N-(苯基氨基硫代甲?；?苯甲酰胺類(lèi)化合物的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一類(lèi)小分子化合物的醫(yī)藥應(yīng)用，具體涉及N-(苯 基氨基硫代甲?；┍郊柞０奉?lèi)化合物或其可藥用鹽在制備用于治療與MIF相關(guān)的炎癥性 疾病的藥物，特別是MIF抑制劑中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 巨細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一 種集細(xì)胞因子、酶活性、神經(jīng)內(nèi)分泌激素于一身的多功能蛋白質(zhì)。作為一種細(xì)胞因子，MIF 幾乎參與所有炎癥性疾病過(guò)程，它通過(guò)活化巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞來(lái)促進(jìn)先天性和獲得性免疫 響應(yīng)，是先天性免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子，被認(rèn)為是連接內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫體系的介導(dǎo)劑。 MIF與多種免疫性和炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，如MIF在單核/巨噬細(xì)胞的血管壁粘 附、跨膜移動(dòng)、內(nèi)皮下聚集、泡沫細(xì)胞形成及斑塊穩(wěn)定中的作用，涉及到類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng) 脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的多個(gè)方面。MIF還直接影響正常細(xì)胞的分裂和瘤基因誘導(dǎo)的惡性 轉(zhuǎn)化，或間接通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、迀移以及血管增生等。
[0003] 由于具有廣泛的生物活性，MIF與多種免疫、炎癥以及腫瘤等疾病密切相關(guān)，已經(jīng) 成為治療這些疾病的一個(gè)重要靶點(diǎn)。在與MIF相關(guān)的抗炎藥物研宄方面，國(guó)外許多醫(yī)藥公 司和科研機(jī)構(gòu)正在開(kāi)發(fā)新的具有抗炎效果的MIF抑制劑，但目前還沒(méi)有成功上市的MIF抑 制劑。因此，積極尋找和設(shè)計(jì)新的MIF抑制劑，并探索其抗炎效果，具有重要的臨床意義和 廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)上述情況，本發(fā)明提供了N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺類(lèi)化合物或其 可藥用鹽在制備用于治療與MIF相關(guān)的炎癥性疾病的藥物中的用途，其中所述N-(苯基氨 基硫代甲酰基）苯甲酰胺類(lèi)化合物具有如式I所示的結(jié)構(gòu)：
其中： R1為氫或鹵素； R2為氫、鹵素、甲基或甲氧甲酰基； R3為氫、鹵素、甲基、異丙基、甲氧甲酰基、苯氧基甲基、三氟甲基、苯基、3, 5-二氟苯基、 3, 5-二氯苯基或3, 5-二三氟甲基苯基； R4為氫、鹵素、甲基、甲氧基或甲氧甲酰基； R5為氫、鹵素、乙?；Ⅳ然蛄u甲基； R6為氫、羥基、羧基、乙?；⒁阴０被?、甲氧甲?；?、乙氧甲酰基、氨基甲?；虮郊柞?氨基； R7為氫或羧基。
[0005] 優(yōu)選的，在上述技術(shù)方案中，所述N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺類(lèi)化合物選 自化合物中的任意一種。




[0007] 優(yōu)選的，在上述技術(shù)方案中，所述可藥用鹽包括(但不限于)N-(苯基氨基硫代甲酰 基）苯甲酰胺類(lèi)化合物(特別是化合物I^I4C1)與鹽酸、磷酸、硫酸等無(wú)機(jī)酸形成的酸加成鹽 以及與醋酸、馬來(lái)酸、枸櫞酸、苯磺酸、甲基苯磺酸、富馬酸、酒石酸等有機(jī)酸形成的酸加成 鹽。
[0008] 優(yōu)選的，在上述技術(shù)方案中，所述與MIF相關(guān)的炎癥性疾病包括(但不限于)類(lèi)風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化和敗血癥。
[0009] 優(yōu)選的，在上述技術(shù)方案中，所述用于治療與MIF相關(guān)的炎癥性疾病的藥物為MIF 抑制劑。
[0010] 本發(fā)明對(duì)上述N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺類(lèi)化合物進(jìn)行了生物學(xué)活性 測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其對(duì)MIF具有明顯的酶抑制活性，對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264. 7中的糖皮質(zhì)激 素具有負(fù)向調(diào)節(jié)效果，可以顯著抑制脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的炎性因子 (TNF-a和NO)的釋放，這些化合物還可以抑制MIF引起的巨噬細(xì)胞的趨化迀移。此外， MTT法檢測(cè)證實(shí)這些化合物在10、20和40yM三個(gè)濃度下對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2和巨噬細(xì)胞 RAW264. 7的活力均沒(méi)有顯著影響。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研宄化合物抗炎作用是否與抑制 MIF對(duì)ERK1/2的活化有關(guān)，發(fā)現(xiàn)這些化合物可以抑制ERK1/2的磷酸化。
[0011] 本發(fā)明中的N-(苯基氨基硫代甲酰基）苯甲酰胺類(lèi)化合物具備MIF抑制劑的功 能，對(duì)與MIF相關(guān)的炎癥性疾病具有明顯的抑制作用，可以用于制備與MIF相關(guān)的抗炎藥 物。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1為實(shí)施例1中化合物15、18、113和Ii^MIF的酶抑制活性曲線，其中上述化 合物15、18、1 13和I15依次對(duì)應(yīng)圖中的（a)、（b)、（c)和（d)。
[0013] 圖2為實(shí)施例2中化合物15對(duì)MIF引起的巨噬細(xì)胞趨化迀移的影響效果圖。
[0014] 圖3為實(shí)施例3中化合物15對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的敏感性效果圖。
[0015] 圖4為實(shí)施例4中化合物15、18、113和I15對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)炎性因子的影 響效果圖。
[0016] 圖5為實(shí)施例5中化合物15對(duì)MIF刺激的RAW264. 7巨噬細(xì)胞中ERK活化的影響 效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面將結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做出進(jìn)一步的描述。
[0018] 實(shí)施例1 :化合物對(duì)MIF的酶抑制活性實(shí)驗(yàn)。
[0019] 實(shí)驗(yàn)原理：MIF具有多巴色素互變異構(gòu)酶活性，可以將橙色的D，L型多巴色素甲 醋轉(zhuǎn)化為無(wú)色的11引噪衍生物，吸光度采用TecanInfiniteM1000酶標(biāo)儀在475nm波長(zhǎng)下 進(jìn)行3分鐘吸光度測(cè)試。
[0020] 實(shí)驗(yàn)試劑的準(zhǔn)備：脂多糖(大腸桿菌血清型〇55:B5)、（L)-3, 4-二羥基苯丙酮酸甲 酯和高碘酸鈉購(gòu)買(mǎi)自西格瑪奧德里奇(美國(guó)密蘇里州東部城市圣路易斯）；（S，R) -3- (4-羥 苯基）-4, 5-二氫-5-異惡唑乙酸甲酯（IS0-1)為MIF的典型抑制劑，購(gòu)買(mǎi)自德國(guó)Merck公 司旗下的生化試劑品牌Calbiochem公司，在這里作為陽(yáng)性對(duì)照；將化合物溶解在IOmM的 DMSO儲(chǔ)備溶液中，最后在緩沖液中DMSO的濃度低于0. 25%情況下，將RAW264. 7巨噬細(xì)胞 在37°C條件下添加5%熱滅活胎牛血清（Fetalbovineserum，F(xiàn)BS)，慶大霉素（50g/ml)和 5%(1)2的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco'smodifiedEagle'smedium，DMEM)中生 長(zhǎng)和維持，重組人類(lèi)MIF在大腸桿菌中表達(dá)，并且進(jìn)行純化。
[0021] 實(shí)驗(yàn)步驟：為了制備（L)-多巴色素甲醋，將等體積L-3, 4-二羥基苯甲基丙氨酸甲 酯（4mM)和高碘酸鈉（IOmM)混合，并且在室溫下培養(yǎng)3~5分鐘，然后將（L)-多巴色素甲酯 (30yL)添加到包含重組人類(lèi)MIF(120nM)和IOmM磷酸鉀緩沖液的96孔板中，另外添加 0. 5mMEDTA并保持pH=6. 2。為了測(cè)試化合物對(duì)MIF互變異構(gòu)酶活性的抑制效應(yīng)，將濃度為 1、 5、10、25、50和100yM的化合物分別添加到包含重組人類(lèi)MIF( 120nM)的96孔板中，在添 加（L)-多巴色素甲酯之前培養(yǎng)30分鐘，將孔板中的氣泡去掉，采用TecanInfiniteMlOOO 酶標(biāo)儀在475nm波長(zhǎng)下進(jìn)行3分鐘吸光度測(cè)試。
[0022] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：將濃度為1、5、10、25、50和100 11|1的^(苯基氨基硫代甲?；┍郊?酰胺類(lèi)化合物進(jìn)行MIF的酶抑制活性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)化合物具有較好的抑制活性，其半 抑制濃度TIC5tl見(jiàn)表1，其中化合物15、18、1 13和I15的11(：5(|曲線圖參見(jiàn)圖1。
[0023] 表1.化合物對(duì)MIF互變異構(gòu)酶的抑制活性（TIC5tl)以及TIC5Q〈10yM的化合物對(duì) LPS誘導(dǎo)的RAW264. 7巨噬細(xì)胞分泌NO的影響（NIC5tl)
[0024] 對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264. 7巨噬細(xì)胞分泌NO的影響（NIC5tl) [0023]實(shí)施例2 :化合 物對(duì)MIF引起的巨噬細(xì)胞趨化迀移的影響。
[0025] 實(shí)驗(yàn)原理：MIF對(duì)巨噬細(xì)胞有趨化迀移作用，抑制劑作用于MIF，可以在一定程度 上抑制MIF引起的巨噬細(xì)胞的趨化迀移。
[0026] 實(shí)驗(yàn)步驟：將重組人類(lèi)MIF在添加或者缺失MIF互變異構(gòu)酶抑制劑的情況下，分別 置于CM-16板的下室，然后在上室將RAW264. 7巨噬細(xì)胞接種于包含20000個(gè)細(xì)胞的無(wú)血 清培養(yǎng)基中。