一種ros響應(yīng)的納米藥物遞送系統(tǒng)及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明涉及藥物制劑領(lǐng)域，尤其涉及一種R0S響應(yīng)的納米藥物遞送系統(tǒng)及其制備 方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 化療是腫瘤確診之后常用的治療方法，但化療常伴隨很多副作用，為了獲得最好 的治療效果同時(shí)避免副作用，許多納米材料用來負(fù)載緩釋化療藥物。這些藥物通常能靶向 于腫瘤，且藥物釋放是可控制的。比如pH敏感型，還原敏感型，溫度敏感型，酶敏感和光敏感 型等等，但活性氧自由基(R0S)應(yīng)答的藥物釋放很少有人研究。光控產(chǎn)生的R0S刺激具有能 夠精確控制釋放的時(shí)間和位點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)。
[0003] 腫瘤細(xì)胞的R0S壓力比正常細(xì)胞要高，一部分原因可能來源于癌基因的刺激增加 了代謝活性和線粒體的功能紊亂。在相同的R0S壓力下，正常細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞能處理更多的 R0S。因此，適當(dāng)提高細(xì)胞中R0S的水平能達(dá)到選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。光動(dòng)力治療能產(chǎn) 生R0S殺傷細(xì)胞，光敏劑二氫卟吩e6(Ce6)作為第二代光敏劑，有較高的R0S產(chǎn)率，常被用于 光動(dòng)力治療。
[0004] 近些年來，鑭系元素?fù)诫s的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料(upconversion nanophosphors， UCNPs)常被用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。在980nm激光的照射下，UCNPs能發(fā)射出可見光或近紅外的 窄譜熒光。這些可見光或近紅外光具有獨(dú)一無二的光學(xué)特性，比如無背景光，抗淬滅效應(yīng) 好，穿透深度深等。比起含Cd 2+的量子點(diǎn)，上轉(zhuǎn)換材料的毒性要小很多。光動(dòng)力治療的光敏劑 通常能被可見光或500_700nm的光激發(fā)。當(dāng)UCNPs和光動(dòng)力治療的光敏劑相結(jié)合，通過熒光 共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效應(yīng)，光敏劑能夠吸收UCNPs通過轉(zhuǎn)換特性激發(fā)出的近紅外光。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)上的缺陷，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是通過光控產(chǎn)生的R0S刺激如 何協(xié)助抗腫瘤化療藥物發(fā)揮藥效和降低藥物副作用。
[0006] 本發(fā)明公開了一種R0S響應(yīng)的納米藥物遞送系統(tǒng)，包括UCNPs、與UCNPs連接的羧基 化的聚乙二醇(PEG)、光敏劑、R0S響應(yīng)的縮硫酮linker(TL)，以及與縮硫酮linker連接的抗 腫瘤化療藥物;光敏劑含有羧基且其激發(fā)光譜和UCNPs的發(fā)射光譜重合。
[0007] 進(jìn)一步地，光敏劑和UCNPs的之間的距離能夠進(jìn)行FRET效應(yīng)。
[0008] 進(jìn)一步地，縮硫酮linker的結(jié)構(gòu)式是：
[0010]其中，縮硫酮linker通過其羧基與抗腫瘤化療藥物連接。縮硫酮linker是R0S敏感 的，可被R0S切斷，從而釋放出抗腫瘤化療藥物。
[0011] 進(jìn)一步地，UCNPs是NaYF4納米顆粒摻雜Yb3+作為敏感劑，Er3+/Tm 3+作為激活劑，呈 現(xiàn)出上轉(zhuǎn)換特性，980nm激光可激發(fā)出645-675nm的窄光譜。
[0012] 進(jìn)一步地，光敏劑包括二氫卟吩e6(Ce6)和脫鎂葉綠酸-A(Pheophorbide A，PheA) 中的一種或者兩種，其對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)式是：
[0014]其中，左邊是二氫卟吩e6,右邊是脫鎂葉綠酸-A。
[0015]進(jìn)一步地，抗腫瘤化療藥物包括喜樹堿(CPT)、阿霉素(D0X)、伊立替康、紫杉醇中 的一種或者多種。這些抗腫瘤化療藥物可以和羧基反應(yīng)。
[0016] 進(jìn)一步地，上述R0S響應(yīng)的納米藥物遞送系統(tǒng)的水合粒徑為70_80nm。
[0017] 在一個(gè)較佳實(shí)施例中，抗腫瘤化療藥物是CPT，光敏劑是Ce6; CPT和Ce6在R0S響應(yīng) 的納米藥物遞送系統(tǒng)中的負(fù)載量為4.85% (w/w)和5% (w/w)。
[0018] 本發(fā)明還公開了上述R0S響應(yīng)的納米藥物遞送系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟：
[0019] 步驟一、UCNPs的合成；
[0020] 步驟二、縮硫酮linker的合成:無水的3-疏基丙酸和無水的丙酮在干燥的HC1氣體 飽和的情況下室溫反應(yīng)2 - 6 h，反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)晶過濾，洗滌，真空冷凍干燥得產(chǎn)物縮硫酮 linker；
[0021 ] 步驟三、縮硫酮linker與抗腫瘤化療藥物連接:縮硫酮linker在無水的二甲基甲 酰胺（DMF)中，在先加入三乙胺、2，4,6_三氯苯甲酰氯、二甲氨基吡啶的情況下，攪拌5-20min;將抗腫瘤化療藥物加入，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)20-30h，粗產(chǎn)物過硅膠柱得連接有縮硫酮 linker的抗腫瘤化療藥物純品；
[0022] 步驟四、裝配完整的R0S響應(yīng)的納米藥物遞送系統(tǒng):連接有縮硫酮linker的抗腫瘤 化療藥物和甲氧基-聚乙二醇-羧基(mPEG-COOH)以摩爾比為2:5~6的比例加入含UCNPs的 有機(jī)溶劑中，UCNPs質(zhì)量為mPEG-COOH的2.5 % -3.3 %，超聲，加入摩爾質(zhì)量為mPEG-COOH的 5%-15%的光敏劑超聲，室溫?cái)嚢鑜-3h后高速離心洗滌，收集固體物質(zhì)后重懸，得到R0S響 應(yīng)的納米藥物遞送系統(tǒng)。
[0023]進(jìn)一步地，步驟四中的有機(jī)溶劑是可同時(shí)溶解抗腫瘤化療藥物，mPEG-COOH和光敏 劑的有機(jī)溶劑，比如二甲基甲酰胺。
[0024] 進(jìn)一步地，步驟一具體為:CF3⑶ONa和Ln(CF3COO) 3以摩爾比2:1在油胺中反應(yīng)，攪 拌加熱到110-120°C去除水分和氧氣，通氮?dú)鈹嚢?.5-2h，期間一直為通氮?dú)鉅顟B(tài)，當(dāng)反應(yīng) 液轉(zhuǎn)為透明，升溫至320-330Γ攪拌反應(yīng)l_2h，反應(yīng)結(jié)束，以環(huán)氧己烷和氯仿洗去多余油胺， 真空干燥，得到UCNPs ;其中，Ln (CF3C00) 3 中的Ln是78mo 1 % Y+20mo 1 % Yb+1 · 6mo 1 %Er+ 0.4mol%Tm；
[0025] 優(yōu)選地，步驟一中三種反應(yīng)物具體的量為4mmol CF3C00Na和2mmolLn(CF3⑶0)3加 入20mL油胺中反應(yīng)。
[0026] 優(yōu)選地，步驟一中升溫至320°C，且該升溫過程中，每分鐘升高10°C。
[0027] 優(yōu)選地，步驟一中反應(yīng)結(jié)束后，需要當(dāng)溫度降到室溫之后，再以環(huán)氧己烷和氯仿洗 去多余油胺。
[0028] 優(yōu)選地，步驟三中加入三乙胺的摩爾量為TL的三倍，加入2，4，6_三氯苯甲酰氯的 摩爾質(zhì)量與TL的摩爾質(zhì)量相同，加入二甲氨基吡啶(DMAP)的摩爾質(zhì)量是TL的1/5。
[0029]優(yōu)選地，步驟四重懸固體物質(zhì)的溶劑可為水、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)或4-羥乙基哌 嗪乙磺酸(HEPES)緩沖溶液。
[0030] 本發(fā)明還公開了 R0S響應(yīng)的納米藥物遞送系統(tǒng)作為制備抗腫瘤藥物制劑的應(yīng)用。
[0031] 進(jìn)一步地，980nm激光激發(fā)UCNPs發(fā)射出645-675nm光譜，通過FRET效應(yīng)，部分645-675nm光被光敏劑二氫卟吩e6或脫鎂葉綠酸-A吸收，光敏劑發(fā)射出的熒光或UCNPs發(fā)射出的 熒光，用于體內(nèi)外熒光成像;光敏劑釋放出R0S，用于腫瘤的光動(dòng)力治療;R0S切割縮硫酮 linker釋放抗腫瘤化療藥物，用于腫瘤化療。
[0032]基本原理:將連接R0S敏感的縮硫酮化療藥、光敏劑都負(fù)載在上轉(zhuǎn)換材料UCNPs上， 在980nm激光的照射下，通過UCNPs的上轉(zhuǎn)換效應(yīng)，發(fā)射出500-700nm的光，而光敏劑吸收這 些光可釋放出R0S，R0S可用于光動(dòng)力治療；同時(shí)R0S可切割R0S敏感化學(xué)鍵，釋放藥物進(jìn)行化 療；同時(shí)上轉(zhuǎn)換效應(yīng)發(fā)射的熒光或光敏劑發(fā)射出的光可進(jìn)行熒光成像。一個(gè)納米體系可做 到光動(dòng)力治療、化療與熒光成像相結(jié)合。
[0033] 其有益效果：
[0034] (1)光敏劑的激發(fā)光譜和UCNPs的發(fā)射光譜重合，當(dāng)激光激發(fā)UCNPs發(fā)光時(shí)，UCNPs 的發(fā)射光譜可以使得光敏劑發(fā)光和釋放出R0S。此外，腫瘤細(xì)胞往往R0S較多，R0S可以切割 縮硫酮linker釋放抗腫瘤化療藥物。因此，使用R0S響應(yīng)的納米藥物遞送系統(tǒng)可以在時(shí)間和 空間上對(duì)藥物釋放進(jìn)行控制。
[0035] (2)此納米遞送系統(tǒng)是980nm激光激發(fā)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光，用于成像具有無背景光，抗 淬滅效應(yīng)好，穿透深度深的特點(diǎn)。
[0036] (3)光控釋放R0S和R0S敏感的化學(xué)鍵的切割釋放抗腫瘤化療藥物，使得利用R0S響 應(yīng)的納米藥物遞送系統(tǒng)可進(jìn)行光動(dòng)力治療和化療聯(lián)合治療，一次將腫瘤根除。
[0037] (4)除上述治療外，UCNPs發(fā)射的熒光或光敏劑發(fā)射出的光可進(jìn)行熒光成像，因而 可進(jìn)行治療成像一體化。
[0038] (5)此納米制劑的生物相容性好。
[0039] (6)此納米制劑粒徑均勻，穩(wěn)定性好。
[0040] UCNPs表面修飾有含R0S敏感l(wèi)inker的化療藥，光敏劑和羧基化的PEG。以980nm激 光照射，UCNPs發(fā)射出645-675nm熒光。而光敏劑能吸收645-675nm光產(chǎn)生R0S，R0S不僅能用 于光動(dòng)力治療，也能切斷R0S敏感的硫醇linker，釋放化療藥物，同時(shí)此納米顆?？捎糜诜?光成像。此納米顆?？梢酝ㄟ^光動(dòng)力治療和化療聯(lián)合治療根除腫瘤。此納米顆粒為診療一 體化的納米顆粒提供了一種新的選擇。
【附圖說明】
[0041]圖1是本發(fā)明一個(gè)【具體實(shí)施方式】的R0S響應(yīng)的納米藥物遞送系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖。
[0042]圖2是本發(fā)明一個(gè)【具體實(shí)施方式】的R0S響應(yīng)的納米藥物遞送系統(tǒng)用于光動(dòng)力治療 和化療聯(lián)合治療的機(jī)理圖。
[0043] 圖3是本發(fā)明具體實(shí)施例一的TL-CPT的合成路線圖。
[0044] 圖4是本發(fā)明一個(gè)【具體實(shí)施方式】的納米顆粒及表面相關(guān)配體的傅立葉紅外光譜 圖。
[0045] 圖5是本發(fā)明一個(gè)【具體實(shí)施方式】的R0S響應(yīng)的納米藥物遞送系統(tǒng)在980nm激光照射 下，通過上轉(zhuǎn)換方式發(fā)射的熒光光譜圖。
[0046] 圖6是本發(fā)明一個(gè)【具體實(shí)施方式】的R0S響應(yīng)的納米藥物遞送系統(tǒng)在510nm激光激發(fā) 的發(fā)射光譜圖。
[0047] 圖7是測(cè)試縮硫酮linker的R0S敏感性的1H NMR圖。
[0048]圖8是本發(fā)明【具體實(shí)施方式】一的R0S響應(yīng)的納米藥物遞送系統(tǒng)用于光動(dòng)力和化療 對(duì)肺癌細(xì)胞NCI-H460的聯(lián)合治療的柱狀圖。
[0049] 圖9是本發(fā)明【具體實(shí)施方式】一的R0S響應(yīng)的納米藥物遞送系統(tǒng)以光敏劑Ce6的熒光 為信號(hào)對(duì)原位肺癌進(jìn)行示蹤定位的熒光顯示圖。
【具體實(shí)施方式】
[0050] 下面結(jié)合附圖和具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些 實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用 的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說 明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0051 ] 如圖1所示的R0S響應(yīng)的納米藥物遞送系統(tǒng)以UCNPs為內(nèi)核，其表面包覆PEG、Ce6、 縮硫酮linker連接的喜樹堿，表面殘留部分油胺，其具體制備方法見實(shí)施例一。
[0052] 如圖2所示，R0S響應(yīng)的納米藥物遞送系統(tǒng)在980nm激光照射下，UCNPs通過上轉(zhuǎn)換 效應(yīng)發(fā)光，Ce6吸收這些光后釋放出R0S，一方面R0S可用于光動(dòng)力治療，另一方面R0S可切割 縮硫酮linker釋放出結(jié)合在縮硫酮linker上的抗腫瘤化療藥物，比如喜樹堿，進(jìn)行化療。 [0053] 實(shí)施例一
[0054] 1.上轉(zhuǎn)換材料UCNPs合成步驟如下：
[0055] 4mmo 1 CF3C00Na 和 2mmo 1 (總量）Ln (CF3C00) 3 (Ln: 78mo 1 % Y+20mo 1 % Yb+1 · 6mo 1 % Er+0.4mol %Tm)加入lOOmL三頸瓶中，加入20mL油胺。攪拌加熱至ljl20°C去除水分和氧氣，通 氮?dú)鈹嚢鑜h。期間一直為通氮?dú)鉅顟B(tài)，當(dāng)反應(yīng)液轉(zhuǎn)為