鐘2g/l，硫酸儀0. 58g/l，硫酸儘 0. 25g/l，吐溫-801ml/L，pH6. 3 + 0.l，12rC、15 分鐘滅菌。
[0035] 2、主要試劑：牛初乳來自黑龍江完達山松北牧場；葡聚糖硫酸鋼鹽來自北京畢特 博生物技術有限責任公司公司；柳氮橫胺化晚片來自上海信誼天平藥業(yè)有限公司；甲醒溶 液來自天津博迪化工股份有限公司；憐酸二氨鐘來自天津東麗區(qū)天大化學儀器廠；憐酸氨 二鋼來自天津市己斯夫化工有限公司。
[0036] 3、主要儀器：電子顯微鏡來自Motic公司；紫外可見分光光度計來自DU800美國 BECKMAN公司；眼科解剖盒來自沈陽市久鳴侶制品廠；注射器來自江蘇治宇醫(yī)療器械有限 公司。
[0037](二）、嗜酸乳桿菌CGMCC10436和植物乳桿菌CGMCC9961的分離
[0038] 1、從內蒙古錫林郭勒盟、海拉爾市及鄂爾多斯市等地區(qū)的牧民家中采集傳統方法 制作的傳統稀奶油或酸化奶油，用于乳酸菌的篩選。具體如下：
[0039] (I)將25g樣品在無菌條件下剪碎，溶于225mL無菌生理鹽水中，梯度稀釋后選擇 合適的稀釋度，取ImL稀釋液加入無菌平皿，傾注于20mLMRS固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)72h。
[0040] (2)選取菌落數量在15~150的平板，隨機選取符合乳酸菌菌落形態(tài)特征的菌落， 從中挑取少量細菌，溶于于MRS液體培養(yǎng)基中，并進行30°C培養(yǎng)4她。
[0041] (3)將分離到的菌株在MRS固體培養(yǎng)基上反復劃線進行純化。
[0042] (4)將純化好的菌株均進行革蘭氏染色及過氧化氨酶實驗。
[0043] (5)將所有革蘭氏陽性、過氧化氨酶陰性、不形成芽抱的菌株（初步判斷為乳酸 菌）選出來，在其培養(yǎng)液中加入甘油，使甘油的最終濃度為30% (v/v)，膽藏于-80°C待用。
[0044] (6)將上述分離到暫定為乳酸菌的菌株分別在MRS液體培養(yǎng)基中活化3代后進行 鑒定實驗。
[0045] 2、嗜酸乳桿菌CGMCC10436的鑒定
[0046] (1)生理生化鑒定
[0047]W標準菌株嗜酸乳桿菌作為對照菌株，進行W下生理生化試驗=HzS試驗、甲基紅 試驗、石蕊牛乳試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗、巧樣酸鹽利用試驗、尿素分解試驗、硝 酸鹽降解試驗及乙偶姻產生試驗，選取與標準菌株嗜酸乳桿菌生理生化試驗相同的乳酸 困。 W48] 0)分子鑒定
[0049] 提取菌株基因組DNA，進行ieSrDNA測序，其核巧酸序列如序列表SeqIDNo1 所示，將本發(fā)明菌株的ISSrDNA序列與NCBI嗜酸乳桿菌的序列進行比對，本發(fā)明菌株的 IGSrDNA序列與Lactobacillusacido地ilus序列相似性達95 %W上，根據IGSrDNA序 列分析，該菌株被鑒定為嗜酸乳桿菌（Xactobacillusacido地ilus)，并且于2015年Ol 月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，微生物保藏號為CGMCC No. 10436,保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0050] 3、植物乳桿菌CGMCC9961的鑒定
[0051] (1)生理生化鑒定
[0052]W標準植物乳桿菌作為對照菌株，進行W下生理生化試驗=HzS試驗、甲基紅試驗、 石蕊牛乳試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗、巧樣酸鹽利用試驗、尿素分解試驗、硝酸鹽降 解試驗及乙偶姻產生試驗，選取與植物乳桿菌生理生化試驗相同的乳酸菌。 陽〇5引 似分子鑒定
[0054] 提取菌株基因組DNA，進行ieSrDNA測序，其核巧酸序列如序列表SeqIDNo2 所示，將本發(fā)明菌株的ISSrDNA序列與NCBI植物乳桿菌的序列進行比對，本發(fā)明菌株 的IGSrDNA序列與Lactobacillusplantarum序列相似性達95 %W上，根據IGSrDNA序 列分析，鑒定出，此菌株為嗜酸乳桿菌化actobacillusplantarum)。保藏編號為CGMCC NO. 9961，保藏日期為2014年11月13號，保藏單位均為中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中屯、（CGMCC)，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究 所。
[0055] (S)灌胃益生菌的準備
[0056]將嗜酸乳桿菌CGMCC10436和植物乳桿菌CGMCC9961分別培養(yǎng)14h，進行梯度平 板計數，根據嗜酸乳桿菌CGMCC10436和植物乳桿菌CGMCC9961每只小鼠所需的菌數均為 2XIO8CFU,分別取均穩(wěn)定期出的嗜酸乳桿菌CGMCC10436菌液ImU植物乳桿菌CGMCC9961 菌液0. 4mU離屯、取菌泥，然后分別重置于0.ImLPBS中，用于每只小鼠的益生菌灌胃劑量。
[0057](四）牛初乳生長因子粗提物的制備
[0058] 通過對牛初乳離屯、脫脂、酸沉酪蛋白、二次超濾、透析及冷凍干燥制得的牛初乳生 長因子粗提物；本發(fā)明所指的離屯、、超濾、透析、干燥等處理方法，可使用本領域普通技術人 員公知的任何方法，只要其能保持生長因子功效，優(yōu)選的話，離屯、通過4°C離屯、，干燥采用冷 凍干燥。
[0059](五）治療結腸炎的藥物的制備 W60] 牛初乳生長因子粗提物，灌胃劑量為5. 4mg/20g(牛初乳生長因子粗提物質量/小 鼠質量）；牛初乳生長因子粗提物的灌胃形式為，取出溶于0.ImL無菌PBS溶液中的嗜酸乳 桿菌、植物乳桿菌菌泥小管、混合，然后加入所述劑量的牛初乳生長因子粗提物。
[0061] (六）其他組小鼠的灌胃準備
[0062] 抗生素組小鼠灌胃藥物：抗生素的灌胃劑量為9. 2mg/20g(柳氮硫胺化晚粉質量/ 小鼠重量）；柳氮硫胺化晚的灌胃形式為，取出溶于0. 3mL無菌PBS溶液中，混合，然后4°C 保存，W備灌胃。
[0063] 兩菌組合組小鼠灌胃藥物：
[0064] 將市面上的嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌同上進行微生物的計數、離屯、等處理，分別 取處于穩(wěn)定期初的嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌各2 X IO8CFU，兩者混合，然后溶于0. 3mL的無 菌PBS溶液中，混合，然后4°C保存，W備灌胃。
[0065] 下面結合動物實驗對本發(fā)明的藥物做進一步的研究，W說明本發(fā)明的有效性。
[0066](一）結腸炎小鼠模型的制作及試驗設計
[0067] 將葡聚糖硫酸鋼值城溶于水瓶中，讓Ba化/c小鼠自由飲用8天，W誘發(fā)試驗性 結腸炎小鼠模型，然后W小鼠體重變化、表觀狀況、結腸長度、病理學等為指標，驗證小鼠結 腸炎模型是否建立成功。
[0068] 建模期間小鼠體重下降，且腸炎組小鼠表觀狀態(tài)不佳，具體表現在小鼠目光呆滯、 毛發(fā)暗沉卷曲，有弟毛現象；并且，腸炎組小鼠尾根處有血斑，說明小鼠有顯性便血現象； 解剖后的腸炎組小鼠結腸處有潰爛現象，腸道組織有發(fā)脈、濁化現象；而且，建模期間，腸炎 組小鼠結腸長度空白組小鼠結腸顯著縮短；并且，由肥染色圖可知，模型組小鼠結腸組織， 腸黏膜萎縮，黏膜表面純化，隱窩破壞。
[0069] 綜上所述，急性結腸炎模型建立成功，可進行下一步藥物治療試驗。
[0070] (二）實驗結論 陽0川 （1)試驗說明
[0072] 治療期間，僅對腸炎空白組小鼠進行PBS灌胃，不進行治療，結果灌胃期間腸炎空 白組小鼠死亡11只；一方面說明結腸炎模型建立成功，另外一方面說明結腸炎小鼠不能 靠自我修復得W痊愈；所W，后續(xù)的對比，均為橫向對比，即同組前后的對比，小鼠治療后與 治療前的對比。
[0073] (2)本發(fā)明的藥物明顯改善小鼠表觀狀態(tài)
[0074] 兩個療程的灌胃結束后，本發(fā)明藥物組小鼠目光聚神、行動活躍，且小鼠毛發(fā)順 滑、亮白，與腸炎時的表觀狀態(tài)相比，差異極明顯，并與兩菌組合組及單獨牛初乳生長因子 組相比，小鼠表觀狀態(tài)明顯變好；而與抗生素組小鼠表觀狀態(tài)相比，差異不顯著。說明本發(fā) 明的藥物（益生菌聯合牛初乳生長因子）對治療結腸炎有很好的作用，且短期內無復發(fā)跡 象。
[0075] (3)本發(fā)明的藥物增長小鼠結腸長度
[0076] 表1治療期間小鼠結腸長度變化表
[007引從表1可W看出，兩個療程后，本發(fā)明的藥物可顯著增長小鼠的結腸組織，顯著優(yōu) 于兩菌組合組和牛初乳生長因子組，而與抗生素組小鼠結腸組織長度差異不大，說明兩個 療程的本發(fā)明藥物治療已將因結腸炎導致的結腸組織萎縮恢復至正常水平，因此，從小鼠 結腸長度角度來看，本發(fā)明的藥物可明顯增長小鼠結腸組織長度，增強腸道屏障作用。
[0079] (4)本發(fā)明的藥物明顯改善小鼠病理學情況
[0080] 將腸炎組、本發(fā)明藥物組（聯合組）、兩菌組合組、牛初乳生長因子組、抗生素組進 行對比，由圖1