用于增強免疫應(yīng)答的哺乳動物乳骨橋蛋白的制作方法
【專利說明】用于增強免疫應(yīng)答的晡乳動物乳骨橋蛋白 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及在哺乳動物例如人受試者中提高對感染性疾病的免疫應(yīng)答，以及在哺 乳動物諸如人中增強用于預(yù)防性或治療性治療感染性疾病的疫苗接種的功效。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)口 服給予哺乳動物乳骨橋蛋白（0ΡΝ)或其活性截短部分可增強哺乳動物的免疫應(yīng)答，并且增 強由哺乳動物中的疫苗接種誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，從而增強疫苗接種的預(yù)防性或治療性功效。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 免疫系統(tǒng)針對活生物體中的疾病提供主要的防御機制，因此病原體和外來生物體 被免疫系統(tǒng)的組分檢測到并且消除。先天免疫應(yīng)答針對感染起第一道防線的作用，該先天 免疫應(yīng)答包括多樣的細胞組分，包括粒細胞（嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細 胞）、肥大細胞、自然殺傷細胞（NKC)和抗原呈遞細胞（APC)，諸如巨噬細胞和樹狀細胞（DC) 以及可溶性因子，諸如補體蛋白。作為第二道防線的適應(yīng)性免疫應(yīng)答較慢地形成，并且包 括選擇細胞應(yīng)答與體液應(yīng)答用于消除病原體。細胞免疫主要是Thl誘導(dǎo)的，從而引起用來 破壞受損宿主細胞（例如經(jīng)病毒或病原體感染的細胞）的細胞毒性T細胞、自然殺傷細胞 (NKC)和活化巨噬細胞的分化。體液免疫表現(xiàn)為抗原特異性和抗原記憶增加，因此Th2活化 和細胞因子產(chǎn)生引起產(chǎn)生抗體的B細胞和記憶細胞的生成，這些產(chǎn)生抗體的B細胞和記憶 細胞有助于識別病原體來源的抗原和病原體消除。
[0004] 新生哺乳動物中的先天免疫是不發(fā)達的，這樣使得新生兒中的抗病性嚴(yán)重地依賴 于被動獲取通過母體乳汁（具體地，初乳）得到的母體抗體。與此同時，嬰兒免疫系統(tǒng)的發(fā) 育通過存在于母乳中的免疫刺激組分來誘導(dǎo)。在喂食配方乳而不是母乳的新生哺乳動物中 的免疫系統(tǒng)的發(fā)育延遲，其原因是將以另外的方式提供于母乳中的主要的免疫誘導(dǎo)和免疫 賦予組分的缺乏。
[0005] 在整個生命中維持免疫系統(tǒng)仍然是健康所必需的，并且因此任何年齡的免疫受損 個體以及具有穩(wěn)步下降的免疫的老年個體代表著處于更高疾病相關(guān)死亡率的風(fēng)險中的患 者群。
[0006] 提升對感染性疾病的免疫抵抗力的疫苗接種是改善公共衛(wèi)生的最有效方法。疫苗 可供使用的疾病范圍正在不斷地增加，并且使用這些疫苗來保護成年群體（具體地，不斷 增加的老年群體）也正在增加。預(yù)防性或者治療性的疫苗接種刺激身體的免疫系統(tǒng)，以便 識別類似于給定的致病劑的抗原劑，破壞它，并且"記住"它，這樣使得當(dāng)再次暴露時免疫系 統(tǒng)可以更容易地識別并且破壞該致病劑。典型地，這樣一種試劑是從病原性微生物的削弱 或殺死的形式、它的毒素或它的表面蛋白中的一種制得。
[0007] 因為疫苗接種的功效取決于已接種疫苗的受試者提升有效免疫應(yīng)答的能力，所以 疫苗接種的益處在免疫系統(tǒng)沒有完全發(fā)育的個體中（如在新生或年幼的嬰兒中）或者在其 免疫系統(tǒng)下降、受損或衰退的個體中（如在一些成年人和老年人中）有所減少。因此，存在 對能夠在這些患者群中增強免疫應(yīng)答（具體地，對疫苗接種的免疫應(yīng)答）的試劑的需要。對 這些大量的患者群體進行疫苗接種的公共衛(wèi)生計劃必須是極其安全的，并且因此用來增強 對疫苗接種的免疫應(yīng)答的試劑和用于這些試劑給予的手段兩者必須滿足這些安全要求。
[0008] 骨橋蛋白（0ΡΝ)是由多種細胞類型表達的細胞外基質(zhì)蛋白，這些細胞類型包括破 骨細胞、成骨細胞、巨噬細胞、活化的Τ細胞、平滑肌細胞以及上皮細胞。該骨橋蛋白存在于 若干個組織中，這些組織包括骨、腎、胎盤、平滑肌以及分泌上皮細胞。0ΡΝ能夠介導(dǎo)細胞粘 附和迀移，并且與正常的組織重塑過程諸如骨再吸收、血管發(fā)生、傷口愈合以及組織損傷相 關(guān)聯(lián)。0ΡΝ還在某些患病的狀態(tài)下表達，例如再狹窄、動脈粥樣硬化、腎病以及腫瘤發(fā)生。已 經(jīng)觀察到編碼0ΡΝ的基因的修改的轉(zhuǎn)錄，其中改變的剪接轉(zhuǎn)錄物在某些疾病狀態(tài)下引起不 同形式的0ΡΝ的表達（比松內(nèi)特（Bissonnette)等人2012)。0ΡΝ通過與整聯(lián)蛋白相互作 用而發(fā)揮它的許多生物作用，這些整聯(lián)蛋白包括一個大家族的介導(dǎo)細胞-細胞和細胞-基 質(zhì)相互作用兩者的異源二聚體跨膜受體，并且該0ΡΝ可以在炎癥疾病中起作用。
[0009] W0 98/56405 A1涉及一種通過改變（增加或降低）骨橋蛋白活性來調(diào)制（增大或 減少）個體的免疫應(yīng)答的方法；但缺乏證據(jù)支持向受試者給予0ΡΝ(例如重組0ΡΝ)的治療 作用。
[0010] WO 00/63241 A2涉及作為免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑的Eta-1/骨橋蛋白；但沒能證明給予 0ΡΝ可增強對感染性疾病的免疫抵抗力。
[0011] 卡哈吉（Khajoee)V等人，2006 臨床與實驗免疫學(xué)（CLINICALANDEXPER頂ENTAL IMMUNOLOGY)，143(2) :260-268涉及，基于使用人單核細胞來源的巨噬細胞培養(yǎng)物所進行的 研究的骨橋蛋白在對抗分枝桿菌感染的防御上的作用。
[0012] 附圖簡述
[0013] 圖1動物測試群體和研究設(shè)計。將小豬分成接受大母豬代乳品配方（FF;n= 10) 或用140mg/L骨橋蛋白補充的配方（0ΡΝ;n= 12)或者大母豬養(yǎng)育（SR;n= 7)的三個膳食 組。
[0014] 圖2屬于接受大母豬代乳品配方（FF;n= 10)或用140mg/L骨橋蛋白補充的配方 (0ΡΝ;n= 12)的膳食組的小豬，以及示于插圖中的大母豬養(yǎng)育的小豬（SR;n= 7)的產(chǎn)后 平均每日體重。
[0015] 圖3通過ELISA所測量的來源于7天齡、14天齡和21天齡的小豬的血清中的 Fluzone?特異性IgG效價。未接種疫苗的小豬中的流感病毒疫苗特異性IgG水平示于插 圖中。數(shù)據(jù)被表達為平均值土SD。不同下標(biāo)是指在p〈0. 05處的統(tǒng)計學(xué)顯著性。未接種疫 苗的組中的上標(biāo)是指統(tǒng)計學(xué)顯著的時間差異；接種疫苗的圖中的上標(biāo)指示在第21天時膳 食處理組之間的差異。
[0016] 圖4通過ELISA所測量的在接種疫苗和未接種疫苗的小豬的血清中的總IgG濃 度。該血清來源于7天齡、14天齡和21天齡的小豬血液樣品。在第21天時取得的樣品中 所測量的總IgG水平示于插圖中。數(shù)據(jù)被表達為平均值土SD。上標(biāo)是指隨時間推移的統(tǒng)計 學(xué)顯著的差異。
[0017] 圖5通過ELISA所測量的來源于7天齡、14天齡和21天齡的小豬的血清中的總 IgM濃度。數(shù)據(jù)被表達為平均值土SD。上標(biāo)是指隨時間推移的統(tǒng)計學(xué)顯著的差異。
[0018] 圖6對于CD4(克隆74-12-4)和CD8(克隆76-2-11)所染色的PBMCT淋巴細 胞群體的流式細胞術(shù)散點圖。4個象限繪制了⑶8+淋巴細胞（具有⑶3+⑶4-⑶8+分布 (profile)的細胞毒性T細胞）；⑶4+淋巴細胞（具有⑶3+⑶4+⑶8-分布的T輔助細胞）、 ⑶4+⑶8+淋巴細胞（具有⑶3+⑶4+⑶8+分布的記憶T細胞）。
[0019] 圖7膳食對第21天時PBMC中的T輔助細胞⑶4+細胞（圖A)、細胞毒性⑶8+T 細胞（圖Β)的豐度和對⑶4+/⑶8+比率（圖C)的作用。細胞群體被表達為總⑶3+Τ細胞 的％。數(shù)據(jù)被表達為平均值土SD，并且不同上標(biāo)指示在p〈0. 05處的統(tǒng)計學(xué)顯著的差異。* 指示在P〈〇. 1處的統(tǒng)計趨勢。
[0020] 圖8膳食對第21天時MLN中的細胞毒性⑶8+T細胞（圖A)的豐度和對⑶4+/ CD8+T細胞比率（圖B)的作用。細胞群體被表達為總CD3+T細胞的％。數(shù)據(jù)被表達為平均 值土SD，并且不同上標(biāo)指示在p〈0. 05處的統(tǒng)計學(xué)顯著的差異。*指示在p〈0. 1處的統(tǒng)計趨 勢。
[0021] 圖9膳食對第21天時脾中的記憶（⑶4+⑶8+)T細胞的豐度的作用。細胞群體被 表達為總⑶3+T細胞的％。數(shù)據(jù)被表達為平均值土SD，并且不同上標(biāo)指示對于疫苗接種組 內(nèi)的膳食作用的在P〈〇. 05處的統(tǒng)計學(xué)顯著的差異；*指示對于疫苗接種作用的在p〈0. 05 處的統(tǒng)計學(xué)顯著性。
[0022] 圖10由PBMC細胞產(chǎn)生的IL-12分泌。將PBMC細胞離體培養(yǎng)72小時，收集條件 培養(yǎng)基并且通過ELISA分析IL-12。數(shù)據(jù)被表達為平均值土SD，并且不同上標(biāo)指示對于處 理組之中的膳食作用的在P〈〇. 05處的統(tǒng)計學(xué)顯著的差異；*指示對于疫苗接種作用的在 p〈0. 05處的統(tǒng)計學(xué)顯著性。
[0023] 圖11植物凝集素（PHA)刺激對PBMC分泌IL-12 (A)和IL-10⑶的作用。在PHA 存在下將PBMC細胞離體培養(yǎng)72小時，收集條件培養(yǎng)基并且通過ELISA分析IL-10和IL-12。 數(shù)據(jù)被表達為平均值土SD，并且不同上標(biāo)指示對于處理組之中的膳食作用的在p〈0. 05處 的統(tǒng)計學(xué)顯著的差異；*指示對于膳食作用的在P〈〇. 1處的統(tǒng)計趨勢。
[0024] 圖12脂多糖（LPS)刺激對PBMC分泌IL-12 (A)、IL-6⑶和IL-10 (C)的作用。在 LPS存在下將PBMC細胞離體培養(yǎng)72小時，收集條件培養(yǎng)基并且通過ELISA分析IL-6、IL-10 和IL-12。數(shù)據(jù)被表達為平均值土SD，并且不同上標(biāo)指示對于處理組之中的膳食作用的在 p〈0. 05處的統(tǒng)計學(xué)顯著的差異；*指示對于疫苗接種作用的在p〈0. 05處的統(tǒng)計學(xué)顯著性。
[0025] 圖13流感病毒疫苗刺激對PBMC分泌IL-12 (A)和IL-10 (B)的作用。在流感病毒 疫苗存在下將PBMC細胞離體培養(yǎng)72小時，收集條件培養(yǎng)基并且通過ELISA分析IL-10和 IL-12。數(shù)據(jù)被表達為平均值土SD，并且不同上標(biāo)指示處理組之中的在p〈0. 05處的統(tǒng)計學(xué) 顯著的差異；*指示對于疫苗接種作用的在P〈〇. 05處的統(tǒng)計學(xué)顯著性。
[0026] 圖14由脾細胞產(chǎn)生的IL-12(A)和IL-10⑶分泌。將脾細胞離體培養(yǎng)72小時， 收集條件培養(yǎng)基并且通過ELISA分析IL-6、IL-10和IL-12。數(shù)據(jù)被表達為平均值土SD，并 且不同上標(biāo)指示對于處理組之中的膳食作用的在P〈〇. 05處的統(tǒng)計學(xué)顯著的差異；*指示對 于疫苗接種作用的在P= 〇. 07處的趨勢。
[0027] 圖15植物凝集素（PHA)刺激對脾分泌IL-12 (A)和IL-10⑶的作用。在PHA存 在下將脾細胞離體培養(yǎng)72小時，收集條件培養(yǎng)基并且通過ELISA分析IL-10和IL-12。數(shù) 據(jù)被表達為平均值土SD;不同上標(biāo)指示處理組之中的在p= 0. 07處的統(tǒng)計趨勢；*指示對 于疫苗接種作用的在P〈〇. 05處的統(tǒng)計學(xué)顯著。
[0028] 圖16脂多糖（LPS)刺激對脾分泌IL-12 (A)和IL-10⑶的作用。在LPS存在下 將脾細胞離體培養(yǎng)72小時，收集條件培養(yǎng)基并且通過ELISA分析IL-10和IL-12。數(shù)據(jù)被 表達為平均值土SD，并且不同上標(biāo)指示對于處理組之中的膳食作用的在p〈0. 05處的統(tǒng)計 學(xué)顯著的差異；*指示對于疫苗接種作用的在P〈〇.05處的統(tǒng)計學(xué)顯著。
[0029] 圖17流感病毒疫苗刺激對脾分泌IL_12(A)和IL-10(B)的作用。在流感病毒疫 苗存在下將脾細胞離體培養(yǎng)72小時，收集條件培養(yǎng)基并且通過ELISA分析IL-10和IL-12。 數(shù)據(jù)被表達為平均值土SD，并且不同上標(biāo)指示對于處理組之中的膳食作用的在p〈0. 05處 的統(tǒng)計學(xué)顯著的差異；*指示對于疫苗接種作用的在P〈〇. 05處的統(tǒng)計學(xué)顯著。
[0030] 圖18當(dāng)存在以下情況時的年齡在從1至6月齡的嬰兒中的發(fā)熱發(fā)病率：1)母乳 喂養(yǎng)；2)用沒有0ΡΝ添加的常規(guī)配方（RF) (F0)喂養(yǎng)；3)用添加大約65mg0PN/L的牛0ΡΝ 的RF(F65)喂養(yǎng)以及4)用添加大約130mg0PN/L的牛0ΡΝ的RF(F130)喂養(yǎng)。發(fā)病率以時 間的百分比給出，該時間是屬于每個處理組的嬰兒在一個日歷月的周期過程中被記錄為有 發(fā)燒的時間（記錄的時間/日歷月值是隨臨床試驗的周期記錄的值的平均值）。
[0031] 發(fā)明概述
[0032]當(dāng)口服給予時，出乎意料地發(fā)現(xiàn)哺乳動物乳骨橋蛋白（0ΡΝ)和/或其活性截短物 可在哺乳動物受試者中增強