一種竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系的制備方法及其在光動(dòng)力療法中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于具有光動(dòng)力活性的光敏劑技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種通過(guò)金屬鍵螯合偶聯(lián)竹紅菌甲素光敏劑與靶向分子的方法，以及通過(guò)該方法制備得到的竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系在光動(dòng)力療法中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]光動(dòng)力療法(photodynamic therapy，簡(jiǎn)稱(chēng)PDT)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型腫瘤臨床療法，因其抗瘤譜廣、無(wú)嚴(yán)重副反應(yīng)、微創(chuàng)以及經(jīng)濟(jì)方便等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。尤其對(duì)于那些屬于癌癥晚期和由于年齡、體質(zhì)等原因不適合使用傳統(tǒng)治療技術(shù)的病人，光動(dòng)力療法仍然是一種理想的治療手段。光動(dòng)力療法主要通過(guò)使用適當(dāng)波長(zhǎng)的光源激發(fā)光敏劑產(chǎn)生活性氧，活性氧通過(guò)一系列生理生化反應(yīng)最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。
[0003]竹紅菌甲素(HypocrellinA，簡(jiǎn)稱(chēng)HA)具有光敏產(chǎn)生各種活性氧的能力。與目前已經(jīng)商品化的光敏劑(如血卟啉類(lèi)衍生物)相比，其具有易得、易純化、化學(xué)修飾性好、三重態(tài)量子產(chǎn)率高、單重態(tài)氧量子產(chǎn)率高、光毒性高、體內(nèi)代謝快等優(yōu)點(diǎn)，在光動(dòng)力抗艾滋病毒、治療腫瘤和微血管類(lèi)疾病等方面有廣泛的潛在應(yīng)用價(jià)值。
[0004]然而，理想的光動(dòng)力療法藥物除需具備較強(qiáng)的活性氧產(chǎn)生能力外，還需具備一定的腫瘤組織靶向能力，這樣才可以將光療藥物有效的運(yùn)送至靶組織、靶器官、靶細(xì)胞以及細(xì)胞內(nèi)的特定部位，提高治療效果，同時(shí)可以保護(hù)機(jī)體正常組織和細(xì)胞不受傷害。
[0005]在眾多靶向系統(tǒng)中，受體介導(dǎo)的主動(dòng)靶向系統(tǒng)因其具有高特異性、高選擇性、飽和性、親合力強(qiáng)和生物效應(yīng)明顯等特點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。利用配體為藥物的載體，通過(guò)受體介導(dǎo)作用，增加病灶局部藥物濃度，提高療效，降低毒副作用，達(dá)到靶向治療目的。
[0006]轉(zhuǎn)鐵蛋白-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin-Transferr in Receptor ,Tf-TfR)受體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞靶向給藥體系是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)是人體血液中主要的含鐵蛋白質(zhì)，負(fù)責(zé)體內(nèi)鐵的運(yùn)輸。鐵是細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及機(jī)能活動(dòng)所必需的微量元素之一，而腫瘤細(xì)胞主要是通過(guò)高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)來(lái)攝取鐵。腫瘤細(xì)胞表面大量表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體為轉(zhuǎn)鐵蛋白作為藥物載體提供了可能。轉(zhuǎn)鐵蛋白與藥物結(jié)合在一起，在組織中的分配性好，延長(zhǎng)了藥物在胞漿中的半衰期，同時(shí)還可達(dá)到控釋目的。
[0007]傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)鐵蛋白-藥物給藥體系(Tf-Drug)的構(gòu)建主要是通過(guò)兩種途徑，一是通過(guò)偶聯(lián)反應(yīng)形成藥物與蛋白之間的西佛堿從而形成一個(gè)穩(wěn)定的給藥體系，但該化學(xué)反應(yīng)過(guò)程會(huì)在一定程度上影響轉(zhuǎn)鐵蛋白的構(gòu)象及活性;而且，穩(wěn)定化學(xué)鍵可能影響后期藥物的釋放過(guò)程。另外一種方法是通過(guò)藥物與蛋白之間簡(jiǎn)單的相互作用力，如靜電力、疏水鍵、氫鍵等將蛋白與藥物連接，這種方法反應(yīng)體系簡(jiǎn)單、對(duì)蛋白構(gòu)象及活性影響小，但因?yàn)橐陨先N作用力強(qiáng)度不高，因此該方法得到的給藥體系在給藥過(guò)程中往往發(fā)生所載藥物從蛋白上脫落，造成給藥體系的崩解。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于克服竹紅菌甲素不具有主動(dòng)的腫瘤組織靶向的缺點(diǎn)，提供一種竹紅菌甲素靶向給藥體系的制備方法，利用竹紅菌甲素易與金屬離子螯合的特點(diǎn)，通過(guò)金屬鍵將竹紅菌甲素與轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)，制備出具有臨床應(yīng)用前景的竹紅菌甲素靶向給藥體系，并將該靶向給藥體系應(yīng)用于光動(dòng)力療法領(lǐng)域。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0010]—種竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系的制備方法，其特征在于，采用全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白作為載體，在生理緩沖溶液中，使用尿素、巰基乙醇將全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白失活，使其三維結(jié)構(gòu)松散露出Fe離子配位點(diǎn)后，將過(guò)量竹紅菌甲素加入(優(yōu)選按HA與Tf按2:1比例加入)，4°(:恒溫震蕩10_24h，透析除掉未結(jié)合的竹紅菌甲素(HA)及尿素、β-巰基乙醇，還原全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白三維結(jié)構(gòu)，制得竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系。
[0011]上述竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系，是一種適合靜脈注射的制劑，樣品經(jīng)冷凍干燥后可獲得凍干粉，使用之前用水溶解，溶解后可制成適合靜脈注射的制劑。
[0012]本發(fā)明針對(duì)傳統(tǒng)方法的缺陷，利用轉(zhuǎn)鐵蛋白的獨(dú)特性質(zhì)及竹紅菌甲素的特性，在經(jīng)典的蛋白變性-復(fù)性體系(尿素、巰基乙醇)中，利用變性劑將轉(zhuǎn)鐵蛋白螺旋結(jié)構(gòu)打開(kāi)后，進(jìn)行其攜帶的鐵離子與竹紅菌甲素進(jìn)行配位，而后通過(guò)透析除掉變性劑后，蛋白恢復(fù)構(gòu)象，將竹紅菌素裝載于其內(nèi)部，構(gòu)建通過(guò)竹紅菌甲素中的酚羥基與醌羰基與轉(zhuǎn)鐵蛋白中Fe3+螯合進(jìn)而將茈醌類(lèi)光敏劑緊密結(jié)合在轉(zhuǎn)鐵蛋白上的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)竹紅菌素的靶向給藥。竹紅菌甲素非常容易與金屬離子螯合，這種螯合的作用力強(qiáng)度又遠(yuǎn)大于普通的作用力，如靜電力、疏水鍵、氫鍵等，而且這種螯合是物理作用并沒(méi)有發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，因此對(duì)蛋白的活性和構(gòu)象都沒(méi)有太大的影響。本發(fā)明采用的利用蛋白變性復(fù)性體系實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)鐵蛋白藥物裝載的方法從未見(jiàn)報(bào)道;因此通過(guò)金屬螯合鍵將竹紅菌甲素與轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)既不影響蛋白活性及構(gòu)象，又能實(shí)現(xiàn)竹紅菌甲素靶向給藥，該類(lèi)載體在光動(dòng)力療法領(lǐng)域具有極大的潛力。
[0013]完成本發(fā)明第二項(xiàng)發(fā)明任務(wù)的方案是:所述方法制得的竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系在制備光動(dòng)力療法藥物中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明的一種竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系的制備方法所制得的竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系具有如下的優(yōu)點(diǎn):
[0015]1.本發(fā)明的靶向給藥體系制備方法簡(jiǎn)單、條件溫和，有效地保持了轉(zhuǎn)鐵蛋白的構(gòu)象，對(duì)其靶向功能的維持非常重要；
[0016]2.與單獨(dú)存在的竹紅菌甲素相比，該竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系不但水溶性高、分散性好，且在生理環(huán)境穩(wěn)定分散性質(zhì)佳；
[0017]3.竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系具有腫瘤細(xì)胞靶向功能，體外癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該給藥體系能有效增加腫瘤細(xì)胞對(duì)竹紅菌甲素光敏劑的攝取進(jìn)而增強(qiáng)其光動(dòng)力活性。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為竹紅菌甲素(HA)裝載入轉(zhuǎn)鐵蛋過(guò)程中，轉(zhuǎn)鐵蛋白構(gòu)象變化及還原過(guò)程;其中
[0019](A)Tf、Tf+尿素+β-巰基乙醇+HA透析前及Tf+尿素+β-巰基乙醇+HA透析后圓二色信號(hào)的疊加圖；
[0020](B)Tf圓二色信號(hào)以及軟件計(jì)算得到的蛋白各種