胞，在體外培養(yǎng)，用熱刺激刺激熱休克細胞表達熱休克蛋白，提取熱休克蛋白待用。分別將兩種蛋白加入DMEM培養(yǎng)液，制成濃度為12mg/ml和20mg/ml的蛋白質(zhì)溶液。
[0038]步驟2:將細胞打印液、血纖蛋白溶液和熱休克蛋白溶液分別裝入生物3D打印設(shè)備的對應(yīng)儲液腔中，每個儲液腔都連接對應(yīng)的壓電噴頭，壓電噴頭為賽爾Xaarl28;所述生物3D打印設(shè)備的控制系統(tǒng)內(nèi)存儲有待打印的患者組織3D模型的分層模型。
[0039]步驟3:調(diào)整三個噴頭的噴孔與載玻片的初始距離為5mm，噴頭與噴頭間距10mm，噴孔直徑為50μπι，噴頭驅(qū)動電壓均為28-35ν，頻率為2_4khz，噴頭噴印速度為5.0m/s。
[0040]開始打印時，先輸入打印模型數(shù)據(jù)至驅(qū)動板，驅(qū)動板得到分層后的單層打印數(shù)據(jù)，然后按照下面步驟4至步驟7的過程進行單層打印:
[0041]步驟4:生物3D打印設(shè)備根據(jù)步驟2所述的分層模型，使用連接熱休克蛋白溶液儲液腔的噴頭在載玻片上打印一層熱休克蛋白層，噴頭移動速度為0.015m/s，重復(fù)打印一次，熱休克蛋白層厚度為25um-35um0
[0042]步驟5:生物3D打印設(shè)備根據(jù)步驟2所述的分層模型，使用連接血纖蛋白溶液儲液腔的噴頭在熱休克蛋白層上打印一層血纖蛋白層，噴頭移動速度為0.015m/s，重復(fù)打印一次，血纖蛋白層厚度為25um-35um0
[0043]步驟6:打印完成后，噴頭組移開，控制發(fā)熱燈管表面溫度恒溫100°C，使用發(fā)熱燈管距離血纖蛋白層50mm處照射血纖蛋白層10秒，隨后移開發(fā)熱燈管，冷卻20-30S。
[0044]步驟7:生物3D打印設(shè)備根據(jù)步驟2所述的分層模型，使用連接細胞打印液儲液腔的噴頭在血纖蛋白層上指定位置打印細胞液，再等待20-30s。
[0045]步驟8:完成一層打印后，打印平臺往下移動lOOum，重復(fù)步驟4?步驟7，直至得到與待打印的患者組織3D模型一致的蛋白支架。支架上分層附著了指定位置的細胞，細胞層間具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，蛋白支架具有與導(dǎo)入模型一致的形狀，具有彈性和支撐性。
[0046]將得到的包含皮膚干細胞和蛋白質(zhì)支架的生物支架在體外培養(yǎng)一段時間，植入皮膚損傷處即可。
[0047]本實施例制取出來的皮膚干細胞支架，不僅具有高效率地特點，且?guī)缀鯚o排斥，使用自身蛋白質(zhì)作為生物支架更有利于細胞生長繁殖，還可隨著細胞的繁殖不斷降解，植入安全性較之水凝膠有很大的優(yōu)勢，且使用壓電式的細胞打印方式，可以保證很高的打印速率。區(qū)別于其它生物支架的方法，本方法使用壓電噴頭打印蛋白質(zhì)液和細胞液，用蛋白質(zhì)作為支架，使用短暫高溫固化支架的同時，用耐高溫的熱休克蛋白保護細胞，是一種切實有效的制造發(fā)明。
[0048]盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。
【主權(quán)項】
1.一種基于壓電噴印方式的蛋白質(zhì)支架制備方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟1:獲取患者自身的待打印細胞，對待打印細胞培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化，制成細胞打印液；獲取患者自身的血纖蛋白和熱休克蛋白，將血纖蛋白加入培養(yǎng)液中制備血纖蛋白溶液，將熱休克蛋白加入培養(yǎng)液中制備熱休克蛋白溶液； 步驟2:將細胞打印液、血纖蛋白溶液和熱休克蛋白溶液分別裝入生物3D打印設(shè)備的對應(yīng)儲液腔中，每個儲液腔都連接對應(yīng)的壓電噴頭;所述生物3D打印設(shè)備的控制系統(tǒng)內(nèi)存儲有待打印的患者組織3D模型的分層模型； 步驟3:調(diào)整三個噴頭的噴孔與載玻片的初始距離為5mm，噴孔直徑為50μπι，噴頭驅(qū)動電壓均為28-35ν，頻率為2-4khz，噴頭噴印速度為5.0m/s ； 步驟4:生物3D打印設(shè)備根據(jù)步驟2所述的分層模型，使用連接熱休克蛋白溶液儲液腔的噴頭在載玻片上打印一層熱休克蛋白層，噴頭移動速度為0.015m/s，熱休克蛋白層厚度為25um_35um; 步驟5:生物3D打印設(shè)備根據(jù)步驟2所述的分層模型，使用連接血纖蛋白溶液儲液腔的噴頭在熱休克蛋白層上打印一層血纖蛋白層，噴頭移動速度為0.015m/s，血纖蛋白層厚度為25um_35um; 步驟6:使用發(fā)熱燈管距離血纖蛋白層50mm處照射血纖蛋白層10秒，隨后冷卻20-30s; 步驟7:生物3D打印設(shè)備根據(jù)步驟2所述的分層模型，使用連接細胞打印液儲液腔的噴頭在血纖蛋白層上打印細胞液，再等待20-30s; 步驟8:重復(fù)步驟4?步驟7，直至得到與待打印的患者組織3D模型一致的蛋白支架。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于壓電噴印方式的蛋白質(zhì)支架制備方法，其特征在于:步驟I中的細胞打印液濃度不低于104cells/ml，血纖蛋白溶液濃度為12mg/ml，熱休克蛋白溶液濃度為20mg/ml。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于壓電噴印方式的蛋白質(zhì)支架制備方法，其特征在于:所述壓電噴頭型號為賽爾Xaarl28。
【專利摘要】本發(fā)明提出一種基于壓電噴印方式的蛋白質(zhì)支架制備方法，涉及細胞由患者自身組織干細胞培養(yǎng)而來，兩種蛋白質(zhì)支架溶液由患體血纖蛋白和熱休克蛋白配置而成。本發(fā)明壓電式噴墨打印技術(shù)，根據(jù)模型依次打印熱休克蛋白層、血纖蛋白層，隨后使用發(fā)熱燈管照射血纖蛋白使變性形成凝固的蛋白質(zhì)支架，再打印細胞在該支架上，如此往復(fù)，蛋白層和細胞層交替打印，最終形成具有一定三維結(jié)構(gòu)的生物支架。本發(fā)明所用的細胞和蛋白均來源于患體，排斥小，高溫使血纖蛋白變性為物理變性，不影響血纖蛋白為細胞生長提供營養(yǎng)物質(zhì)，同時熱休克蛋白層保護細胞層不受發(fā)熱燈管的高溫傷害，通過設(shè)定從底層開發(fā)的壓電噴頭驅(qū)動參數(shù)高效率地打印出高分子的蛋白質(zhì)溶液和細胞液。
【IPC分類】A61L27/38, B33Y10/00, A61L27/22
【公開號】CN105664248
【申請?zhí)枴緾N201610028686
【發(fā)明人】汪焰恩, 魏溢, 楊明明, 李欣培, 魏慶華, 柴衛(wèi)紅
【申請人】西北工業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年1月18日