二級結(jié)構(gòu)組分含量；
[0021](C)Tf+尿素+β-巰基乙醇+HA透析前圓二色信號以及軟件計(jì)算得到的蛋白各種二級結(jié)構(gòu)組分含量；
[0022](D)Tf+尿素+β-巰基乙醇+HA透析后圓二色信號以及軟件計(jì)算得到的蛋白各種二級結(jié)構(gòu)組分含量。
[0023]圖2為竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白螯合物(HA-Tf)及竹紅菌甲素(HA)水溶液穩(wěn)定性比較。
[0024]圖3為竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白螯合物(HA-Tf)及竹紅菌甲素(HA)腫瘤細(xì)胞攝取能力比較；
[0025]圖4為竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白螯合物(HA-Tf)及竹紅菌甲素(HA)光敏殺傷腫瘤細(xì)胞能力比較。
【具體實(shí)施方式】
[0026]實(shí)施例1
[0027]—種竹紅菌甲素靶向給藥體系的制備方法，使用全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白制備竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白螯合物，方法如下:
[0028]在生理緩沖溶液中，使用尿素、β-巰基乙醇將全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白失活，使其三維結(jié)構(gòu)松散露出Fe離子配位點(diǎn)后，將過量竹紅菌甲素加入(按HA與Tf按2:1比例加入)，4°C恒溫震蕩24h，透析除掉未結(jié)合的HA及尿素、β-巰基乙醇以還原全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白三維結(jié)構(gòu)，獲得竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系，樣品經(jīng)冷凍干燥獲得凍干粉，使用之前用純凈水溶解。
[0029]竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系表征:
[0030]本實(shí)施例的靶向給藥體系制備過程中蛋白構(gòu)象變化及復(fù)原過程、穩(wěn)定性、腫瘤攝取及光敏抗腫瘤活性以圓二色譜(Chriascan,Applied Photophysics)、紫外可見光譜及MTT比色法檢測。
[0031](I)靶向給藥體系制備過程中蛋白構(gòu)象變化及復(fù)原過程
[0032]圓二色光譜儀通過測量生物大分子的圓二色光譜從而得到生物大分子的二級結(jié)構(gòu)，廣泛用于蛋白質(zhì)折疊及蛋白質(zhì)構(gòu)象研究。因此，在靶向給藥體系制備過程中蛋白構(gòu)象變化及復(fù)原過程使用圓二色譜檢測。尿素及巰基乙醇是經(jīng)典的可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)空間構(gòu)象解旋劑。如圖1A所示，在向Tf溶液中加入尿素、β_巰基乙醇及HA反應(yīng)24h后，Tf的圓二色信號發(fā)生顯著改變，通過軟件計(jì)算可知，其體系內(nèi)包括α-螺旋、轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)均發(fā)生顯著改變，且無規(guī)則卷曲含量增加，說明此時(shí)蛋白空間構(gòu)象發(fā)生改變，整體結(jié)構(gòu)趨向解旋?？臻g結(jié)構(gòu)松散有利于暴露其鐵離子，進(jìn)而易于與HA發(fā)生配位。透析除掉尿素及β-巰基乙醇，發(fā)現(xiàn)其圓二色信號恢復(fù)，與原始Tf基本相同，經(jīng)軟件計(jì)算其α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)也均與原始Tf基本相同，說明Tf構(gòu)象恢復(fù)，且HA的載入對Tf構(gòu)象影響很小，這對其保留腫瘤靶向功能非常重要。
[0033](2)靶向給藥體系水相中穩(wěn)定性分析
[0034]藥物在水相中的穩(wěn)定性非常重要，若在儲存或給藥過程中，發(fā)生藥物劇集沉降，可能會影響藥物活性。蛋白質(zhì)水溶性佳，生理環(huán)境分散性質(zhì)優(yōu)，因此，與轉(zhuǎn)鐵蛋白形成螯合物后，其水相穩(wěn)定分散性質(zhì)應(yīng)有顯著提升。使用紫外可見光譜法監(jiān)測竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白螯合物(HA-Tf)及竹紅菌甲素(HA)在水相中的穩(wěn)定分散性質(zhì)。同濃度樣品置于比色皿中，4°C保存及測試，連續(xù)3天測試上清液紫外可見吸收光譜，若樣品發(fā)生聚集沉降，其紫外可見光譜吸收強(qiáng)度將發(fā)生顯著下降，以此判斷樣品在水相中的穩(wěn)定分散性質(zhì)。如圖2所示，3天后，竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白螯合物(HA-Tf)幾乎沒有發(fā)生沉降，而竹紅菌甲素樣品則發(fā)生顯著沉降，說明該復(fù)合體系具有優(yōu)良的水相穩(wěn)定分散性質(zhì)。
[0035](3)竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白螯合物(HA-Tf)及竹紅菌甲素(HA)腫瘤細(xì)胞攝取能力比較
[0036]據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，乳腺癌細(xì)胞HeLa表面高表達(dá)Tf受體，因此，研究HeLa細(xì)胞對Tf修飾藥物的攝取科學(xué)合理。竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白螯合物(HA-Tf)及竹紅菌甲素(HA)溶液加入培養(yǎng)有乳腺癌細(xì)胞HeLa的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使用紫外可見吸收光譜監(jiān)測培養(yǎng)孔內(nèi)培養(yǎng)液中所含藥物濃度變化規(guī)律，判斷腫瘤細(xì)胞對二者的吸收能力，如圖3所示，在不同藥物孵育時(shí)間范圍內(nèi)，HeLa細(xì)胞對竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白螯合物(HA-Tf)均強(qiáng)于HA，說明體系具有腫瘤靶向能力。
[0037](4)光敏抗腫瘤能力研究
[0038]使用MTT法研究竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白螯合物(HA-Tf)及竹紅菌甲素(HA)的光敏抗腫瘤能力，研究結(jié)果表明，470nmLED光照后，竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白螯合物(HA-Tf)殺傷腫瘤細(xì)胞的能力強(qiáng)于竹紅菌甲素(HA)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系的制備方法，其特征在于，采用全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白作為載體，在生理緩沖溶液中，使用尿素、β-巰基乙醇將全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白失活，使其三維結(jié)構(gòu)松散露出Fe離子配位點(diǎn)后，將過量竹紅菌甲素加入，4°C恒溫震蕩10-24h，透析除掉未結(jié)合的HA及尿素、β-巰基乙醇，還原全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白三維結(jié)構(gòu)，制得竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系的制備方法，其特征在于，所述的反應(yīng)物之間的比例關(guān)系是全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白:竹紅菌甲素=1:2。3.—種權(quán)利要求1所述的方法制得的竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系在制備光動(dòng)力療法藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系的制備方法及其在光動(dòng)力療法中的應(yīng)用。所述的方法是，采用全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白作為載體，利用尿素、β-巰基乙醇將全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白失活，使其三維結(jié)構(gòu)松散露出Fe離子配位點(diǎn)后，將過量竹紅菌甲素加入，其與鐵配位后，透析除掉未結(jié)合的HA及尿素、β-巰基乙醇以還原全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白三維結(jié)構(gòu)，獲得竹紅菌甲素-轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向給藥體系。本發(fā)明方法制備簡單，應(yīng)用前景良好；該靶向給藥體系可制成凍干粉保存，溶解后制成適合靜脈注射的制劑；因該體系中轉(zhuǎn)鐵蛋白的腫瘤靶向作用，該靶向給藥體系可顯著增強(qiáng)竹紅菌甲素光敏抗腫瘤活性。
【IPC分類】A61K47/48, A61K31/122, A61P35/00, A61K41/00
【公開號】CN105617380
【申請?zhí)枴緾N201610036585
【發(fā)明人】周林, 周家宏, 魏少華, 陳鑫, 武琦, 宋子怡
【申請人】南京師范大學(xué)
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2016年1月20日