具有電刺激作用的仿生納米纖維支架制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料和神經(jīng)組織工程領(lǐng)域，涉及一種靜電紡絲技術(shù)制備具有電刺激作用的仿生納米纖維支架。
【背景技術(shù)】
[0002]周?chē)窠?jīng)損傷在臨床上十分常見(jiàn)，尤其長(zhǎng)段距離的神經(jīng)缺損修復(fù)一直醫(yī)學(xué)界攻克的難題。迄今為止，經(jīng)歷了神經(jīng)吻合、自體神經(jīng)移植、同種異體神經(jīng)移植、自體非神經(jīng)組織移植和生物材料替代等幾個(gè)過(guò)程，但幾種治療方式各有利弊，未使神經(jīng)缺損的問(wèn)題得到根本性的解決。靜電紡絲技術(shù)制備的混紡支架材料，孔隙率高，比表面積大，可將天然材料和合成材料結(jié)構(gòu)雜化和優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，因此具有良好生物相容性和降解性的電紡納米纖維材料接種種子細(xì)胞或生長(zhǎng)因子在生物醫(yī)用材料方面和用于修復(fù)神經(jīng)缺損具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]靜電紡絲技術(shù)因其設(shè)備簡(jiǎn)單和可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛研究并應(yīng)用于制備組織工程支架。采用此技術(shù)制備的納米纖維支架仿生天然細(xì)胞外基質(zhì)，并且孔隙相互連通，具有高孔隙率、高比表面積、較好的力學(xué)性能和特定的生物學(xué)性能等優(yōu)點(diǎn)。在組織工程中，支架中相互連通的孔隙有利于細(xì)胞長(zhǎng)入和新生組織的形成;較高的孔隙率和比表面積有利于細(xì)胞的粘附、增殖、迀移和分化。
[0004]理想的神經(jīng)組織工程支架材料要求具有如下性能:(I)能負(fù)載生長(zhǎng)因子和活體細(xì)胞，從而保證神經(jīng)修復(fù)所需的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)；(2)具有良好的生物相容性、生物可降解吸收性，對(duì)材料進(jìn)行加工，能夠提高支架材料的力學(xué)性，利用支架里面定向分布的纖維結(jié)構(gòu)，引導(dǎo)神經(jīng)纖維定向生長(zhǎng)；(3)有利于代謝產(chǎn)物的交換和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送，并保證良好的血液供應(yīng)；(4)比表面積及孔隙率較高，更能促進(jìn)細(xì)胞的點(diǎn)附、增殖和分化及電刺激作用。
[0005]堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)在體內(nèi)分布廣泛，尤其是在神經(jīng)組織中含量十富且具有廣泛的生物學(xué)作用，它在血管形成、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合與組織修復(fù)、促進(jìn)組織再生和神經(jīng)組織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著十分重要的作用。在周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)的研究中，有資料表明，bFGF可以激活神經(jīng)細(xì)胞、雪旺細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，并促進(jìn)神經(jīng)殘端的軸突生長(zhǎng)，還可以延長(zhǎng)培養(yǎng)液中多種外周神經(jīng)元的存活，刺激膽堿乙?；傅暮铣梢约巴黄鸬纳L(zhǎng)，為體外細(xì)胞培養(yǎng)提供微環(huán)境，但由于bFGF易被酶分解，其在體內(nèi)作用的發(fā)揮需持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間與靶細(xì)胞受體結(jié)合，該發(fā)明設(shè)計(jì)的復(fù)合納米纖維支架可實(shí)現(xiàn)bFGF的緩控釋釋放，充分發(fā)揮其神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)，到達(dá)提高神經(jīng)損傷修復(fù)的目的
[000?]殼聚糖(chi tosan, CS)是一種陽(yáng)離子堿性天然多糖，無(wú)毒、具有生物功能性、無(wú)免疫原性、組織相容性、緩控釋作用等優(yōu)點(diǎn)。研究表明，一些組織細(xì)胞易黏附于殼聚糖表面并促進(jìn)其增殖，還具有藥物活性和促進(jìn)傷口愈合及軟、硬組織的重建等生物活性。不足的是其力學(xué)性能比較差，單一材料紡絲纖維用于組織與器官的修復(fù)不是特別理想。聚乳酸(polylactic acid，PLA)有較好的機(jī)械強(qiáng)度及可塑性，可塑造成膜、管以及囊性形狀。它是當(dāng)下應(yīng)用最多的人工合成材料之一，但由于聚乳酸材料細(xì)胞親和性差，并且降解產(chǎn)物呈酸性，易引發(fā)無(wú)菌性炎癥反應(yīng)而不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，使其應(yīng)用受到限制。通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒▽LA、殼聚糖、β-TCP三者復(fù)合使之兼具多重優(yōu)點(diǎn)，可制備出多種高性能優(yōu)良共混物支架材料。
[0007]β-磷酸三鈣(β-TCP)化學(xué)成分接近生物骨的無(wú)機(jī)鹽成份，其生物相容性好，生物可降解性能優(yōu)異，降解速率適中，當(dāng)它被植入人體后，通過(guò)物理化學(xué)溶解，吞噬細(xì)胞吞噬等方式而逐漸被溶解降解，降解出來(lái)的鈣離子、磷離子可以進(jìn)入到循環(huán)系統(tǒng)參與損傷神經(jīng)的修復(fù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種具有電刺激作用的復(fù)合仿生納米纖維支架的制備方法，該仿生納米纖維支架能夠起到支撐細(xì)胞生長(zhǎng)、引導(dǎo)組織再生、控制組織結(jié)構(gòu)和釋放活性因子等作用，從而達(dá)到神經(jīng)組織修復(fù)的作用。
[0009]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，采用技術(shù)方案如下:
[0010]具有電刺激作用的仿生納米纖維支架制備方法，包括以下步驟:
[0011]I)將β-磷酸三鈣(β-TCP)置于直徑2-8cm，高0.5-3cm氧化鋁環(huán)中，在2?8KV/cm-l直流電場(chǎng)作用下，于200?600 °C空氣中進(jìn)行極化0.5?3h，得到極化后的β-TCP ；
[0012]2)聚乳酸(PLA)溶解于有機(jī)溶劑，再加入上述極化后的β-TCP粉末，制備得到PLA/β-TCP預(yù)電紡液I;在殼聚糖醋酸水溶液(CS)中加入生物活性藥物，攪拌分散均勻，制備得到CS/生物活性藥物預(yù)電紡液2;
[0013]3)以PLA/i3-TCP為皮層預(yù)電紡液1，以CS/生物活性藥物為芯層預(yù)電紡液2，通過(guò)同軸電紡絲制備PLA/CS/0-TCP ；
[0014]其中，取兩個(gè)規(guī)格2?1ml的注射器，分別吸取皮層預(yù)電紡液I和芯層預(yù)電紡液2，插入規(guī)格18G?26G的不銹鋼針頭，調(diào)節(jié)電壓1KV?30KV;
[0015]調(diào)節(jié)注射栗速率，使注射器中溶液勻速流出，皮層預(yù)電紡液I推注流速為0.0I?2ml/h，芯層預(yù)電紡液2推進(jìn)速度0.02?2ml/h，皮層的流速大于芯層；
[0016]取1cmX1cm細(xì)質(zhì)銅網(wǎng)在接地滾軸上作為接收裝置，控制噴絲頭與接收裝置的接收距離10?25cm，得到電紡纖維膜；
[0017]真空干燥12?48h去除溶劑，浸沒(méi)在EDC和NHS的乙醇水溶液中交聯(lián)24h，去離子水洗滌、凍干得到仿生納米纖維支架。
[0018]按上述方案，步驟2)所述有機(jī)溶劑為N-N-二甲基甲酰胺與或四氫呋喃或丙酮或氯仿或二氯甲烷的混合。
[0019]按上述方案，步驟2)溶劑中聚乳酸質(zhì)量濃度為5%?30%，電極化β-TCP質(zhì)量濃度為2 %?20 % ;殼聚糖醋酸水溶液質(zhì)量濃度2 %?10 %。
[0020]按上述方案，步驟2)所述的生物活性藥物為神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子中的一種。
[0021 ] 按上述方案，步驟3)所述EDC和NHS濃度均為0.lmol/L，乙醇與水的體積比為7:3?9:1。
[0022]按上述方案，步驟3)電紡絲制備PLA/CS/f3_TCP過(guò)程中溫度:25?40°C ；相對(duì)濕度:30 ?70%。
[0023]按上述方案，所述仿生納米纖維支架用于外周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)。
[0024]適度電刺激的效果等同于多種生長(zhǎng)因子的作用，能有效增強(qiáng)損傷神經(jīng)的再生，尋求一種具有生物相容性和降解性，同時(shí)又有相似于人體的生物電性的生物材料，故引入電極化β-TCP，但β-TCP的不足是其脆性大和不易成型，據(jù)仿生原則，在一定條件下，把β-TCP與韌性良好的有機(jī)物復(fù)合，制備無(wú)機(jī)/有機(jī)復(fù)合生物材料，不但能夠使β-TCP的脆性問(wèn)題得到解決，也能夠利用有機(jī)物使材料的生物學(xué)活性得以增強(qiáng)。β-TCP的合成方法主要有水熱法、液相沉淀法、溶膠凝膠法以及干法等，其中液相沉淀法以反應(yīng)平穩(wěn)，產(chǎn)物粒度均勻、顆粒細(xì)小，過(guò)程可控性高等優(yōu)點(diǎn)，因此采用改進(jìn)后的液相沉淀方法制備β-TCP。制備預(yù)電紡液過(guò)程利用熱致相分離技術(shù)和模板法，及同軸電紡過(guò)程調(diào)節(jié)接受裝置的轉(zhuǎn)速，可以獲得多孔、比表面積大、定向仿生結(jié)構(gòu)。
[0025]設(shè)計(jì)一種具有電刺激作用的組織工程復(fù)合神經(jīng)支架材料，首先，通過(guò)材料組合和改性，運(yùn)用靜電紡絲技術(shù)制備出無(wú)毒且具有高度的生物相容性和易塑性的可降解納米纖維仿生材料，然后再選擇一種能夠提高神經(jīng)生長(zhǎng)能力的物質(zhì)如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化因子、雪旺細(xì)胞等，并負(fù)載到復(fù)合納米纖維支架材料中，以增加神經(jīng)支架內(nèi)容物的方法達(dá)到模擬自體神經(jīng)的目的。
[0026]本發(fā)明的有益效果在于:
[0027]電極化β-TCP與其他導(dǎo)電材料相比，易制備、物理化學(xué)和生物學(xué)性能好，β-TCP降解的時(shí)候釋放鈣離子、磷酸根離子，有望發(fā)揮電刺激作用，更好的誘導(dǎo)神經(jīng)再生，為探索電刺激調(diào)控干細(xì)胞促周?chē)窠?jīng)再生的作用機(jī)制和改進(jìn)周?chē)窠?jīng)修復(fù)用材料提供新思路。
[0028]本發(fā)明制備的具有電刺激的納米纖維支架具有雙層內(nèi)部結(jié)構(gòu)、表面積大可以實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及各類(lèi)藥物的適時(shí)、適量的控制釋放，生物相容性好，性能穩(wěn)定易于保存，在外周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用前景。
[0029]本發(fā)明采取的方法操作簡(jiǎn)單，工藝省時(shí)，原材料價(jià)格適中易獲得，反應(yīng)條件溫和，綠色友好，經(jīng)濟(jì)性好，適于工行業(yè)生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0030]為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。
[0031]β-磷酸三鈣的制備
[0032]以Ca/P摩爾比為1:1.5，將(NH4)2HPO3滴加到Ca(NO3)2水溶液中，充分?jǐn)嚢韬笙蛉芤褐屑尤刖郾揭蚁?分散劑)，制成混合液，并且置于水浴鍋中，保持35?38°C，強(qiáng)力攪拌下，在上述攪拌過(guò)程中，加入PH調(diào)節(jié)劑(氨水)，調(diào)節(jié)PH為7.0，靜置過(guò)夜，得到懸浮液，減壓抽濾，乙醇洗滌，得到濾餅，放入120 0C干燥箱中干燥12h，得到β-TCP粉末。將粉末放人馬弗爐中。在8000C下，煅燒2h，隨爐冷卻，從爐中取出，得到β-TCP粉末。研磨，控制β-TCP粉末的粒徑為1nm?10nm0
[0033]下述實(shí)施案例中制備的同軸電紡絲纖維支架(PLA/CS/i3-TCP)中所用的聚乳酸分子量為5 X 14?4 X 15，殼聚糖分子量為1.0 X 14?3.0XlO50
[0034]實(shí)施例1:
[0035](I)將磷酸三鈣(β-TCP)置于直徑2cm，高0.5?11氧化鋁環(huán)中，在21^/011—1直流電場(chǎng)作用下，100°C空氣中進(jìn)行極化I小時(shí)，得到的極化后的β-TCP，備用。
[0036](2)室溫下，以二氯甲烷