用于治療或預(yù)防疾病的因子1蛋白、因子2蛋白及其抑制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及包含由來(lái)源于人染色體區(qū)C190rfl0和/或C190rf63的核酸編碼之氨 基酸序列的蛋白質(zhì)（稱為因子1和/或因子2)，其用于增強(qiáng)非轉(zhuǎn)化組織或非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增 殖和/或使其愈合和/或抑制其凋亡。還提供了因子1和因子2的抑制劑，其用于醫(yī)學(xué)用 途，特別是用于治療或預(yù)防其中血管發(fā)生有助于疾病發(fā)生或進(jìn)展的疾病。
【背景技術(shù)】
[0002] 急性心肌梗死（AMI)是全世界發(fā)病率和死亡率的一個(gè)主要原因。僅在德國(guó)，每年 發(fā)生約280. 000例。對(duì)患有AMI的患者的治療包括通過(guò)再灌注療法打開(kāi)閉塞的冠狀動(dòng)脈， 并且聯(lián)合施用血小板聚集抑制劑和凝固抑制劑以防止血管再閉合。另外，可通過(guò)施用0阻 滯劑和ACE抑制劑降低脈搏和血壓。還常見(jiàn)的是使用斯特汀類(lèi)（statins)以降低膽固醇水 平。用于直接修復(fù)心肌的醫(yī)學(xué)方法目前只限于實(shí)驗(yàn)性地使用身體自身的骨髓細(xì)胞。對(duì)于具 有類(lèi)似效果但是不使用骨髓細(xì)胞的藥物有巨大需求。
[0003] AMI期間持續(xù)的組織壞死引起傷口愈合應(yīng)答，其導(dǎo)致壞死區(qū)域被肉芽組織替換并 最終被富含膠原蛋白的疤痕替換。在AMI之后，單核細(xì)胞被從骨髓中募集到梗死心肌中，并 且在傷口愈合中發(fā)揮重要作用。心肌中的單核細(xì)胞響應(yīng)是短暫雙相的。促炎性單核細(xì)胞出 現(xiàn)較早并且促進(jìn)梗死組織的消化和壞死碎片的移除，而修復(fù)性單核細(xì)胞在較晚占據(jù)優(yōu)勢(shì)并 且傳播血管發(fā)生和修復(fù)。趨化因子受體CXCR4的細(xì)胞表面表達(dá)鑒定小鼠和人中的修復(fù)性單 核細(xì)胞亞群。CXCR4+骨髓細(xì)胞的促血管發(fā)生和促愈合效果被認(rèn)為通過(guò)以旁分泌方式作用 的分泌蛋白介導(dǎo)，但是對(duì)于這些因子的鑒定在很大程度上尚未可知。因此，本發(fā)明人在人 CXCR4+骨髓細(xì)胞中進(jìn)行了生物信息學(xué)分泌蛋白質(zhì)組（secretome)分析以鑒定在AMI之后控 制梗死愈合以及表現(xiàn)出治療潛力的新的分泌蛋白。
[0004] 這些研宄鑒定了兩種表現(xiàn)出促血管發(fā)生和/或細(xì)胞保護(hù)作用的不同多肽，本發(fā)明 人將其命名為因子1 (Factor 1)和因子2 (Factor 2)蛋白。
[0005] 這兩種因子均在多種關(guān)于生物背景的科學(xué)出版物中描述，其不包括這些因子在非 轉(zhuǎn)化細(xì)胞或非轉(zhuǎn)化組織中的促血管發(fā)生和/或細(xì)胞保護(hù)作用。沒(méi)有研宄公開(kāi)證據(jù)或甚至暗 示這些因子的功能，或者一種因子與僅和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞或非轉(zhuǎn)化組織相關(guān)的疾病或病癥之間 的顯著相關(guān)性。
[0006] 人因子1的氨基酸序列在人染色體19上的開(kāi)放閱讀框10 (C190rf 10)中被編碼。 在2007年對(duì)作為滑膜中的新分泌因子的所謂的成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（FLS細(xì)胞）的蛋 白質(zhì)組分析中描述了所述蛋白質(zhì)。猜測(cè)了所述蛋白質(zhì)的分泌和關(guān)節(jié)的炎性疾病之間的相 關(guān)性，但是沒(méi)有任何試驗(yàn)或統(tǒng)計(jì)學(xué)證據(jù)（Weiler等，Arthritis Research and Therapy 2007， The identification and characterization of a novel protein， cl9orfl0， in the synovium)。一個(gè)相應(yīng)專利申請(qǐng)要求保護(hù)所述蛋白質(zhì)作為用于治療關(guān)節(jié)或用于 診斷經(jīng)歷了改變的生長(zhǎng)的組織以及監(jiān)測(cè)組織中變化的治療劑（US 2008/0004232 A1， Characterization of cl9orfl0，a novel synovial protein)。另一個(gè)科學(xué)出版物描述 了肝細(xì)胞癌細(xì)胞中所述蛋白質(zhì)的增強(qiáng)的表達(dá)（Sunagozaka等，International Journal of Cancer,2010, Identification of a secretory protein cl9orf10 activated in hepatocellular carcinoma)。重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出對(duì)培養(yǎng)的肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖增 強(qiáng)的效果。應(yīng)注意的是，C190rfl0也被稱為IL-25、IL-27和IL-27W，因?yàn)槠渥畛醣徽J(rèn)為是 白細(xì)胞介素。但是，術(shù)語(yǔ)"IL-25"和"IL-27"已經(jīng)在本領(lǐng)域中不一致地使用，并且用于指多 種不同的蛋白質(zhì)。例如，US 2004/0185049指出一種蛋白質(zhì)為IL-27,并且公開(kāi)了其在調(diào)控 免疫應(yīng)答中的用途。這種蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上不同于因子1(根據(jù)SEQ ID NO :1的因子1氨基 酸序列與根據(jù)UniProt:Q8NEV9的"IL-27"的氨基酸序列相比）。類(lèi)似地，EP 2 130 547 A1 指出一種蛋白質(zhì)為IL-25,并且公開(kāi)了其在治療炎癥中的用途。這種蛋白質(zhì)在本領(lǐng)域中也被 稱為IL-17E，并且其在結(jié)構(gòu)上不同于因子1(根據(jù)SEQ ID N0:1的因子1氨基酸序列與根 據(jù)UniProt :Q9H293的"IL-25"的氨基酸序列相比）。
[0007] 人因子2的氨基酸序列在人染色體19上的開(kāi)放閱讀框63(C190rf63)中被 編碼。所述蛋白質(zhì)在2009年被作為新的分泌因子INM02描述（Wang等，Journal of Endocrinology 2009， Molecular cloning of a novel secreted peptide， INM02, and regulation of its expression by glucose)。在具有多克隆抗體的人血清中示出了所 述蛋白質(zhì)的存在。此外，示出了培養(yǎng)的MIN6(f3細(xì)胞）以及分離的胰腺大鼠胰島中所述蛋 白質(zhì)的表達(dá)和培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度之間的相關(guān)性。對(duì)于糖尿病和I匪2的表達(dá)之間的相 關(guān)性的分析沒(méi)有提供顯著性結(jié)果。一個(gè)相應(yīng)專利申請(qǐng)要求保護(hù)抗所述蛋白質(zhì)的多克隆抗 體的產(chǎn)生及其用于治療糖尿病的用途（CN 200910055490, Novel polyclonal antibody of secretive peptide INM02 and preparation method thereof)〇
[0008] 另一個(gè)科學(xué)出版物描述了作為新的分泌因子hHSSl(人造血含信號(hào)肽分泌1) 的所述蛋白質(zhì)（Junes-Gill 等，J Neurooncol，2〇ll，hHSSl:a novel secreted factor and suppressor of glioma growth located at chromosome 19ql3. 33) 〇 公開(kāi)的數(shù)據(jù) 示出了造血系統(tǒng)中干細(xì)胞中hHSSl的表達(dá)，并提出了作為特定腦腫瘤（神經(jīng)膠質(zhì)瘤）的 產(chǎn)生中之腫瘤抑制劑的功能。一個(gè)相應(yīng)專利申請(qǐng)要求保護(hù)hHSSl在治療腦腫瘤中的用 途（W02011/094446 Al， A method for treating brain cancer using a novel tumor suppressor gene and secreted factor)〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含根據(jù)SEQ ID NO :1的氨 基酸序列或者其片段或變體，所述片段或變體與SEQ ID NO :1具有至少80%序列同一性， 所述蛋白質(zhì)用于增強(qiáng)非轉(zhuǎn)化組織或非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖和/或使其愈合和/或抑制其凋亡。
[0010] 在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含根據(jù)SEQ ID N0 :3的氨 基酸序列或者其片段或變體，所述片段或變體與SEQ ID N0 :3具有至少80%序列同一性， 所述蛋白質(zhì)用于增強(qiáng)非轉(zhuǎn)化組織或非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖和/或使其愈合和/或抑制其凋亡。
[0011] 在第三方面，本發(fā)明提供了編碼根據(jù)所述第一和第二方面的蛋白質(zhì)的核酸，所述 核酸用于增強(qiáng)非轉(zhuǎn)化組織或非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖和/或使其愈合和/或抑制其凋亡。
[0012] 在第四方面，本發(fā)明提供了包含根據(jù)所述第三方面的核酸的載體，所述載體用于 增強(qiáng)非轉(zhuǎn)化組織或非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖和/或使其愈合和/或抑制其凋亡。
[0013] 在第五方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含所述第一和/或第 二方面的蛋白質(zhì)和/或所述第三方面的核酸/或所述第四方面的載體并且任選地包含合適 的藥物賦形劑，所述藥物組合物用于增強(qiáng)非轉(zhuǎn)化組織或非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖和/或使其愈合 和/或抑制其凋亡。
[0014] 在第六方面，本發(fā)明提供了因子1和因子2分別的抑制劑，所述抑制劑用于醫(yī)學(xué)用 途，優(yōu)選是治療或預(yù)防其中血管發(fā)生有助于疾病發(fā)生或發(fā)展的疾病。
[0015] 在第七方面，本發(fā)明提供了編碼這種抑制劑的核酸，所述核酸用于治療或預(yù)防其 中血管發(fā)生有助于疾病發(fā)生或發(fā)展的疾病。
[0016] 在第八方面，本發(fā)明提供了包含所述第七方面的編碼這種抑制劑的核酸的載體， 所述載體用于治療或預(yù)防其中血管發(fā)生有助于疾病發(fā)生或發(fā)展的疾病。
[0017] 在第九方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含所述第六方面的抑制劑和/或所 述第七方面的核酸和/或所述第八方面的載體并且任選地包含合適的藥物賦形劑，所述藥 物組合物用于治療或預(yù)防其中血管發(fā)生有助于疾病發(fā)生或發(fā)展的疾病。以上
【發(fā)明內(nèi)容】
未必 描述了本發(fā)明的所有方面。
[0018] 附圖簡(jiǎn)述
[0019] 圖1:如指m的，在不存在(對(duì)照）或存在10% FCS、人重組VEGF-A(R&D系統(tǒng)）或 不同濃度的重組人因子1 (根據(jù)SEQ ID N0 :2的氨基酸序列）或因子2 (根據(jù)SEQ ID N0 :4 的氨基酸序列）的情況下，將人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HCAEC)和人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC) 在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。（A)通過(guò)溴脫氧尿苷滲入測(cè)量HCAEC增殖。（B)在用移液管 尖端對(duì)匯合的內(nèi)皮細(xì)胞單層制造創(chuàng)傷后，評(píng)估HCAEC迀移。（C)在培養(yǎng)在生長(zhǎng)因子減少的 基質(zhì)膠（Matrigel)上的細(xì)胞中評(píng)估HUVEC網(wǎng)絡(luò)形成。N =每種條件3-5個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)；* P < 0? 05, * * P < 0? 01，* * * P < 0? 001 相對(duì)于對(duì)照。
[0020] 圖2:通過(guò)Percoll密度梯度離心從1至3天齡的Sprague-Dawley大鼠中分離心 室心肌細(xì)胞。如指出的，在不存在（對(duì)照）或存在重組人⑶F-15或不同濃度的重組小鼠因 子1 (根據(jù)SEQ ID N0 :13的氨基酸序列）的情況下，使心肌細(xì)胞暴露于模擬的局部缺血180 分鐘（5 % C02/95 % N2氣氛下的含2-脫氧葡萄糖的不含葡萄糖培養(yǎng)基），然后進(jìn)行60分鐘 的模擬再灌注（返回5% C02/95%室內(nèi)空氣下的含葡萄糖培養(yǎng)基）。通過(guò)原位TdT介導(dǎo)的 dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL)評(píng)估細(xì)胞死亡。N = 3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)每種條件；* P < 0. 05相對(duì) 于對(duì)照。
[0021] Ml:將小鼠因子1或因子2cDNA (根據(jù)SEQ ID N0 :7和10的核酸）克隆到復(fù)制缺 陷型腺病毒中。使用編碼半乳糖苷酶（lacZ)的復(fù)制缺陷型腺病毒作為對(duì)照。將10至12周 齡的雄性C57BL/6小鼠用異氟烷麻醉和通氣，并且進(jìn)行永久的冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD)結(jié) 扎。在LAD結(jié)扎后立即將病毒注入到左心室（LV)腔中。（A) LAD結(jié)扎后28天通過(guò)經(jīng)胸超聲 心動(dòng)圖（transthoracic echocardiography)評(píng)估左心室收縮功能（切面面積變化，F(xiàn)AC)。 (B) LAD結(jié)扎后28天通過(guò)熒光顯微術(shù)對(duì)梗死邊界區(qū)中的同工凝集素陽(yáng)性毛細(xì)血管密度進(jìn)行 定量。* P < 〇? 05, * * P < 0? 01 相對(duì)于 Ad. lacZ 對(duì)照。
[0022] 胤土將10至12周齡的雄性C57BL/6小鼠用異氟烷麻醉和通氣，并且進(jìn)行短暫 的冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎一小時(shí)，然后再灌注28天。在再灌注時(shí)，小鼠接受重組小鼠因子 1 (根據(jù)SEQ ID N0 :13的氨基酸序列）或因子2 (根據(jù)SEQ ID N0 :24的氨基酸序列）的單 次皮下（S. c.)注射。這之后進(jìn)行7天持續(xù)的重組因子1或因子2的皮下輸注。對(duì)照小鼠 輸注PBS。（A)再灌注后28天通過(guò)經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖評(píng)估左心室收縮功能（部分面積變化， FAC)。（B)再灌注后28天通過(guò)熒光顯微術(shù)對(duì)梗死邊界區(qū)中的同工凝集素陽(yáng)性毛細(xì)血管密度 進(jìn)行定量。* P < 〇? 05, * * P < 0? 01相對(duì)于PBS對(duì)照。
[0023] 里互:將10至12周齡的雄性C57BL/6小鼠用異氟烷（1-2% )麻醉和通氣，并且進(jìn) 行短暫的冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎一小時(shí)，然后再灌注28天。在再灌注時(shí)，小鼠接受重組小 鼠因子1或因子2 (分別為SEQ ID N0:13和24)的單次皮下注射（對(duì)照小鼠注射PBS)。這 之后進(jìn)行7天持續(xù)的重組因子1或因子2的皮下輸注。對(duì)照小鼠輸注PBS。28天中每天檢 查小鼠以評(píng)估梗死后存活。
[0024] BLASTP算法檢索人C190rfl0編碼的蛋白質(zhì)的序列同源物。從鑒定的序 列中選擇來(lái)自不同脊椎動(dòng)物物種的實(shí)例，所述脊椎動(dòng)物物種主要是哺乳動(dòng)物，但是也從兩 棲動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)和魚(yú)類(lèi)中選擇一個(gè)實(shí)例。使用CLUSTALW2算法對(duì)所選擇的氨基酸序列進(jìn)行比 對(duì)。所有比對(duì)物種之間的同一性標(biāo)記為"*"，最高保守氨基酸位置（即僅示出保守替換的 位置）標(biāo)記為"："，高度保守氨基酸位置標(biāo)記為
[0025] Ml:用BLASTP算法檢索人C190rfl0編碼的蛋白質(zhì)的序列同源物。從鑒定的序 列中選擇來(lái)自不同脊椎動(dòng)物物種的實(shí)例，所述脊椎動(dòng)物物種主要是哺乳動(dòng)物，但是也從兩 棲動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)和魚(yú)類(lèi)中選擇一個(gè)實(shí)例。使用CLUSTALW2算法對(duì)所選擇的哺乳動(dòng)物氨基酸序 列進(jìn)行比對(duì)。所有比對(duì)物種之間的同一性標(biāo)記為"*"，最高保守氨基酸位置（即僅示出保 守替換的位置）標(biāo)記為"："，高度保守氨基酸位置標(biāo)記為
[0026] 胤丘用BLASTP算法檢索人C190rf63剪接變體HSS1編碼的蛋白質(zhì)的序列同源 物。從鑒定的序列中選擇來(lái)自不同脊椎動(dòng)物物種的實(shí)例，所述脊椎動(dòng)物物種主要是哺乳動(dòng) 物，但是也從兩棲動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)中選擇一個(gè)序列。使用CLUSTALW2算法對(duì)所選擇的氨基酸序 列進(jìn)行比對(duì)。所有比對(duì)物種之間的同一性標(biāo)記為"*"，最高保守氨基酸位置（即僅示出保 守替換的位置）標(biāo)記為"："，高度保守氨基酸位置標(biāo)記為
[0027] _:用BLASTP算法檢索人C190rf63剪接變體HSS1編碼的蛋白質(zhì)的序列同源 物。從鑒定的序列中選擇來(lái)自不同脊椎動(dòng)物物種的實(shí)例，所述脊椎動(dòng)物物種主要是哺乳動(dòng) 物，但是也從兩棲動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)物種中選擇一個(gè)序列。使用CLUSTALW2算法對(duì)所選擇的氨基 酸序列進(jìn)行比對(duì)。所有比對(duì)物種之間的同一性標(biāo)記為"*"，最高保守氨基酸位置（即僅示 出保守替換的位置）標(biāo)記為"："，高度保守氨基酸位置標(biāo)記為
[0028]SBLASTP算法檢索人C190rf63剪接變體HSM1編碼的蛋白質(zhì)的序列同源 物。從鑒定的序列中選擇來(lái)自不同脊椎動(dòng)物物種的實(shí)例，所述脊椎動(dòng)物物種主要是哺乳動(dòng) 物，但是也從兩棲動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)中選擇一個(gè)序列。使用CLUSTALW2算法對(duì)所選擇的氨基酸序 列進(jìn)行比對(duì)。所有比對(duì)的物種之間的同一性標(biāo)記為"*"，最高保守氨基酸位置（即僅示出 保守替換的位置）標(biāo)記為"："，高度保守氨基酸位置標(biāo)記為
[0029] 里II:用BLASTP算法檢索人C190rf63剪接變體HSM1編碼的蛋白質(zhì)的序列同源 物。從鑒定的序列中選擇來(lái)自不同脊椎動(dòng)物物種的實(shí)例，所述脊椎動(dòng)物物種主要是哺乳動(dòng) 物，但是也從兩棲動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)中選擇一個(gè)序列。使用CLUSTALW2算法對(duì)所選擇的哺乳動(dòng)物 氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。所有比對(duì)的物種之間的同一性標(biāo)記為" 最高保守氨基酸位置 (即僅示出保守替換的位置）標(biāo)記為"："，高度保守氨基酸位置標(biāo)記為
[0030] 圖12:示m了閔子1和2特異性抗體對(duì)用重組因子1 (圖A)和重組因子2(圖B) 刺激的HCAEC的增殖的影響。數(shù)據(jù)為來(lái)自3-6次實(shí)驗(yàn)的平均值土SEM。圖A :#P < 0. 05， ##P < 0? 01相對(duì)于未刺激的對(duì)照（左列）* P < 0? 05, * * P < 0? 01相對(duì)于無(wú)抗體的因 子1 ;圖B :##P < 0? 01相對(duì)于未刺激的對(duì)照（最左列）* P < 0? 05, * * P < 0? 01相對(duì)于 無(wú)抗體的因子2。
[0031] 發(fā)明詳述
[0032] 在下文詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解的是，本發(fā)明不限于本文描述的特定方法、方 案和試劑，因?yàn)檫@些可以改變。還應(yīng)理解的是，本文使用的術(shù)語(yǔ)僅僅是為了描述特定實(shí)施方 案，而不是旨在限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅由所附權(quán)利要求限定。除非另有限定， 否則本文使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的通常理解相同的含義。
[0033] 定義
[0034] 優(yōu)選地，本文使用的術(shù)語(yǔ)如以下文獻(xiàn)所述定義："A multilingual glossary of biotechnological terms ： (IUPAC Recommendations)"，H. G. W. Leuenberger，B. Nagel，和 H.K5lbl，編輯，Helvetica Chimica Acta，CH_4010Basel，Switzerland，（1995)〇
[0035] 為了實(shí)踐本發(fā)明，除非另外指出，否則使用本領(lǐng)域文獻(xiàn)中解釋的化學(xué)、生物化學(xué)、 細(xì)胞生物學(xué)和重組DNA技術(shù)的常規(guī)方法（參考，例如Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第 2 版，J. Sambrook 等編輯，Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor 1989)。此外，還使用本領(lǐng)域文獻(xiàn)中解釋的常規(guī)臨床心臟病學(xué)方法（參考，例如 Braunwald's Heart Disease. A Textbook of Cardiovascular Medicine，第9 版，P. Libby 等編輯，Saunders Elsevier Philadelphia，2011)〇
[0036] 在整個(gè)說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中，除非上下文另有要求，否則詞語(yǔ)"包括"及類(lèi) 似用語(yǔ)如"包含"和"含有"將被理解為意指包括所述整體或步驟或者整體或步驟的組，但 是不排除其他整體或步驟或者整體或步驟的組。如本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求中使用的，未 用數(shù)量詞限定的名詞包括復(fù)數(shù)，除非內(nèi)容清楚地另外規(guī)定。
[0037] 核酸分子應(yīng)理解為由核苷酸單體形成的聚合物大分子。核苷酸單體由核堿基、五 碳糖（例如但不限于核糖或2' _脫氧核糖）和一至三個(gè)磷酸基因構(gòu)成。通常，多核苷酸通 過(guò)單個(gè)核苷酸單體之間的磷酸二酯鍵形成。在本發(fā)明上下文中，提到的核酸分子包括但不 限于核糖核酸（RNA)和脫氧核糖核酸（DNA)。術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"和"核酸"在本文中可互換 使用。
[0038] 術(shù)語(yǔ)"開(kāi)放閱讀框"（0RF)是指可翻譯成氨基酸的核苷酸序列。通常，這樣的0RF 包含起始密碼子、隨后通常具有三核苷酸的倍數(shù)之長(zhǎng)度的區(qū)域，但是在給定的閱讀框中不 包含終止密碼子〇^6、1纟纟、16纟、說(shuō)6、說(shuō)纟或呢纟）。通常，01^天然存在或被人工構(gòu)建，即通 過(guò)基因技術(shù)手段。0RF編碼其中的氨基酸可翻譯形成肽連接鏈的蛋白質(zhì)。
[0039] 術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"和"多肽"在本文中可互換使用，是指任何氨基酸的肽鍵連接鏈，而 不論長(zhǎng)度或翻譯后修飾。本發(fā)明中的可用蛋白質(zhì)（包括蛋白質(zhì)衍生物、蛋白質(zhì)變體、蛋白 質(zhì)片段、蛋白質(zhì)區(qū)段、蛋白質(zhì)表位和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域）可進(jìn)一步通過(guò)化學(xué)修飾進(jìn)行修飾。這 意味著這種化學(xué)修飾的多肽包含除20種天然存在的氨基酸之外的化學(xué)基團(tuán)。這樣的其他 化學(xué)基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于糖基化氨基酸和磷酸化氨基酸。多肽的化學(xué)修飾可提供與 親本多肽相比有利的性質(zhì)，例如，一種或更多種增強(qiáng)的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)的生物半衰期或增加的 水溶性。適用于本發(fā)明中的可用變體的化學(xué)修飾包括但不限于：PEG化、非糖基化親本多 肽的糖基化、與治療性小分子（如胰高血糖素樣肽1激動(dòng)劑包括艾塞那肽（exenatide)、阿 必魯肽（albiglutide)、他司魯肽（taspoglutide)、DPP4抑制劑、腸降血糖素和利拉魯肽 (liraglutide))共價(jià)偶聯(lián)，或者親本多肽中存在的糖基化模式的改變。適用于本發(fā)明的可 用變體的這些化學(xué)修飾可共翻譯或在翻譯后發(fā)生。
[0040] 術(shù)語(yǔ)"氨基酸"涵蓋天然存在的氨基酸以及氨基酸衍生物。本發(fā)明上下文中 的疏水非芳香族氨基酸優(yōu)選具有大于0.5,更優(yōu)選大于1.0,甚至更優(yōu)選大于1.5的 Kyte-Doolittle親水指數(shù)并且不是芳香族的任何氨基酸。優(yōu)選地，本發(fā)明上下文中的疏 水非芳香族氨基酸選自氨基酸丙氨酸（Kyte Doolittle親水指數(shù)1.8)、甲硫氨酸（Kyte Doolittle親水指數(shù)1. 9)、異亮氨酸（Kyte Doolittl