含有16種甘油酯的薏苡仁油、制劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種薏苡仁油、制劑、制備方法及其 在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 薏該仁是禾本科薏該屬植物薏該Coixlacryma-jobiL.varma-yuen(Roman.) Stapf的成熟干燥種仁，為利水滲濕藥，很久以來(lái)為藥食兩用品種。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)薏苡仁具 有鎮(zhèn)痛抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗?jié)?、降血脂和減肥等藥理作用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)TLC、 HPLC-MS、GC等方法對(duì)薏苡仁的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其含有多種活性成分，主要包括 薏苡仁酯、甘油三酯類(lèi)、脂肪酸類(lèi)、內(nèi)酰胺類(lèi)、薏苡仁內(nèi)酯、糖類(lèi)、留醇類(lèi)、三萜類(lèi)等化合物。 其中，酯類(lèi)是首先被發(fā)現(xiàn)的具有抗腫瘤活性的成分，也是報(bào)道最多最受關(guān)注的化學(xué)成分。雖 然目前在中國(guó)臨床上以薏苡仁油為有效成分的康萊特注射劑已得到普遍應(yīng)用，但其使用的 薏苡仁油成分較復(fù)雜，除含有甘油三酯成分外，還含有甘油一酯、甘油二酯以及脂肪酸酯 等，這必然會(huì)使實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量控制和臨床用藥安全面臨很大的挑戰(zhàn)。
[0003] 本發(fā)明以薏苡仁粉為原料，采用超臨界二氧化碳萃取、堿化、中性氧化鋁和高嶺土 純化等步驟，得到了一種薏苡仁油有效部位；通過(guò)對(duì)其活性成分的分離與鑒定，確定了其組 成主要為十一種甘油三酯成分和五種甘油二酯成分；并進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行理化常數(shù)的檢測(cè)， 確定了其最優(yōu)酸值、碘值、皂化值、折光率和相對(duì)密度等。采用本發(fā)明所述薏苡仁油用藥，成 分及組成確定，保證了工業(yè)生產(chǎn)中各批次成品質(zhì)量的穩(wěn)定性，也避免了因直接采用薏苡仁 粗油入藥因成分復(fù)雜不清而導(dǎo)致的毒副反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種從薏苡仁中提取的薏苡仁油，其特征在于：該薏苡仁 油中含有如下質(zhì)量百分含量的5種甘油二酯類(lèi)成分和11種甘油三酯類(lèi)成分：1，3-二油酸 甘油二酯〇. 40~0. 58%、1-亞油酸-3-油酸甘油二酯0. 91~1. 31 %、1，2-二油酸甘油 二酯0. 24~0. 35%、1-油酸-2-亞油酸甘油二酯0. 66~0. 95%、1，2-二亞油酸甘油酯 0. 33~0. 47%、三亞油酸甘油酯4. 87~6. 99%、1-油酸-2, 3-二亞油酸甘油酯13. 00~ 18. 69 %、1-棕櫚酸-2, 3-二亞油酸甘油酯5. 25~7. 54%、1，3-二油酸-2-亞油酸甘油酯 13. 23~19. 02 %、1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘油酯10. 26~14. 75 %、1，3_二棕櫚 酸-2-亞油酸甘油酯2. 28~3. 28%、三油酸甘油酯14. 44~20. 76%、1-棕櫚酸-2, 3-二 油酸甘油酯8. 06~11. 58 %、1-油酸-2-亞油酸-3-硬脂酸甘油酯1. 37~1. 97 %、1，3-二 棕櫚酸-2-油酸甘油酯1. 52~2. 19 %和1，2-二油酸-3-硬脂酸甘油酯1. 29~1. 86%。
[0005] 優(yōu)選的，上述5種甘油二酯成分和11種甘油三酯成分的質(zhì)量百分含量為：1，3_二 油酸甘油二酯〇. 45~0. 55%、1-亞油酸-3-油酸甘油二酯1. 03~1. 25%、1，2-二油酸甘 油二酯0. 27~0. 33%、1-油酸-2-亞油酸甘油二酯0. 75~0. 91%、1，2-二亞油酸甘油 酯0. 37~0. 45%、三亞油酸甘油酯5. 47-6. 69%、1-油酸-2, 3-二亞油酸甘油酯14. 63~ 17. 88%、1-棕櫚酸-2, 3-二亞油酸甘油酯5. 9~7. 21 %、1，3-二油酸-2-亞油酸甘油酯 14. 88~18. 19%、1_棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘油酯1L 55~14 11 %、1，3-二棕櫚 酸-2-亞油酸甘油酯2. 57~3. 14%、三油酸甘油酯16. 25~19. 86%、1-棕櫚酸-2, 3-二 油酸甘油酯9. 07~11. 08%、1-油酸-2-亞油酸-3-硬脂酸甘油酯1. 54~1. 88%、1，3-二 棕櫚酸-2-油酸甘油酯1. 71~2. 09%和1，2-二油酸-3-硬脂酸甘油酯1. 45~1. 78% ;
[0006] 更優(yōu)選的，上述5種甘油二酯成分和11種甘油三酯成分的質(zhì)量百分含量為： 1，3-二油酸甘油二酯0· 49~0· 51 %、1-亞油酸-3-油酸甘油二酯1. 12~1. 16 %、1，2-二 油酸甘油二酯〇. 29~0. 31 %、1-油酸-2-亞油酸甘油二酯0. 81~0. 85%、1，2-二亞油 酸甘油酯0. 40~0. 42%、三亞油酸甘油酯5. 96~6. 20%、1-油酸-2, 3-二亞油酸甘油酯 15. 93~16. 58%、1_棕櫚酸-2, 3-二亞油酸甘油酯6.43~6.69%、1，3-二油酸-2-亞油酸 甘油酯16. 20~16. 87%、1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘油酯12. 57~13. 09%、1，3-二棕 櫚酸-2-亞油酸甘油酯2. 79~2. 91%、三油酸甘油酯17. 69~18. 42%、1-棕櫚酸-2, 3-二 油酸甘油酯9. 87~10. 27%、1-油酸-2-亞油酸-3-硬脂酸甘油酯1. 68~1. 74%、1，3-二 棕櫚酸-2-油酸甘油酯1. 86~1. 94%和1，2-二油酸-3-硬脂酸甘油酯1. 58~1. 65%。
[0007] 上述含量均指甘油二酯或甘油三酯化合物在薏苡仁油中的質(zhì)量百分含量，以本發(fā) 明所述方法制備得到的薏苡仁油為原料，經(jīng)過(guò)制備色譜分離得到5個(gè)甘油二酯單體化合物 和11個(gè)甘油三酯單體化合物，稱(chēng)重、計(jì)算而得。也可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)分析方法得出。
[0008] 其中，所述薏苡仁油按脂肪油檢測(cè)理化常數(shù)為：20°C時(shí)相對(duì)密度0. 916~0. 920， 20°C時(shí)折光率1. 471~1. 474,酸值〈0·2,碘值100~106,皂化值186~195 ;
[0009] 本發(fā)明所述的薏苡仁油是通過(guò)如下方法獲得的：
[0010] 超臨界二氧化碳萃?。喝∞曹尤史鬯槌?0目~80目，采用600LX2超臨界C02萃 取器萃取，將薏苡仁粉裝入萃取釜，用夾套循環(huán)熱水加熱C02預(yù)熱器、萃取釜和分離柱，使萃 取溫度和分離溫度分別達(dá)到33~45°C和30~45°C，保持一級(jí)解析釜和二級(jí)解析釜出口溫 度分別為20~50°C和15~35°C;液態(tài)C02以1~3t/h的流量經(jīng)高壓泵加壓進(jìn)入C02預(yù)熱 器，成為超臨界狀態(tài)下的流體，進(jìn)入萃取釜，保持壓力19~23Mpa，萃取薏苡仁油；溶有薏苡 仁油的C(V流體進(jìn)入分離柱，控制分離柱壓力7~lOMpa，分離得到薏苡仁油；從分離柱出來(lái) 的C02氣體先后進(jìn)入一級(jí)、二級(jí)解析釜，分別保持壓力為5~7Mpa和4~6Mpa，棄去解析得 到的水分等雜質(zhì)，C02氣體經(jīng)冷凝器變成液態(tài)C02，循環(huán)使用，連續(xù)萃取2~3h，得到薏苡仁 油；
[0011] 精制：取超臨界C02萃取得到的薏苡仁油，加入油重量60%的60°C~90°C石油醚， 再根據(jù)酸值，加入油重36%~56%的2%NaOH溶液，攪拌lOmin后，靜置18~24h后，除 去下層皂腳，取上層用純化水進(jìn)行水洗，靜置18~24h后，除去下層廢水；取上層進(jìn)行第二 次水洗，靜置40~50h后，除去下層廢水；取上層加油重70%~90%丙酮破乳，靜置2~ 4h后，除去下層廢丙酮；取上層油溶液，加入油重3 %~8 %的經(jīng)活化的中性氧化鋁，攪拌 30min后，過(guò)濾；濾液加熱后，加入油重2%~6%高嶺土，攪拌，在40~50°C下保溫30min， 過(guò)濾；濾液減壓回收溶劑后，再加純化水進(jìn)行水洗，靜置1~2h后，除去下層廢水；上層油 在充氮條件下，加熱減壓干燥，再加油重8%~12%經(jīng)活化的中性氧化鋁，攪拌，置冷處?kù)o 置，過(guò)濾，過(guò)濾后的油在充氮條件下，加熱減壓濃縮，再經(jīng)160~170°C減壓干熱滅菌1~ 2h，冷卻后經(jīng)0. 2μm微孔濾膜過(guò)濾，分裝于500ml玻璃輸液瓶中，充氮，密封，即得；
[0012] 優(yōu)選地，所述精制步驟如下：
[0013] 取超臨界C02萃取得到的薏苡仁油，加入油重量60%的60°C~90°C石油醚，再根 據(jù)酸值，加入油重36 %~56 %的2 %NaOH溶液，攪拌lOmin后，靜置20h后，除去下層皂腳， 取上層用純化水進(jìn)行水洗，靜置22h后，除去下層廢水；取上層進(jìn)行第二次水洗，靜置46h 后，除去下層廢水；取上層加油重70%~90%丙酮破乳，靜置3h后，除去下層廢丙酮；取上 層油溶液，加入油重5%的經(jīng)活化的中性氧化鋁，攪拌30min后，過(guò)濾；濾液加熱后，加入油 重4%經(jīng)活化的高嶺土，攪拌，在40~50°C下保溫30min，過(guò)濾；濾液減壓回收溶劑后，再加 純化水進(jìn)行水洗，靜置lh后，除去下層廢水；上層油在充氮條件下，加熱減壓干燥，再加油 重8%~12%經(jīng)活化的中性氧化鋁，攪拌，置冷處?kù)o置，過(guò)濾，過(guò)濾后的油在充氮條件下，加 熱減壓濃縮，再經(jīng)160~170°C減壓干熱滅菌2h，冷卻后經(jīng)0. 2μm微孔濾膜過(guò)濾，分裝于 500ml玻璃輸液瓶中，充氮，密封，即得。
[0014] 本發(fā)明所述薏苡仁油為淡黃色的澄明液體，氣微、味淡；其在石油醚或三氯甲烷中 極易溶解，在丙酮中易溶、在乙醇中微溶，在水中不溶。
[0015] 按照本發(fā)明所述方法制備得到的薏苡仁油，依照中國(guó)藥典2010年版一部附錄方 法進(jìn)行檢測(cè)，其理化常數(shù)均為：20°C時(shí)相對(duì)密度0. 916~0. 920, 20°C時(shí)折光率1. 471~ 1. 474,酸值〈0. 2,碘值100~106,皂化值186~195。其中，藥典所述酸值系指中和脂肪、 脂肪油或其他類(lèi)似物質(zhì)1克中含有的游離脂肪酸所需氫氧化鉀的重量（毫克數(shù)）。在油脂 類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)量研究中，酸值是一個(gè)重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，就本申請(qǐng)所述薏苡仁油而言，其酸值均小 于0. 2,即通過(guò)對(duì)制備工藝中超臨界萃取參數(shù)和堿化等純化工藝的優(yōu)化，制備得到的薏苡仁 油具有如下優(yōu)點(diǎn)：一方面作為雜質(zhì)的游離脂肪酸含量極低，成品質(zhì)量較好；另一方面富集 了大量甘油二酯、甘油三酯類(lèi)活性成分，純度較高，并且其中甘油二酯和甘油三酯類(lèi)成分種 類(lèi)明確、含量穩(wěn)定。除此之外，其它理化常數(shù)，如皂化值、碘值等，多批次樣品測(cè)得該值變化 范圍均較小，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明所述薏苡仁油的質(zhì)量穩(wěn)定、臨床用藥更安全。本發(fā)明所述制 備方法收率高、成本低、產(chǎn)品穩(wěn)定，適于工業(yè)化生產(chǎn)，安全可控。
[0016] 本發(fā)明的又一目的在于提供一種含有薏苡仁油的藥物制劑，具體包括本發(fā)明所述 薏苡仁油及一種或幾種藥學(xué)上可接受的載體。
[0017] 其中，所述藥學(xué)上可接受的載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、乳 化劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑或抗氧化劑，必要時(shí)還可以 加入香味劑、甜味劑、防腐劑或著色劑。
[0018] 所述藥學(xué)上可接受的載體可以選自：甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫 代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、大豆磷脂、維生素C、維生素E、EDTA二鈉、EDTA 鈣鈉，一價(jià)堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯 化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、羥苯乙酯溶液、苯甲酸、山梨酸鉀、醋酸氯己定、木糖醇、麥芽糖、葡萄 糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻 酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二 醇、環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、磷脂類(lèi)材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣或硬脂酸鎂。
[0019] 所述藥物制劑可以是口服固體制劑、口服液體制劑或注射劑。
[0020] 優(yōu)選的，
[0021] 所述口服固體制劑選自膠囊劑、片劑、滴丸、顆粒劑、濃縮丸中的一種；所述口服液 體制劑選自水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑，或是一種在使用前可用水或其 它適宜的載體復(fù)配的干燥產(chǎn)品；所述注射劑選自納米混懸劑、脂質(zhì)體、乳劑、凍干粉針劑和 水針劑中的一種。
[0022] 更優(yōu)選的，
[0023] 所述注射劑包括如下成分：本發(fā)明所述薏苡仁油50~350g，注射用大豆磷脂或 可供注射用大豆磷脂10~40g，注射用甘油或可供注射用甘油15~50g，注射用水加至 1000ml〇
[0024] 其可通過(guò)如下方法制備：
[0025] 稱(chēng)取處方配制量的注射用大豆磷脂或可供注射用大豆磷脂，加適量的注射用水 后，用高剪切分散乳化機(jī)分散至無(wú)塊狀及顆粒狀固體，加入按配方量稱(chēng)取的注射用甘油或 可供注射用甘油，并加注射用水至規(guī)定量，攪拌均勻備用；
[0026] 另稱(chēng)取薏苡仁油，將稱(chēng)取的油酯與水相分別加熱至60~70°C后，置高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn) 行高壓乳化，乳化時(shí)均質(zhì)機(jī)低壓為5~12MPa，高壓為25~50MPa，再循環(huán)均質(zhì)3~6遍， 至2 μ m以下顆粒應(yīng)不少于95 %，5 μ m以上顆粒不得檢出，必要時(shí)用NaOH或HC1調(diào)節(jié)pH至 4. 8~8. 5,優(yōu)選6. 8~L 0,最優(yōu)選為6. 8 ;
[0027] 將制得均勻乳劑氮?dú)饧訅和ㄟ^(guò)小于等于3 μ m的微孔濾芯過(guò)濾器過(guò)濾，充氮灌裝 滅菌，冷卻即得。
[0028] 所述膠囊劑包括如下成分：薏苡仁油200~800g，抗氧化劑和/或乳化劑0. 20~ 0. 60g，制成1000粒。
[0029] 其可通過(guò)如下方法制備：
[0030] 膠液配制：按重量比為1:0. 6~1. 2:0. 3~0. 8:0. 0001~0. 01稱(chēng)取適量明膠、純 化水、甘油和防腐劑；依次將甘油、純化水、防腐劑（選自10%羥苯乙酯溶液、苯甲酸、山梨 酸鉀和醋酸氯己定中的一種）加入化膠罐內(nèi)，加熱至70°C~90°C后，再加入明膠不斷攪拌、 抽真空，直至明膠完全溶解，將膠液過(guò)濾，在56 °C~62 °C下存放，備用；
[0031] 藥液配制：將配方量的薏苡仁油、抗氧化劑和/或乳化劑（抗氧化劑為維生素E， 乳化劑為吐溫80)加入配料罐內(nèi)，不斷攪拌，直至混合均勻；
[0032] 壓膠囊：根據(jù)膠囊大小選擇合適的壓丸模具，在15°C~30°C、相對(duì)濕度小于35% 條件下進(jìn)行壓丸定型后干燥，剔除大小丸，再用95%藥用乙醇洗丸后，繼續(xù)干燥至含水量小 于12%，目檢剔除不合格膠囊，印字，包裝即得。
[0033] 本發(fā)明通過(guò)藥效實(shí)驗(yàn)表明，所述藥物組合物及其制劑對(duì)多種人腫瘤細(xì)胞株均有不 同程度的抑制作用，可作為治療腫瘤疾病藥物。
[0034] 因此，本發(fā)明的目的還在于提供一種上述藥物組合物、藥物制劑在制備抗腫瘤藥 物中的應(yīng)用。
[0035] 其中，所述腫瘤是指早期、中期或晚期的肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌或 乳腺癌。
[0036] 以下通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明本發(fā)明所述組合物及其制劑在抗腫瘤方面的有益效果。
[0037] -、體外MTT法測(cè)定薏苡仁油及其制劑對(duì)8種人腫瘤細(xì)胞株的抑制作用
[0038] 1、實(shí)驗(yàn)材料及配制
[0039](1)細(xì)胞株：PANC_1 (人胰腺癌細(xì)胞）、SK0V3 (人卵巢癌細(xì)胞）、MCF_7(人乳腺癌細(xì) 胞）、Bcap-37 (人乳腺癌細(xì)胞）、SMMC-7721 (人肝癌細(xì)胞）、H印G-2 (人肝癌細(xì)胞）、A549 (人 肺癌細(xì)胞）、H460 (人肺癌細(xì)胞），上述細(xì)胞株由上海醫(yī)藥工業(yè)研究藥理評(píng)價(jià)研究中心保存， 傳代維持。
[0040] (2)01^1完全培養(yǎng)基：添加10%新生牛血清（6四0)81^)、雙抗。
[0041] (3)0. 25%胰蛋白酶溶液（Trypsin):購(gòu)自Invitrogen公司，-20°C保存。
[0042] (4)磷酸緩沖液（PBS) :NaC18g，KC10. 2g，Na2HP04l. 15g，ΚΗ2Ρ040· 2g，溶于 1L雙蒸 水，121°C高壓消毒20min，4°C保存。
[0043] (5)MTT(AMRESC0)溶液：用PBS配成 5mg/ml溶液。
[0044] (6)溶解液：每100ml去離子雙蒸水含SDSlOg，異丁醇5ml，濃鹽酸0· 1ml。
[0045] 2、實(shí)驗(yàn)方法
[0046] 樣品對(duì)上述細(xì)胞株的抑制作用通過(guò)MTT法測(cè)得。
[0047] 具體步驟如下：
[0048] (1)細(xì)胞培養(yǎng)：①將細(xì)胞從液氮中取出，在