一種葉酸修飾金納米顆粒的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明是一種功能化金納米顆粒的制備方法，特別是一種葉酸修飾的金納米顆粒的制備方法，屬于化學(xué)合成技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]金納米顆粒是一種具有強(qiáng)吸附能力、良好的定向能力和生物兼容性的納米材料。單分散金納米顆粒在溶液中呈現(xiàn)紅色，當(dāng)金納米顆粒表明進(jìn)行修飾或者聚集時(shí)，會(huì)引起顆粒間的等離子體耦合發(fā)生改變，導(dǎo)致其特征吸收峰發(fā)生位移或者吸收峰值下降。由于金納米顆粒特殊的光學(xué)特性，且金納米顆粒表面比較容易進(jìn)行基團(tuán)修飾(如自組裝巰基、羧基等)，常將金納米顆粒表面進(jìn)行修飾，構(gòu)建基于修飾金納米顆粒的光學(xué)檢測體系進(jìn)行實(shí)際的分析檢測應(yīng)用。通過將金納米顆粒表面修飾靶標(biāo)物質(zhì)特異性識(shí)別的物質(zhì)，即可實(shí)現(xiàn)不同靶標(biāo)物質(zhì)，如小分子、重金屬離子、蛋白質(zhì)、核酸、腫瘤細(xì)胞和病原體等的特異性檢測。
[0003]癌癥是危害人類健康的重大疾病之一，在2004年癌癥導(dǎo)致死亡的人數(shù)已達(dá)到740萬人，預(yù)計(jì)至2030年，全世界因癌癥死亡的人數(shù)預(yù)估將達(dá)到1200萬人。癌癥之所以難以治愈，主要原因在于發(fā)病初期檢測難度較大，而當(dāng)癌癥發(fā)展到后期被發(fā)現(xiàn)再進(jìn)行治療時(shí)已經(jīng)很難治愈。因此，癌癥的早期檢測已成為拯救癌癥患者的關(guān)鍵因素之一。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，一種在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)的細(xì)胞表面受體葉酸受體(FR)，在癌癥早期多種癌癥細(xì)胞表面呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào)。葉酸(FA)，一種水溶性維生素，廣泛的存在于新鮮的水果、蔬菜、肉類食品中，參與機(jī)體組織的生長，是FR的天然配體與葉酸受體之間有高的親和力。因此，通過制備葉酸修飾的金納米顆粒，利用腫瘤細(xì)胞表面過表達(dá)的FR，即可實(shí)現(xiàn)早期癌癥的診斷及治療。
[0004]目前，葉酸修飾的金納米顆粒的合成方法主要有2種。一種是以葉酸為還原劑與氯金酸在合適的條件下發(fā)生氧化還原反應(yīng)，直接制備葉酸功能化的金納米顆，另一種，是通過媒介分子，引入合適的基團(tuán)，一步步的將葉酸分子縮合至金納米顆粒表面。這兩種方法在實(shí)際的應(yīng)用中都有各自的缺點(diǎn)。第一種方式，是直接制備法，即葉酸修飾的金納米顆粒的形成過程伴隨著金納米顆粒的合成。他對(duì)制備納米顆粒的條件要求比較嚴(yán)苛，比如對(duì)反應(yīng)器皿的潔凈度要求高，反應(yīng)的條件需要高溫加熱等；而第二種方式，是間接制備法，葉酸修飾的金納米顆粒的形成是在金納米顆粒的合成之后再加以修飾合成的。這種方法需要一步步的縮合，每步縮合反應(yīng)的條件以及縮合效率，都會(huì)使得整個(gè)過程較為復(fù)雜。因此，建立一種簡單的葉酸修飾金納米顆粒的制備方法具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明基于金納米顆粒的獨(dú)特性能，利用配體交換原理，提出來一種簡單的葉酸修飾的金納米顆粒的制備方法，制備的葉酸修飾的金納米顆?？捎糜贔R過表達(dá)的癌細(xì)胞的識(shí)別。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種葉酸修飾的金納米顆粒的制備方法，首先制備金納米顆粒；將葉酸與金納米顆粒以一定比例混合，調(diào)整該混合液的pH值，基于配體交換使得葉酸修飾于金納米顆粒表面；離心去除未與金納米顆粒結(jié)合的葉酸分子，即可得到葉酸修飾的金納米顆粒。
[0007]本發(fā)明包括以下步驟:金納米顆粒的制備；葉酸修飾的金納米顆粒的制備；
[0008](1)金納米顆粒的制備
[0009]制備過程中所需的玻璃器皿都必須在新鮮配制的王水(HN03: HC1 = 3: 1)中浸泡30分鐘后，用大量的雙蒸水沖洗并在烘烤箱中烘干備用。制備過程中所需的原料，氯金酸和檸檬酸鈉在使用之前均需要用0.22mm微米過濾器過濾。具體的納米顆粒制備過程如下:配置100mL 0.01%的氯金酸，加入三頸瓶中，攪拌邊加熱至沸騰。待其煮沸后劇烈攪拌下迅速加入3.5mL 1%的檸檬酸鈉，繼續(xù)加熱攪拌15分鐘后待溶液變成酒紅色關(guān)閉加熱器，繼續(xù)攪拌30分鐘，關(guān)閉攪拌器，待溶液冷卻至室溫后，將制備好的金納米顆粒存放于棕色試劑瓶中并放置在4°C冰箱保存。所得金納米顆粒的直徑為13nm，濃度3.5nM。
[0010](2)葉酸修飾的金納米顆粒的制備
[0011]取上述步驟(1)中制備的金納米顆粒溶液5mL與5mL含10 4M(20mM PBS)的葉酸溶液的混合后，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值至6.2，室溫(25°C)下攪拌孵育12小時(shí)，12000rpm離心20分鐘，吸取去上清后用含0.1M NaCl 10mM PBS溶液(Ph 6.2)溶解洗滌沉淀，重復(fù)三次，去除多余的葉酸分子，再將其溶解于10mM PBS緩沖液(pH7.4)中備用。
【附圖說明】
[0012]圖1為金納米顆粒以及葉酸修飾的金納米顆粒的紫外表征圖
[0013]圖2為金納米顆粒以及葉酸修飾的金納米顆粒的透射電鏡圖
[0014]圖3為金納米顆粒以及葉酸修飾的金納米顆粒的Zeta電位圖
[0015]圖4為葉酸修飾的金納米顆粒靶向腫瘤細(xì)胞的紫外表征圖
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1.金納米顆粒的制備
[0017]配置lOOmL 0.01 %的氯金酸，加入三頸瓶中，攪拌邊加熱至沸騰。待其煮沸后劇烈攪拌下迅速加入3.5mL 1%的檸檬酸鈉，繼續(xù)加熱攪拌15分鐘后待溶液變成酒紅色關(guān)閉加熱器，繼續(xù)攪拌30分鐘，關(guān)閉攪拌器，待溶液冷卻至室溫后，12000rpm離心20分鐘后，溶解于10mM PBS緩沖液(pH7.4)，測定紫外-可見光譜、透射電鏡圖譜以及Zeta電位分布。如圖1中A所示，制備的金納米顆粒大約在520nm處出現(xiàn)特征可見吸收峰，證實(shí)金納米顆粒制備成功。
[0018]實(shí)施例2.葉酸修飾的金納米顆粒的制備
[0019]取5mL金納米顆粒溶液與5mL含10 4M(20mM PBS)的葉酸溶液的混后，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值至6.2，室溫(25°C )PBS下攪拌孵育12小時(shí)后，12000rpm離心20分鐘，吸取去上清后用含0.1M NaCl 10mM PBS緩沖液(pH6.2)溶解洗滌沉淀，重復(fù)三次，最終溶解于10mM PBS緩沖液(pH7.4)，測定紫外-可見光譜、透射電鏡圖譜以及Zeta電位分布。如圖1中B所示，制備的葉酸修飾的金納米顆粒的特征吸收峰出現(xiàn)位移，證實(shí)了金納米顆粒表面葉酸的成功修飾。對(duì)比金納米顆粒的透射電鏡圖(圖2A)，葉酸修飾金納米顆粒的透射電子顯微鏡圖(圖2B)，顆粒與顆粒間的排斥力變大(顆粒之間間隙變大)，因此更為穩(wěn)定。同樣的，對(duì)比修飾葉酸分子前后的Zeta電位分布圖，發(fā)現(xiàn)葉酸分子修飾的金納米顆粒表面的電荷負(fù)電性更高，也同樣證實(shí)了葉酸分子的成功修飾。
[0020]實(shí)施例3.葉酸修飾的金納米顆粒的細(xì)胞靶向
[0021]在37°C，5% C02的條件下用1640培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清)培養(yǎng)細(xì)胞系A(chǔ)549 (細(xì)胞表面不表達(dá)FR)以及KB (細(xì)胞表面FR高表達(dá))。用磷酸緩沖液沖洗細(xì)胞后，用
0.25%胰酶處理細(xì)胞5分鐘，之后lOOOrpm離心5分鐘，用磷酸緩沖液懸浮細(xì)胞，配置成105個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸浮液，放置于冰上備用。將A549及KB細(xì)胞懸浮液分別和葉酸修飾的金納米顆粒等體積的混勻，放置于冰上30分鐘后，測紫外-可見吸收光譜。如圖4所示，當(dāng)葉酸修飾的金納米顆粒與細(xì)胞高表的KB細(xì)胞共孵育時(shí)，葉酸修飾的金納米顆粒與KB細(xì)胞(曲線A)表面高表達(dá)的葉酸受體結(jié)合，使得其特征的紫外可見吸收峰發(fā)生明顯下降。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種葉酸修飾金納米顆粒的制備方法，其特征在于基于金納米顆粒，利用配體交換原理，通過控制溶液pH值，建立了一種簡單的葉酸修飾金納米顆粒的制備方法，該葉酸修飾的金納米顆?？捎米贤?可見光譜表征區(qū)分FR過表達(dá)的癌細(xì)胞。方法包括以下步驟:首先用經(jīng)典的檸檬酸鈉還原法制備直徑13nm的金納米顆粒；將葉酸與金納米顆粒以一定比例混合，調(diào)整該混合液的pH值，基于配體交換使得葉酸修飾于金納米顆粒表面；離心去除未與金納米顆粒結(jié)合的游離葉酸分子，即可得到葉酸修飾的金納米顆粒。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉酸修飾金納米顆粒的制備方法，其步驟如下 采用經(jīng)典的檸檬酸鈉還原法制備直徑13nm的金納米顆粒；取金納米顆粒溶液5mL與5mL含10 4M的葉酸溶液(20mM PBS緩沖液溶解)的混合后，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值至6.2，室溫(25°C )下攪拌孵育12小時(shí)，使得葉酸充分修飾；12000rpm離心20分鐘，吸取去上清后用含0.1M NaCl 10mM PBS溶液(Ph 6.2)溶解洗滌沉淀，重復(fù)三次，徹底去除未結(jié)合游離葉酸；再將其溶解于10mM PBS緩沖液(pH7.4)中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br>【專利摘要】一種葉酸修飾金納米顆粒的制備方法，屬于化學(xué)合成領(lǐng)域。本發(fā)明通過經(jīng)典的檸檬酸鈉還原法制備直徑13nm的金納米顆粒，基于配體交換原理，通過控制溶液pH值，建立了一種簡單的葉酸修飾金納米顆粒的制備方法，該葉酸修飾的金納米顆?？捎米贤?可見光譜表征葉酸受體過表達(dá)的癌細(xì)胞。
【IPC分類】A61K47/22, A61K49/00, A61P35/00
【公開號(hào)】CN105396146
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510788476
【發(fā)明人】許媛媛, 張?jiān)词? 張瑜娟
【申請(qǐng)人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年3月16日
【申請(qǐng)日】2015年11月13日