37°C水浴中迅速解凍，細(xì)胞在無菌操作 臺(tái)中移入10ml無菌離心管中加6ml細(xì)胞培養(yǎng)基，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。棄去上清液， 沉淀中加入5~6ml細(xì)胞培養(yǎng)基，滴管吹打使其懸浮后移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37°C細(xì)胞培 養(yǎng)箱內(nèi)。②次日，自培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，棄去細(xì)胞瓶中細(xì)胞培養(yǎng)基，加入5~6ml細(xì)胞培養(yǎng) 基，置37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。③隔日，自培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，棄去細(xì)胞瓶中細(xì)胞培養(yǎng)基，加入 PBS(pH7. 4) 2~3ml晃動(dòng)清洗，倒掉PBS溶液后再重復(fù)一次清洗。在培養(yǎng)瓶中加入3~5滴 0. 25 %胰蛋白酶溶液晃動(dòng)均勻，加蓋置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)3分鐘左右，于顯微鏡下觀察 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自培養(yǎng)瓶壁上脫離，加細(xì)胞培養(yǎng)基2ml，滴管吹打使細(xì)胞完全脫離瓶壁后，分別移 入2個(gè)干凈培養(yǎng)瓶中，加入細(xì)胞培養(yǎng)基5~6ml吹打均勻，置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。④隔 日，重復(fù)③步驟。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，貼壁細(xì)胞不允許生長過密，懸浮細(xì)胞始終保持對(duì)數(shù)生 長期。
[0049] (2)樣品及對(duì)照品制備：稱取適量薏苡仁油樣品溶解于DMS0中，得到濃度為10mg/ ml的溶液。再用PBS作梯度稀釋，得到濃度 10mg/ml、5000μg/ml、2500μg/ml、1250μg/ml、 625μg/ml、312. 5μg/ml的稀釋樣品。
[0050] (3)將稀釋好的樣品加入平底96孔板中，每孔10μ1，每點(diǎn)作兩個(gè)平行測試。將 DMS0相應(yīng)作梯度稀釋后加入板中，作為對(duì)照。
[0051] (4)取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化并洗滌后懸浮于含10%小牛血清 的培養(yǎng)基中，經(jīng)苔盼藍(lán)染色排除法計(jì)活細(xì)胞數(shù)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮液密度至2X105個(gè)細(xì)胞/ ml〇
[0052] (5)將加入細(xì)胞的平底96孔板在37°C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。
[0053] (6)每孔中加入20μ1的5mg/mlMTT溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中保溫3~4小時(shí)。
[0054] (7)每孔加入100μ1溶解液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中保溫過夜，使生成的甲臢晶體充分 溶解。測定570nm光吸收值。
[0055] (8)根據(jù)光吸收值計(jì)算各樣品濃度組的細(xì)胞生長抑制率。計(jì)算公式如下：
[0056] (1 -實(shí)驗(yàn)孔平均光吸收值/對(duì)照孔平均光吸收值）X100%
[0057] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0058]表1不同濃度樣品對(duì)8種細(xì)胞株的生長抑制率（％ )
[0059]
[0060] 表2樣品在體外對(duì)8種細(xì)胞株的IC5。（μg/ml)
[0061]
[0062] 4、結(jié)論
[0063] 不同濃度的本發(fā)明薏苡仁油在體外對(duì)上述8種人腫瘤細(xì)胞株有不同程度的抑制 作用。
[0064] 通過試驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明所述的薏苡仁油及其制劑均能夠達(dá)到上述試驗(yàn)例所述的效 果。
[0065] 本發(fā)明通過以下具體的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為本發(fā)明的限制。
【具體實(shí)施方式】
[0066] 實(shí)施例1薏苡仁油的制備
[0067] 超臨界二氧化碳萃取：取薏苡仁粉碎成60目，采用600LX2超臨界C02萃取器萃 取，將薏苡仁粉裝入萃取釜，用夾套循環(huán)熱水加熱C02預(yù)熱器、萃取釜和分離柱，使萃取溫度 和分離溫度分別達(dá)到40°C和45°C，保持一級(jí)解析釜和二級(jí)解析釜出口溫度分別為50°C和 35°C;液態(tài)C02以2t/h的流量經(jīng)高壓泵加壓進(jìn)入C02預(yù)熱器，成為超臨界狀態(tài)下的流體，進(jìn) 入萃取釜，保持壓力20Mpa，萃取薏苡仁油；溶有薏苡仁油的C(V流體進(jìn)入分離柱，控制分離 柱壓力7Mpa，分離得到薏苡仁油；從分離柱出來的C02氣體先后進(jìn)入一級(jí)、二級(jí)解析釜，分 別保持壓力為7Mpa和6Mpa，棄去解析得到的水分等雜質(zhì)，C02氣體經(jīng)冷凝器變成液態(tài)C02， 循環(huán)使用，連續(xù)萃取2. 5h，得到薏苡仁油；
[0068] 精制：取超臨界C02萃取得到的薏苡仁油，加入油重量60%的60°C石油醚，再根據(jù) 酸值，加入油重45%的2%NaOH溶液，攪拌lOmin后，靜置20h后，除去下層皂腳，取上層用 純化水進(jìn)行水洗，靜置22h后，除去下層廢水；取上層進(jìn)行第二次水洗，靜置46h后，除去下 層廢水；取上層加油重80 %丙酮破乳，靜置3h后，除去下層廢丙酮；取上層油溶液，加入油 重5%的經(jīng)活化的中性氧化鋁，攪拌30min后，過濾；濾液加熱后，加入油重4%經(jīng)活化的高 嶺土，攪拌，在45°C下保溫30min，過濾；濾液減壓回收溶劑后，再加純化水進(jìn)行水洗，靜置 lh后，除去下層廢水；上層油在充氮條件下，加熱減壓干燥，再加油重10%經(jīng)活化的中性氧 化鋁，攪拌，置冷處靜置，過濾，過濾后的油在充氮條件下，加熱減壓濃縮，再經(jīng)165°C減壓干 熱滅菌1. 5h，冷卻后經(jīng)0. 2μm微孔濾膜過濾，分裝于500ml玻璃輸液瓶中，充氮，密封，即得 薏苡仁油，收率4. 5%;測定其理化常數(shù)為：20°C時(shí)相對(duì)密度0. 915, 20°C時(shí)折光率1. 471，酸 值0. 18,碘值102,皂化值190。
[0069] 實(shí)施例2薏苡仁油的制備
[0070] 超臨界二氧化碳萃?。喝∞曹尤史鬯槌?0目，采用600LX2超臨界C02萃取器萃 取，將薏苡仁粉裝入萃取釜，用夾套循環(huán)熱水加熱C02預(yù)熱器、萃取釜和分離柱，使萃取溫度 和分離溫度分別達(dá)到40°C和40°C，保持一級(jí)解析釜和二級(jí)解析釜出口溫度分別為20°C和 15°C;液態(tài)C02以lt/h的流量經(jīng)高壓泵加壓進(jìn)入C02預(yù)熱器，成為超臨界狀態(tài)下的流體，進(jìn) 入萃取釜，保持壓力22Mpa，萃取薏苡仁油；溶有薏苡仁油的C(V流體進(jìn)入分離柱，控制分離 柱壓力8Mpa，分離得到薏苡仁油；從分離柱出來的C02氣體先后進(jìn)入一級(jí)、二級(jí)解析釜，分 別保持壓力為6Mpa和5Mpa，棄去解析得到的水分等雜質(zhì)，C02氣體經(jīng)冷凝器變成液態(tài)C02， 循環(huán)使用，連續(xù)萃取2h，得到薏苡仁油；
[0071] 精制：取超臨界C02萃取得到的薏苡仁油，加入油重量60%的90°C石油醚，再根據(jù) 酸值，加入油重56%的2%NaOH溶液，攪拌lOmin后，靜置22h后，除去下層皂腳，取上層用 純化水進(jìn)行水洗，靜置20h后，除去下層廢水；取上層進(jìn)行第二次水洗，靜置48h后，除去下 層廢水；取上層加油重90 %丙酮破乳，靜置2h后，除去下層廢丙酮；取上層油溶液，加入油 重8%的經(jīng)活化的中性氧化鋁，攪拌30min后，過濾；濾液加熱后，加入油重6%經(jīng)活化的高 嶺土，攪拌，在42°C下保溫30min，過濾；濾液減壓回收溶劑后，再加純化水進(jìn)行水洗，靜置 2h后，除去下層廢水；上層油在充氮條件下，加熱減壓干燥，再加油重8%經(jīng)活化的中性氧 化鋁，攪拌，置冷處靜置，過濾，過濾后的油在充氮條件下，加熱減壓濃縮，再經(jīng)170°C減壓干 熱滅菌1. 5h，冷卻后經(jīng)0. 2μm微孔濾膜過濾，分裝于500ml玻璃輸液瓶中，充氮，密封，即得 薏苡仁油，收率4. 9%;測定其理化常數(shù)為：20°C時(shí)相對(duì)密度0. 920, 20°C時(shí)折光率1. 473,酸 值0. 19,碘值104,皂化值186。
[0072] 實(shí)施例3薏苡仁油的制備
[0073] 超臨界二氧化碳萃?。喝∞曹尤史鬯槌?0目，采用600LX2超臨界C02萃取器萃 取，將薏苡仁粉裝入萃取釜，用夾套循環(huán)熱水加熱C02預(yù)熱器、萃取釜和分離柱，使萃取溫度 和分離溫度分別達(dá)到33°C和39°C，保持一級(jí)解析釜和二級(jí)解析釜出口溫度分別為30°C和 20°C;液態(tài)C02以3t/h的流量經(jīng)高壓泵加壓進(jìn)入C02預(yù)熱器，成為超臨界狀態(tài)下的流體，進(jìn) 入萃取釜，保持壓力19Mpa，萃取薏苡仁油；溶有薏苡仁油的C(V流體進(jìn)入分離柱，控制分離 柱壓力9Mpa，分離得到薏苡仁油；從分離柱出來的C02氣體先后進(jìn)入一級(jí)、二級(jí)解析釜，分 別保持壓力為5Mpa和4Mpa，棄去解析得到的水分等雜質(zhì)，C02氣體經(jīng)冷凝器變成液態(tài)C02， 循環(huán)使用，連續(xù)萃取3h，得到薏苡仁油；
[0074] 精制：取超臨界C02萃取得到的薏苡仁油，加入油重量60%的80°C石油醚，再根據(jù) 酸值，加入油重36%的2%NaOH溶液，攪拌lOmin后，靜置18h后，除去下層皂腳，取上層用 純化水進(jìn)行水洗，靜置18h后，除去下層廢水；取上層進(jìn)行第二次水洗，靜置42h后，除去下 層廢水；取上層加油重75 %丙酮破乳，靜置2h后，除去下層廢丙酮；取上層油溶液，加入油 重3%的經(jīng)活化的中性氧化鋁，攪拌30min后，過濾；濾液加熱后，加入油重2%經(jīng)活化的高 嶺土，攪拌，在47°C下保溫30min，過濾；濾液減壓回收溶劑后，再加純化水進(jìn)行水洗，靜置 lh后，除去下層廢水；上層油在充氮條件下，加熱減壓干燥，再加油重12%經(jīng)活化的中性氧 化鋁，攪拌，置冷處靜置，過濾，過濾后的油在充氮條件下，加熱減壓濃縮，再經(jīng)160°C減壓干 熱滅菌2h，冷卻后經(jīng)0. 2μm微孔濾膜過濾，分裝于500ml玻璃輸液瓶中，充氮，密封，即得薏 苡仁油，收率4. 7%;測定其理化常數(shù)為：20°C時(shí)相對(duì)密度0. 918, 20°C時(shí)折光率1. 474,酸值 0. 15,碘值100,皂化值194。
[0075] 實(shí)施例4薏苡仁油的制備
[0076] 超臨界二氧化碳萃取：取薏苡仁粉碎成50目，采用600LX2超臨界C02萃取器萃 取，將薏苡仁粉裝入萃取釜，用夾套循環(huán)熱水加熱C02預(yù)熱器、萃取釜和分離柱，使萃取溫度 和分離溫度分別達(dá)到35°C和42°C，保持一級(jí)解析釜和二級(jí)解析釜出口溫度分別為40°C和 30°C;液態(tài)C02以1. 5t/h的流量經(jīng)高壓泵加壓進(jìn)入C02預(yù)熱器，成為超臨界狀態(tài)下的流體， 進(jìn)入萃取釜，保持壓力21Mpa，萃取薏苡仁油；溶有薏苡仁油的C02流體進(jìn)入分離柱，控制分 離柱壓力lOMpa，分離得到薏苡仁油；從分離柱出來的C02氣體先后進(jìn)入一級(jí)、二級(jí)解析釜， 分別保持壓力為7Mpa和5Mpa，棄去解析得到的水分等雜質(zhì)，C02氣體經(jīng)冷凝器變成液態(tài)C02， 循環(huán)使用，連續(xù)萃取2h，得到薏苡仁油；
[0077] 精制：取超臨界C02萃取得到的薏苡仁油，加入油重量60%的70°C石油醚，再根據(jù) 酸值，加入油重50%的2%NaOH溶液，攪拌lOmin后，靜置19h后，除去下層皂腳，取上層用 純化水進(jìn)行水洗，靜置21h后，除去下層廢水；取上層進(jìn)行第二次水洗，靜置50h后，除去下 層廢水；取上層加油重85 %丙酮破乳，靜置4h后，除去下層廢丙酮；取上層油溶液，加入油 重6%的經(jīng)活化的中性氧化鋁，攪拌30min后，過濾；濾液加熱后，加入油重5%經(jīng)活化的高 嶺土，攪拌，在50°C下保溫30min，過濾；濾液減壓回收溶劑后，再加純化水進(jìn)行水洗，靜置 lh后，除去下層廢水；上層油在充氮條件下，加熱減壓干燥，再加油重11 %經(jīng)活化的中性氧 化鋁，攪拌，置冷處靜置，過濾，過濾后的油在充氮條件下，加熱減壓濃縮，再經(jīng)162°C減壓干 熱滅菌2h，冷卻后經(jīng)0. 2μm微孔濾膜過濾，分裝于500ml玻璃輸液瓶中，充氮，密封，即得薏 苡仁油，收率4. 0%;測定其理化常數(shù)為：20°C時(shí)相對(duì)密度0. 920, 20°C時(shí)折光率1. 471，酸值 0. 16,碘值105,皂化值192。
[0078]實(shí)施例5薏苡仁油的制備
[0079]超臨界二氧化碳萃取：取薏苡仁粉碎成30目，采用600LX2超臨界C02萃取器萃 取，將薏苡仁粉裝入萃取釜，用夾套循環(huán)熱水加熱C02預(yù)熱器、萃取釜和分離柱，使萃取溫度 和分離溫度分別達(dá)到42°C和45°C，保持一級(jí)解析釜和二級(jí)解析釜出口溫度分別為35°C和 25°C;液態(tài)C02以2. 5t/h的流量經(jīng)高壓泵加壓進(jìn)入C02預(yù)熱器，成為超臨界狀態(tài)下的流體， 進(jìn)入萃取釜，保持壓力23Mpa，萃取薏苡仁油；溶有薏苡仁油的0)2流體進(jìn)入分離柱，控制分 離柱壓力8Mpa，分離得到薏苡仁油；從分離柱出來的C02氣體先后進(jìn)入一級(jí)、二級(jí)解析釜， 分別保持壓力為6Mpa和4Mpa，棄去解析得到的水分等雜質(zhì)，C02氣體經(jīng)冷凝器變成液態(tài)C02， 循環(huán)使用，連續(xù)萃取2. 5h，得到薏苡仁油；
[0080] 精制：取超臨界C02萃取得到的薏苡仁油，加入油重量60%的80°C石油醚，再根 據(jù)酸值，加入油重40%的2%NaOH溶液，攪拌lOmin后，靜置24h后，除去下層皂腳，取上 層用純化水進(jìn)行水洗，靜置24h后，除去下層廢水；取上層進(jìn)行第二次水洗，靜置44h后，除 去下層廢水；取上層加油重70 %丙酮破乳，靜置3h后，除去下層廢丙酮；取上層油溶液，加 入油重4%的經(jīng)活化的中性氧化鋁，攪拌30min后，過濾；濾液加熱后，加入油重3%經(jīng)活化 的高嶺土，攪拌，在40°C下保溫30min，過濾；濾液減壓回收溶劑后，再加純化水進(jìn)行水洗， 靜置1. 5h后，除去下層廢水；上層油在充氮條件下，加熱減壓干燥，再加油重9%經(jīng)活化的 中性氧化鋁，攪拌，置冷處靜置，過濾，過濾后的油在充氮條件下，加熱減壓濃縮，再經(jīng)165°C 減壓干熱滅菌1. 5h，冷卻后經(jīng)0. 2μm微孔濾膜過濾，分裝于500ml玻璃輸液瓶中，充氮，密 封，即得；薏苡仁油，收率4. 3% ;測定其理化常數(shù)為：20°C時(shí)相對(duì)密度0. 916, 20°C時(shí)折光率 1.473,酸值0. 14,碘值101，皂化值192。
[0081] 實(shí)施例6
[0082] 薏該仁油8000mg加入10ml正己燒超聲溶解，再用流動(dòng)相丙酮配制成50mg/mL的 薏苡仁油溶液。利用CHEETAH-HP100高效液相制備色譜儀進(jìn)行分離；流動(dòng)相：正己烷：丙 酮=94:6(v/v);每次分離進(jìn)樣量：15ml;色譜柱：VenusilXBPsilica(20*250mm，10ym); 流速：18mL/min;ELSD檢測器：漂移管溫度45°C，載氣流速2.OL/min。收集保留時(shí)間為 15. 8min的色譜峰流分，接收液于30°C下減壓濃縮后轉(zhuǎn)移到10ml樣品瓶中氮?dú)馐覝叵碌獨(dú)?吹干，即得1，3-二油酸甘油二酯。
[0083] 室溫下，無色油狀物；
[0084]Q-T0F/MS:準(zhǔn)分子離子峰[M+Na]+ =m/z643. 5277(Calcd. = 643. 5272， C39H7205Na)，不飽和度=4，
[0085] 蟲NMR譜和13CNMR譜見表3。
[0086]表 3 4NMR和13CNMR譜數(shù)據(jù)（CDC13)
[0087]
[0089] 實(shí)施例7
[0090] 薏該仁油8000mg加入10ml正己燒超聲溶解，再用流動(dòng)相丙酮配制成50mg/mL的 薏苡仁油溶液。利用CHEETAH-HP100高效液相制備色譜儀進(jìn)行分離；流動(dòng)相：正己烷：丙酮 = 94:6(v/v);每次分離進(jìn)樣量：15ml;色譜柱：VenusilXBPsilica(20*250mm，10ym);流 速：18mL/min。ELSD檢測器：漂移管溫度45°C，載氣流速2.OL/min。收集保留時(shí)間為17min 的色譜峰流分，接收液于30°C下減壓濃縮后轉(zhuǎn)移到10ml樣品瓶中氮?dú)馐覝叵碌獨(dú)獯蹈桑?得1-亞油酸-3-油酸甘油二酯。
[0091] 室溫下，無色油狀物；
[0092]Q-T0F/MS:準(zhǔn)分子離子峰[M+Na]+ =m/z641. 5121(Calcd. = 641.5115， C39H7Q05Na)，不飽和度=5 ;
[0093] 蟲NMR譜和13CNMR譜見表4。
[0094]表 4 4NMR和13CNMR譜數(shù)據(jù)（CDC13)
[0095]
[0096] 實(shí)施例8
[0097] 薏該仁油8000mg加入10ml正己燒超聲溶解，再用流動(dòng)相丙酮配制成50mg/mL的 薏苡仁油溶液。利用CHEETAH-HP100高效液相制備色譜儀進(jìn)行分離；流動(dòng)相：正己烷：丙酮 = 94:6(v/v);每次分離進(jìn)樣量：15ml;色譜柱：VenusilXBPsilica(20*250mm，10ym);流 速：18mL/min。ELSD檢測器：漂移管溫度45°C，載氣流速2.OL/min。收集保留時(shí)間為23min 的色譜峰流分，接收液于30°C下減壓濃縮后轉(zhuǎn)移到10ml樣品瓶中氮?dú)馐覝叵碌獨(dú)獯蹈桑?得1，2_二油酸甘油二酯。
[0098] 室溫下，無色油狀物；
[0099] Q-T0F/MS:準(zhǔn)分子離子峰[M+Na]+ =m/z643.5277 (Calcd.= 643.5272,C39H