所得結(jié)果如圖1所示。
[0041] 將經(jīng)過單體化處理后的APSD-PBS稀釋至50yM，分裝于EP管中，加入不同濃度 不同種類的黃酮類藥物（式I所示化合物、DMSO或剛果紅（CongoRed))，混勻后置于37°C 進行孵育，在不同的孵育時間段后取樣品進行western-blot、dot-blot、AFM和TEM的體外 實驗檢測。細胞水平實驗根據(jù)實驗需要，AP單獨或AP和黃酮類藥物共同孵育樣品經(jīng)細 胞生長培養(yǎng)基稀釋后進行體外孵育，后加入細胞中進行培養(yǎng)，檢測細胞毒性及細胞凋亡。
[0042] 2.樣品孵育聚集體制備
[0043] 由圖2可知，式I所示化合物（ImM)與AP (50 yM)單體37°C孵育24h后進行WB 檢測，與對照組DMSO和剛果紅相比，式I所示化合物能夠明顯促進AP由單體向分子量為 62kDa至250kDa的多聚體的聚集，并抑制A P由單體向分子量為8kDa至56kDa的寡聚體的 聚集。
[0044] 將不同濃度的式I所示化合物與A(50yM)于37°C孵育24h，WB檢測聚集效果， DMSO和CongoRed作為對照，所得結(jié)果如圖3所示，圖中未標示檢測樣品的均為式I所示化 合物與AP(50yM)。由圖3可知，式I所示化合物的D-PBS溶液中，促進AP多聚體聚集的 式I所示化合物的最低有效濃度為5yM。
[0045] 3.ThioflavineT焚光檢測
[0046] ThioflavineT熒光染料（簡稱THT)(購自Sigma)溶于D-PBS(PH= 7. 4)至 100yM，Af3單體儲液經(jīng)D-PBS稀釋至100yM。THT和Af3溶液按體積比為I: 1混合后置 于96孔透明底黑板內(nèi)（Corning)，每孔100y1溶液，設(shè)置三個平行。加藥組設(shè)置50yM和 5yM兩個濃度，即設(shè)置AP和式I所示化合物的比例為1 :1和10 :1兩個條件。等體積的 D-PBS和相同濃度的式I所示化合物與THT溶液混合樣本作為本底對照。用全波長掃描 式多功能讀數(shù)儀Varioskfm?FlashThe進行熒光檢測，激發(fā)光波長為440nm，發(fā)射光波長為 480nm。AP50yM溶液與等摩爾濃度的式I所示化合物于37°C條件下共孵育7d，分別在 24h、96h和168h取樣品10y1與90y1濃度為20yM的THT的D-PBS溶液混勻后于96孔 板測熒光值，每個時間點樣品做3個重復。每次測量前樣品震搖120s保證樣品均勻。
[0047] 所得結(jié)果見圖4。由圖4可知，式I所示化合物有效降低了由AP聚集生成寡聚體 引起的THT熒光值升高。
[0048] 4.Dotblotassay
[0049] 取不同時間段，經(jīng)不同藥物處理，37°C孵育好的由A0 50yM溶液與等摩爾濃度的 式I所示化合物混合而得的樣品10y1滴于尼龍膜上，室溫晾干，按照WB的操作步驟，分別 進行封閉（5%nofatmilkinTBST，也即濃度為5%的脫脂奶粉的TBST溶液）、一抗孵育 (All-antioligomerantibody1 :1500、或 6E101 :6000)、一抗洗滌、二抗孵育和TBST洗滌， 曝光。
[0050] 圖5為分別取0h、ld、3d、5d、7d的樣品進行dot-blot檢測的結(jié)果。由圖可知，隨 著孵育時間的延長，識別AP寡聚體的抗體All檢測到的信號AP組逐漸增強，而加式I所 示化合物后，變化不明顯。
[0051] 5.細胞凋亡檢測
[0052] 選用E16天的C57胎鼠，解剖出皮層神經(jīng)元，分步用胰酶消化和DNaseI處理，經(jīng) 懸浮、離心、過濾等步驟收集細胞，用種植液（含10%FBS的NeurobasalMedium)制成密 度為4XIO4個/mL的單細胞懸液，接種于12孔板內(nèi)蓋玻片上（30萬/孔），圓形蓋玻片預 先經(jīng)HCl浸泡，滅菌后于12孔板內(nèi)進行H)L(0.lmg/ml)包被，置于37°C，5% 0)2培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)。4h后換生長培養(yǎng)基NeurobasalMedium添加B27補充物（Gibco)。培養(yǎng)3d，待神經(jīng) 元長出明顯的神經(jīng)突觸后，加已提前經(jīng)過三天孵育的濃度為5yM的AP或濃度為IyM的 式I所示化合物或由濃度為5yM的AP與濃度為IyM的式I的組合進行細胞凋亡檢測， DMSO作為對照。用DAPI進行細胞核染色，蔡司正置顯微鏡進行熒光觀察。
[0053] 圖6為加藥三天后所得檢測結(jié)果。由圖可知，式I所示化合物一定程度上減少了 AP聚集生成寡聚體引起的細胞凋亡。
[0054] 6. MTT細胞毒性試驗
[0055]SH-SY5Y(人神經(jīng)母細胞瘤細胞）培養(yǎng)于含10 %FBS和GlutaMAX?的DMEM/F12中， 待細胞匯合度80 %時進行傳代，96孔板按8000/孔進行鋪板。MTT檢測藥物毒性，所得結(jié)果 見圖7。由圖可知，式I所示化合物的IC5。為76. 52yM。
[0056] 原代培養(yǎng)的神經(jīng)元培養(yǎng)方法同上，將處理好的細胞懸液按4萬/孔的密度鋪于96 孔板內(nèi)，37 °C、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后加藥處理，72h后加MTT孵育4h，經(jīng)DMSO溶解后 于酶標儀570nm處進行檢測，計算細胞存活率。
[0057] 所得結(jié)果如圖8和9所示。由圖可知，式I所示化合物減少了AP聚集生成寡聚 體引起的細胞毒性，提尚了細胞的存活率。
【主權(quán)項】
1. 以式I所示化合物為活性成分的下述產(chǎn)品中的任意一種： 1) 預防和/或治療老年癡呆癥的產(chǎn)品； 2) 促進A13由單體向多聚體聚集的產(chǎn)品； 3) 抑制AP由單體向寡聚體聚集的產(chǎn)品；2. 式I所示化合物在制備下述產(chǎn)品中的應用： 1) 預防和/或治療老年癡呆癥的產(chǎn)品； 2) 促進AP由單體向多聚體聚集的產(chǎn)品； 3) 抑制AP由單體向寡聚體聚集的產(chǎn)品；3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)品或權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于：所述AP為淀 粉樣小肽。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的產(chǎn)品或權(quán)利要求2或3所述的應用，其特征在于：所述 多聚體的分子量為62kDa至250kDa; 所述寡聚體的分子量為8kDa至56kDa。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或4所述的產(chǎn)品或權(quán)利要求2或3或4所述的應用，其特征在 于：所述式I所示化合物溶于D-PBS中； 所述式I所示化合物在D-PBS中的濃度具體不小于5yM，更具體為5yM-lmM。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種5,2’,3’-三羥基-6,7-亞甲二氧基-二氫黃酮化合物的新應用。該應用為以式I所示化合物為活性成分的下述產(chǎn)品中的任意一種：1)預防和/或治療老年癡呆癥的產(chǎn)品；2)促進Aβ由單體向多聚體聚集的產(chǎn)品；3)抑制Aβ由單體向寡聚體聚集的產(chǎn)品。本發(fā)明提供的式I所示化合物能夠通過加速Aβ由單體向毒性較低的多聚體聚集，從而減少Aβ由單體向毒性高的寡聚體聚集，進而減少毒性高的寡聚體的濃度。
【IPC分類】A61K31/357, A61P25/28
【公開號】CN105030759
【申請?zhí)枴緾N201510535733
【發(fā)明人】趙長琦, 竇非, 張辰
【申請人】北京師范大學, 浙江大學
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年8月27日