059] 所述藥物組合物滴丸的制備方法包括以下步驟：
[0060] 稱取3, 4, 5-三甲氧基苯酚15. 0g，經(jīng)超微粉碎過200目篩后得細(xì)粉，加入至熔融的 15.Og聚乙二醇4000基質(zhì)中，攪勾，以二甲苯硅油為冷卻劑，滴制法制丸，干燥，制得防治糖 尿病腎病的藥物組合物滴丸。
[0061] 實(shí)施例6-9將通過3, 4, 5-三甲氧基苯酚的藥理藥效實(shí)驗(yàn)證實(shí)其對糖尿病腎病的 治療作用。
[0062] 實(shí)施例63, 4, 5-三甲氧基苯酚對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響實(shí)驗(yàn)
[0063] 本實(shí)施例利用AGEs誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型，維生素E(VitE)為陽性 藥，觀察3, 4, 5-三甲氧基苯酚對其影響，考察其抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的效果。
[0064] 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下：
[0065] 1、材料、試劑與儀器
[0066] DMEM培養(yǎng)基（GIBCO)，Life Technologies公司；
[0067]胎牛血清（FBS)，浙江天杭生物科技股份有限公司；
[0068] 多聚賴氨酸、VitE均為Sigma產(chǎn)品；
[0069]吖啶橙（AO)、溴化乙錠（EB)染料均為碧云天產(chǎn)品；
[0070] 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)，美國ATCC產(chǎn)品；
[0071] 3, 4, 5-三甲氧基苯酚由康臣腎病藥物研究中心化學(xué)分析室分離純化制得，經(jīng)高效 液相色譜儀（HPLC)檢測其純度>98%;
[0072]BS-224S型電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；
[0073]LDZ5-2型醫(yī)用離心機(jī)，北京京立醫(yī)用離心機(jī)廠；
[0074]CO2培養(yǎng)箱，長沙長錦科技有限公司；
[0075] 奧林巴斯1X71、BX51顯微鏡，日本奧林巴斯公司；
[0076] 超凈工作臺，蘇州百神科技網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)有限公司，蘇州市潔凈技術(shù)研究所；
[0077]SPECTRAmaxl90酶標(biāo)儀，美國MD公司。
[0078] 2、實(shí)驗(yàn)方法
[0079] 2. 1細(xì)胞培養(yǎng)
[0080] 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以含10 %FBS的DMEM制成單細(xì)胞懸液，以ImL/孔接種于放入 預(yù)先用多聚賴氨酸包被的蓋玻片的24孔板，細(xì)胞數(shù)IXIO5/孔，37°C、5%CO2培養(yǎng)24h后， 加入無血清的DMEM，再孵育12h，使細(xì)胞同步化；
[0081] 吸棄細(xì)胞上清液，同一水平3孔并列，加入含10 %FBS的DMEM900yL/孔和各藥 物100yL/孔。正常對照組加入等體積磷酸鹽緩沖液（PBS)，AGEs模型對照組加入AGEs(終 濃度為〇.lg/L) ;VitE陽性對照組分別加入AGEs(終濃度為0.lg/L)和VitE(終濃度為 100ymol/L) ;3, 4, 5-三甲氧基苯酚低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組分別加入AGEs(終濃度為0.lg/L) 和3, 4, 5-三甲氧基苯酚（終濃度分別為5ymol/L、50ymol/L、500ymol/L)。
[0082]2. 2細(xì)胞凋亡的染色及觀察
[0083] AO-EB染液的配制：稱取A0、EB各0. 20g，以超純水2.OmL溶解完全，裝入2mL棕色 EP管中，4°C冷藏保存?zhèn)溆谩?br>[0084] 染色及觀察：取出細(xì)胞爬片，PBS洗滌2次，甩干；在載玻片上滴加15 y L AO-EB染 液，蓋上細(xì)胞爬片，細(xì)胞面向下；靜止30秒，置熒光顯微鏡下，觀察并攝片。攝片時(shí)每張爬片 均取中心位置。
[0085] 2. 3數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)
[0086] 以IPP圖像分析軟件，分析各圖片（橙色+紅色部分細(xì)胞面積）和細(xì)胞總面積，以 下列公式計(jì)算各樣本凋亡百分率：
[0087] 凋亡百分率（％) =(橙色+紅色部分細(xì)胞面積）/細(xì)胞總面積X100
[0088] 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用成組設(shè)計(jì)的方差分析，用SPSS軟件進(jìn)行處理，結(jié)果均以 X± § (均值土方差）表不。
[0089] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0090] 從圖1、圖2可以看出，3, 4, 5-三甲氧基苯酚各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡百分率與AGEs模 型對照組相比明顯降低（P〈〇. 05,p〈0. 01)，而且具有明顯量效關(guān)系，說明3, 4, 5-三甲氧基 苯酚能有效抑制AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
[0091] 實(shí)施例7 3, 4, 5-三甲氧基苯酚對腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響實(shí)驗(yàn)
[0092]系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激增加，是糖尿病腎病重要病機(jī)之一。本實(shí)施例利用AGEs誘導(dǎo)大 鼠腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激增加，VitE為陽性藥，觀察3, 4, 5-三甲氧基苯酚對其影響，考 察抗系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激效果。
[0093] 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下：
[0094] 1、材料、試劑與儀器
[0095] 超氧化物陰離子熒光探針（DHE)，碧云天產(chǎn)品；
[0096] 大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-I，美國ATCC產(chǎn)品；
[0097] 其它試劑與儀器同實(shí)施例6。
[0098]2、實(shí)驗(yàn)方法
[0099] 2. 1細(xì)胞培養(yǎng)
[0100] 取對數(shù)生長期HBZY-I細(xì)胞，以含10%FBS的DMEM制成單細(xì)胞懸液，以ImL/孔接 種于放入預(yù)先用多聚賴氨酸包被的蓋玻片的24孔板，細(xì)胞數(shù)IXIO5/孔，37°C、5 %CO2培養(yǎng) 24h后，加入無血清的DMEM，再孵育12h使細(xì)胞同步化；
[0101] 吸棄細(xì)胞上清液，同一水平3孔并列，加入含10%FBS的DMEM900yL/孔和各藥物 100yL/孔。正常對照組加入等體積PBS，模型對照組加入AGEs(終濃度為0.lg/L);VitE 陽性對照組分別加入AGEs(終濃度為0.lg/L)和VitE(終濃度為100ymol/L) ;3, 4, 5-三 甲氧基苯酚低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組分別加入AGEs(終濃度為0.lg/L)和3, 4, 5-三甲氧基苯 酸（終濃度分別為 5ymol/L、50ymol/L、500ymol/L)〇
[0102] 2. 2染色及觀察
[0103] DHE染液母液的配制：稱取DHE，以二甲基亞砜（DMSO)配制成lmmol/L的母液，分 裝，-20 °C避光干燥保存?zhèn)溆谩?br>[0104] 染色及觀察：取出DHE染液母液，200倍PBS稀釋成5ymol/L的工作液使用。取 出24孔板，吸棄培養(yǎng)上清液，PBS洗滌2次，每孔加入DHE工作液50yL，37°C孵育30分鐘， 取出細(xì)胞爬片，置熒光顯微鏡下，觀察并攝片。攝片時(shí)每張爬片均取中心位置。
[0105] 2. 3數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)
[0106] 以IPP圖像分析軟件，分析各圖片紅色區(qū)域積分光密度值，以下列公式計(jì)算各組 氧化應(yīng)激系數(shù)：
[0107] 相對氧化應(yīng)激系數(shù)=各組圖片紅色區(qū)域積分光密度值/正常對照組紅色區(qū)域平 均積分光密度值
[0108] 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用成組設(shè)計(jì)的方差分析，用SPSS軟件進(jìn)行處理，結(jié)果均以 X土S(均值土方差）表示。
[0109] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0110] 從圖3、圖4可以看出，3, 4, 5-三甲氧基苯酚各實(shí)驗(yàn)組的相對氧化應(yīng)激系數(shù)與AGEs 模型對照組相比明顯降低（P〈〇.05,p〈0. 01)，而且具有明顯量效關(guān)系，說明3, 4, 5-三甲氧 基苯酚能有效抑制AGEs誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激增加。
[0111] 實(shí)驗(yàn)例8 3, 4, 5-三甲氧基苯酚對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞趨化的影響實(shí)驗(yàn)
[0112] 慢性炎癥反復(fù)發(fā)作是糖尿病腎病的重要病因病機(jī)，巨噬細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)?zāi)茌^好地復(fù) 制炎癥早期機(jī)體的反應(yīng)特點(diǎn)，在治療糖尿病腎病藥物開發(fā)中具有顯著意義。本實(shí)施例通過 考察3, 4, 5-三甲氧基苯酚對AGEs所致巨噬細(xì)胞趨化增加的影響，評價(jià)其對糖尿病腎病早 期炎癥的的細(xì)胞藥理學(xué)效應(yīng)。
[0113]實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下：
[0114] 1、材料、試劑與儀器
[0115] 腎小球系膜細(xì)胞株HBZY-I，美國ATCC產(chǎn)品；
[0116]Transwell，康寧公司產(chǎn)品；
[0117] 其它試劑與儀器同實(shí)施例6。
[0118] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0119] 2.1細(xì)胞培養(yǎng)
[0120] 取對數(shù)生長期HBZY-I細(xì)胞，以含10 %FBS的DMEM制成單細(xì)胞懸液，以Iml/孔接 種于24孔板，細(xì)胞數(shù)IXIO5/孔，37°C、5%CO2培養(yǎng)24h后，加入無血清的DMEM，再孵育12h 使細(xì)胞生長同步進(jìn)入休止期。
[0121] 吸棄細(xì)胞上清液，同一水平3孔并列，加入含10 %FBS的DMEM900yL/孔和各藥物 100 1^/孔。正常對照組加入等體積？83，模型對照組加入46￡8(終濃度為0.18/1);(：^陽 性對照組加入AGEs(終濃度為0.lg/L)和CsA(終濃度為50ymol/L) ;3, 4, 5-三甲氧基苯 酚低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組分別加入AGEs(終濃度為0.lg/L)和3, 4, 5-三甲氧基苯酚（終濃 度分別為5ymol/L、50ymol/L、500ymol/L);37°C、5 %CO2培養(yǎng)24h后，進(jìn)行巨噬細(xì)胞趨化 實(shí)驗(yàn)。
[0122] 2. 2巨噬細(xì)胞取材
[0123] 取SPF級昆明種小鼠，脫臼處死，腹腔注射5mL、4°CPBS，75 %酒精浸泡3分鐘， 輕揉小鼠腹部1分鐘，剪開腹部外層皮膚，在內(nèi)層肌肉上剪一小口，滴管吸取腹腔內(nèi)液， 1000 rpm離心5分鐘，即得。若有紅細(xì)胞沉積，則以0. 83%NH4Cl溶液洗滌至無紅細(xì)胞。
[0124] 2. 3巨噬細(xì)胞趨化與檢測
[0125]將培養(yǎng)有給予藥物后24hHBZY-I的24孔板取出，放入transwell小室。以含10% FBS的DMEM將離心所得小鼠腹腔制成單細(xì)胞懸液，加入transwell小室內(nèi)，每室300yL，細(xì) 胞數(shù)為3X105/wel1。37°C、5%CO2培養(yǎng)24h后，取出well，PBS洗滌2次，濕棉簽擦去well 小室內(nèi)細(xì)胞，1%結(jié)晶紫染色5分鐘，PBS洗滌3次，濕棉簽再次擦去well小室可能殘留的 細(xì)胞，每wel1加入5 %醋酸250yL，靜置10分鐘，待wel1內(nèi)醋酸都進(jìn)入24孔板后，吸取醋 酸，加入酶標(biāo)板，每孔200yL，測定45