一種基于壓電噴印方式的蛋白質(zhì)支架制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于細胞三維成型的生物支架的構(gòu)建方法，尤其是一種基于壓電噴印方式的蛋白質(zhì)支架制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]3D打印技術(shù)是目前全球最尖端的技術(shù)之一，隨著3D打印技術(shù)的普及和交叉學(xué)科的不斷融合，該技術(shù)在生物制造領(lǐng)域中的應(yīng)用獲得更大發(fā)展。在醫(yī)療方面，3D打印的生產(chǎn)模式會改變醫(yī)師現(xiàn)有的治療流程，技術(shù)的持續(xù)創(chuàng)新和應(yīng)用的逐漸拓廣可為臨床醫(yī)師提供廣闊的應(yīng)用前景。生物三維打印是以生物材料或活細胞進行三維打印，以構(gòu)建復(fù)雜生物三維結(jié)構(gòu)，如個性化植入體、可再生人工骨、體外細胞三維結(jié)構(gòu)體、人工器官等。
[0003]有關(guān)器官打印技術(shù)的研究引起廣泛的關(guān)注，其原因在于該領(lǐng)域具有明顯的學(xué)科交叉與滲透融合的特點，它處于生命科學(xué)與快速成型技術(shù)、生物制造技術(shù)、生物科學(xué)和材料科學(xué)的交匯點，它為組織工程學(xué)突破二維研究的局限性，在三維尺度上精確控制與人體組織或器官相似的三維構(gòu)造體方面的研究提供了一種新的思路。
[0004]近年來，細胞打印的可行性被不斷地驗證，新的打印方法被不斷提出，常見的打印方式有，噴墨細胞打印技術(shù)、噴射細胞打印技術(shù)、激光細胞打印技術(shù)、聲控細胞打印技術(shù)等，打印方式各有優(yōu)劣。壓電式的打印方法有其獨特的優(yōu)勢，效率高和分辨率高，但難打印高粘度液體和易堵塞是其最大不足。
[0005]隨著科學(xué)發(fā)展，科學(xué)研究著眼于細胞成活率，細胞在打印過程中的損傷，高效可控的打印方法，三維堆砌方法等研究上。其中細胞的三維堆砌通常用水凝膠作為生物支架，將細胞液混合在水凝膠中打印或兩者分開打印，最終形成具有立體結(jié)構(gòu)的打印體。水凝膠具有高分子網(wǎng)絡(luò)體系，性質(zhì)柔軟，能保持一定的形狀，多孔，可以儲存大量營養(yǎng)物質(zhì)，是培養(yǎng)細胞較為理想的支架;但非蛋白基水凝膠的制備工藝十分復(fù)雜，工藝穩(wěn)定性差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明提出了一種基于壓電噴印方式的蛋白質(zhì)支架制備方法。該方法中，通過設(shè)置打印頻率和每個脈沖中驅(qū)動電壓有效時間和驅(qū)動電壓來打印大分子的細胞液和蛋白質(zhì)溶液;采用取自患體自身的蛋白質(zhì)固化后作為支架，既解決了異體排斥問題，蛋白質(zhì)支架更有利于細胞生長繁殖，可以被細胞吸收，也解決了復(fù)雜的制備問題，可以通過打印的方式將細胞液和蛋白液依次打印到載體上。
[0007]已有大量的研究和實驗證明高溫可以使蛋白質(zhì)變性凝固，基于此原理，本方法使用壓電噴頭將蛋白液和細胞液依次打印，解決了低效率的蛋白質(zhì)層覆蓋和細胞種植問題；其次本方法使用了耐70度高溫以上的熱休克蛋白層保護細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)不受影響，并控制發(fā)熱燈管照射的時間使血纖蛋白層固化而熱休克蛋白層受較小影響或不受影響。
[0008]本方法通過提取患體自身的血纖蛋白和熱休克蛋白，利用參數(shù)定制的壓電噴頭打印出兩層蛋白層，用發(fā)熱燈管照射使表層血纖蛋白變性固化形成支架，然后在支架上打印細胞層，如上細胞層與蛋白層交替打印，從而形成具有一定立體結(jié)構(gòu)的生物支架。
[0009]具體的技術(shù)方案為:
[0010]所述一種基于壓電噴印方式的蛋白質(zhì)支架制備方法，其特征在于:包括以下步驟:[0011 ]步驟I:獲取患者自身的待打印細胞，對待打印細胞培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化，制成細胞打印液;獲取患者自身的血纖蛋白和熱休克蛋白，將血纖蛋白加入培養(yǎng)液中制備血纖蛋白溶液，將熱休克蛋白加入培養(yǎng)液中制備熱休克蛋白溶液；
[0012]步驟2:將細胞打印液、血纖蛋白溶液和熱休克蛋白溶液分別裝入生物3D打印設(shè)備的對應(yīng)儲液腔中，每個儲液腔都連接對應(yīng)的壓電噴頭;所述生物3D打印設(shè)備的控制系統(tǒng)內(nèi)存儲有待打印的患者組織3D模型的分層模型；
[0013]步驟3:調(diào)整三個噴頭的噴孔與載玻片的初始距離為5mm，噴孔直徑為50μπι，噴頭驅(qū)動電壓均為28-35ν，頻率為2-4khz，噴頭噴印速度為5.0m/s ；
[0014]步驟4:生物3D打印設(shè)備根據(jù)步驟2所述的分層模型，使用連接熱休克蛋白溶液儲液腔的噴頭在載玻片上打印一層熱休克蛋白層，噴頭移動速度為0.015m/s，熱休克蛋白層厚度為25um_35um ；
[0015]步驟5:生物3D打印設(shè)備根據(jù)步驟2所述的分層模型，使用連接血纖蛋白溶液儲液腔的噴頭在熱休克蛋白層上打印一層血纖蛋白層，噴頭移動速度為0.015m/s，血纖蛋白層厚度為25um_35um ；
[0016]步驟6:使用發(fā)熱燈管距離血纖蛋白層50mm處照射血纖蛋白層10秒，隨后冷卻20-30s ；
[0017]步驟7:生物3D打印設(shè)備根據(jù)步驟2所述的分層模型，使用連接細胞打印液儲液腔的噴頭在血纖蛋白層上打印細胞液，再等待20-30s;
[0018]步驟8:重復(fù)步驟4?步驟7，直至得到與待打印的患者組織3D模型一致的蛋白支架。
[0019]進一步的優(yōu)選方案，所述一種基于壓電噴印方式的蛋白質(zhì)支架制備方法，其特征在于:步驟I中的細胞打印液濃度不低于104cells/ml，血纖蛋白溶液濃度為12mg/ml，熱休克蛋白溶液濃度為20mg/ml。
[0020]進一步的優(yōu)選方案，所述一種基于壓電噴印方式的蛋白質(zhì)支架制備方法，其特征在于:所述壓電噴頭型號為賽爾Xaarl28。
[0021]有益效果
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有顯著優(yōu)點:
[0023](I)本發(fā)明利用壓電式的噴頭打印，可以高效率地按照導(dǎo)入模型打印蛋白液和細胞液，精確得到定點打印細胞的生物支架。
[0024](2)本發(fā)明使用的蛋白支架原料來自患體自身，極小排斥，可降解為細胞培養(yǎng)提供營養(yǎng)物質(zhì)。
[0025](3)本發(fā)明使用的支架固化方法為熱變性，利用耐熱的熱休克蛋白層保護細胞層，可以短時間內(nèi)使支架層蛋白質(zhì)變性固化而不傷害底下的細胞層。
[0026](4)本發(fā)明通過設(shè)置壓電噴頭驅(qū)動頻率、驅(qū)動電壓、單個脈沖有效驅(qū)動電壓時間的方法來打印含大分子物質(zhì)的細胞液和蛋白液。
【附圖說明】
[0027]圖1為生物壓電打印成型機的工作示意圖。
[0028]圖中:丨打印平臺，2壓電噴頭組，3儲液腔組，4生物支架，5發(fā)熱燈管，6打印熱休克蛋白的噴頭，7打印血纖蛋白的噴頭，8打印細胞的噴頭，9裝熱休克蛋白的儲液腔，1裝血纖蛋白的儲液腔，11裝細胞的儲液腔，12細胞層，13血纖蛋白層，14熱休克蛋白層，15噴頭移動支架，16升降平臺。
【具體實施方式】
[0029]下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0030]本發(fā)明的目的在于提出一種基于壓電噴印方式的蛋白質(zhì)支架制備方法，為細胞打印或器官打印提供一種新的生物支架制備方法。該方法中待打印細胞、熱休克蛋白及血纖蛋白均取自患體;利用底層設(shè)定的壓電打印方式打印一層熱休克蛋白層，一層血纖蛋白層，經(jīng)過發(fā)熱燈管照射后，使血纖蛋白變性形成固化的蛋白質(zhì)支架，而熱休克蛋白層不受影響；然后在蛋白質(zhì)支架上精確定點地打印指定細胞;如此往復(fù)打印細胞層與蛋白層，最后形成具有一定三維結(jié)構(gòu)的生物支架。
[0031]本實施例以皮膚損傷患者為對象，在對傷患處進行CT掃描后，通過修補和重構(gòu)，建立待打印的患者組織3D模型，再對3D模型進行逐層分離解析，得到生物3D打印設(shè)備能夠識別的分層模型。
[0032]具體步驟如下:
[0033]步驟1:獲取患者自身的待打印細胞，對待打印細胞培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化，制成細胞打印液;獲取患者自身