千層紙素苷在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于抗腫瘤藥領(lǐng)域，涉及千層紙素苷在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多階段復雜的過程，其中包括腫瘤細胞的脫落、迀移、黏附、生長等，每一階段都受著不同因素的影響和調(diào)控，涉及到多種粘附分子、基質(zhì)蛋白酶、細胞因子以及相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導機制和相關(guān)的基因改變。如腫瘤細胞在轉(zhuǎn)移的早期依靠多種蛋白酶，尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶和尿激酶降解細胞外基質(zhì)和基底膜。隨后，腫瘤細胞借助不同粘附分子作用產(chǎn)生的外力和自身的一些運動相關(guān)蛋白而脫離原來的組織，侵入血管或淋巴管內(nèi)并游向遠處器官和組織，此時粘附分子協(xié)助腫瘤細胞附壁并最終游出管壁，從而形成一個轉(zhuǎn)移灶。但是，并不是所有的抗腫瘤藥都是通過抗腫瘤轉(zhuǎn)移機制發(fā)揮作用的，有些藥物對原發(fā)病灶具有較好的治療效果，但沒有抑制腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的作用，有些藥物有較好的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用，但對原發(fā)病灶腫瘤的治療作用不佳，比如只是影響腫瘤細胞的脫落、迀移、粘附等階段的某一因素，而沒有影響腫瘤細胞的生長，故可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移但不一定抑制腫瘤生長。另外，腫瘤的轉(zhuǎn)移與腫瘤細胞本身的生物學特性是有一定關(guān)系的，有些腫瘤如頭頸部腫瘤以局部浸潤和復發(fā)為主，鮮有轉(zhuǎn)移，而某些腫瘤如小細胞肺癌、骨肉瘤等則極易發(fā)生轉(zhuǎn)移。另外，腫瘤的類型不同，轉(zhuǎn)移的途徑亦不同，一般來說，癌以淋巴道轉(zhuǎn)移多見，而肉瘤則以血道轉(zhuǎn)移為多見，有些腫瘤則通過種植轉(zhuǎn)移形式，這些差別均對腫瘤的治療與預后產(chǎn)生不同的影響，因此，合理選用相應(yīng)藥物是腫瘤成功治療的關(guān)鍵，能夠明確藥物屬于哪一類抗腫瘤藥有助于針對不同類型的腫瘤進行合理用藥。
[0003]千層紙素是黃芩的活性組分之一，具有明顯的抗腫瘤作用，是一個具有廣闊應(yīng)用前景的天然抗腫瘤藥物。然而，千層紙素藥理作用廣泛，其抗腫瘤作用的機制目前尚未完全闡明。千層紙素A-7-葡萄糖醛酸苷(千層紙素苷，Oroxyloside, 0AG)也是黃芩的活性組分之一，與千層紙素并非同一物質(zhì)，目前對千層紙素苷的研宄較少，相關(guān)藥理作用的研宄尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供千層紙素苷在制備抗腫瘤藥中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)措施實現(xiàn)的:
[0006]千層紙素苷在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥中的應(yīng)用，尤其是針對肝癌的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥，其發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的機制是千層紙素苷針對腫瘤細胞具有抑制腫瘤細胞侵襲和迀移的能力。其制劑可以是藥學上允許的任意一種劑型，包括但不限于片劑、顆粒劑、丸劑、口服液、注射劑、膜劑、膠囊劑、脂質(zhì)體等。千層紙素苷的用量可根據(jù)用藥途徑、患者年齡、體重、體表面積、所治療的疾病類型和嚴重程度及療程安排等變化，其日劑量可以是200-8000mg，可以一次或多次施用。
[0007]本發(fā)明有益效果:
[0008]千層紙素苷具有較好的抑制腫瘤細胞侵襲和迀移的能力，可用于制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物，可制備成各種劑型的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物，為腫瘤病人提供了更好的選擇。
【附圖說明】
[0009]圖1.0AG對人肝癌細胞H印G2迀移的影響。
[0010]圖2.0AG對人肝癌細胞H印G2侵襲的影響。
【具體實施方式】
[0011]以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。
[0012]藥效實施例1:0AG對人肝癌細胞H印G2迀移的影響(細胞迀移實驗)
[0013]1、實驗材料
[0014]⑴藥物
[0015]千層紙素A-7-葡萄糖醛酸苷(千層紙素苷，0roxyloside，0AG)從市場購得，淺黃色粉末。含量:90%，用DMSO配成母液，置于-20°C保存。臨用前用RPM1-1640培養(yǎng)液配成所需濃度。
[0016]⑵細胞株
[0017]人肝癌細胞!fepG2來自中國科學院上海生命科學研宄所生物化學與細胞生物學研宄所細胞庫，用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。
[0018](3)試劑
[0019]I)培養(yǎng)液:RPM1-1640培養(yǎng)基，美國GIBCO公司產(chǎn)品。取RPM1-1640粉末10.4g溶于100mL滅菌三蒸水中，用似!10)3調(diào)pH值至7.3?7.4，圓筒式過濾器過濾除菌、分裝，4°C冰箱保存。使用前加入10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L鏈霉素。
[0020]2)小牛血清:杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品。經(jīng)56°C水浴滅活30min，分裝并保存于-20 °C低溫冰箱中。
[0021]3) PBS 緩沖液:稱取 NaCl 8.0g, KCl 0.20g、Na2HPO4.H2O 1.56g、ΚΗ2Ρ042.0g，溶于100mL三蒸水中，高壓滅菌，4°C冰箱保存。
[0022]4) 0.02% EDTA溶液:稱取EDTA 20mg，溶于10mL PBS緩沖液中，低速攪拌，調(diào)pH值至7.3?7.4，圓筒式過濾器過濾除菌、分裝，4°C冰箱保存。
[0023]5)0.25%胰酶:稱取胰酶0.25g，溶于10mL PBS緩沖液中，高壓滅菌。
[0024]6)DMSO 溶液:美國 Sigma-Aldrich (St.Louis, Mo)公司產(chǎn)品
[0025]2、實驗儀器:
[0026]I)YJ-875型醫(yī)用凈化工作臺:蘇州凈化設(shè)備廠生產(chǎn)。
[0027]2)3111型水套式CO2培養(yǎng)箱:美國Thermo electron公司產(chǎn)品。
[0028]3)01ympusIX51型倒置焚光顯微鏡:日本Olympus公司產(chǎn)品。
[0029]4)電子天平:北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品。
[0030]5)LD4-2普通離心機:北京醫(yī)用離心機廠產(chǎn)品。
[0031]6) Centrifuge 5810R 型離心機:德國 Eppendorf 公司產(chǎn)品。
[0032]3、實驗方法:
[0033]將H印G2消化接種到6孔板，培養(yǎng)到密度90%時準備劃痕。用一個10 μ I的塑料小槍頭在細胞達到要求的孔中央劃一條直線，直線應(yīng)同等粗細。劃完后，用PBS把飄起的細胞洗掉。各孔相應(yīng)加入含不同濃度千層紙素苷(50μΜ，100μΜ，200 μΜ)的培養(yǎng)基后，放入37 0C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于Oh，12h，24h，36h，48h對各劑量組劃痕進行拍照。不同時間點拍照片，直觀地觀察HepG2在給予千層紙素苷處理前后迀移距離的變化，結(jié)果見圖1。
[0034]4、實驗結(jié)果
[0035]由圖1可見，千層紙素苷能抑制肝癌細胞H印G2迀移，并呈一定的時間和濃度依賴性。
[0036]藥效實施例2:對人肝癌細胞H印G2侵襲的影響(細胞侵襲實驗)
[0037]1、實驗材料
[0038](I)藥物
[0039]千層紙素A-7-葡萄糖醛酸苷(千層紙素苷，Oroxyloside，OAG)從市場購得，淺黃色粉末。含量:90%，用DMSO配成母液，置于-20°C保存。臨用前用RPM1-1640培養(yǎng)液配成所需濃度。
[0040]⑵細胞株
[0041]人肝癌細胞H印G2來自中國科學院上海生命科學研宄所生物化學與細胞生物學研宄所細胞庫，用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。
[0042](3)試劑
[0043]I)培養(yǎng)液:RPM1-1640培養(yǎng)基，美國GIBCO公司產(chǎn)品。取RPM1-1640粉末10.4g溶于100mL滅菌三蒸水中，用似!10)3調(diào)pH值至7.3?7.4，圓筒式過濾器過濾除菌、分裝，4°C冰箱保存。使用前加入10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L鏈霉素。
[0044]2)小牛血清:杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品。經(jīng)56°C水浴滅活30min，分裝并保存于-20 °C低溫冰箱中。
[0045]3) PBS 緩沖液:稱取 NaCl 8.0g、KCl 0.20g、Na2HPO4.H2O 1.56g、ΚΗ2Ρ042.0g,溶于100mL三蒸水中，高壓滅菌，4°C冰箱保存。
[0046]4) 0.02% EDTA溶液:稱取EDTA 20mg，溶于10mL PBS緩沖液中，低速攪拌，調(diào)pH值至7.3?7.4，圓筒式過濾器過濾除菌、分裝，4°C冰箱保存。
[0047]5)0.25%胰酶:稱取胰酶0.25g，溶于10mL PBS緩沖液中，高壓滅菌。
[0048]6) DMSO 溶液:美國 Sigma-Aldrich (St.Louis, Mo)公司產(chǎn)品。
[0049]7)蘇木精；伊紅；固定液(甲醇)。
[0050]2、實驗儀器:
[0051]l)YJ-875型醫(yī)用凈化工作臺:蘇州凈化設(shè)備廠生產(chǎn)。
[0052]2)3111型水套式CO2培養(yǎng)箱:美國Thermo electron公司產(chǎn)品。
[0053]3)01ympusIX51型倒置焚光顯微鏡:日本Olympus公司產(chǎn)品。
[0054]4)電子天平:北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品。
[0055]5)LD4-2普通離心機:北京醫(yī)用離心機廠產(chǎn)品。
[0056]6) Centrifuge 5810R 型離心機:德國 Eppendorf 公司產(chǎn)品。
[0057]7) transwell 小室；24 孔板。
[0058]3、實驗方法:
[0059]細胞懸液分瓶加藥處理。HepG2點入6孔板中，待密度為60%時，分別給予千層紙素苷(25 μ Μ, 50 μ Μ, 100 μ M ;200 μ Μ)，放入細胞培養(yǎng)箱中 48ho 稀釋 matrigel (matrigel:無血清培養(yǎng)基=I:8)，每小室加入100 μ I以稀釋好的matrigel，37°C靜置30min以上，造模。消化經(jīng)千層紙素苷處理過的IfepG2細胞，用無血清的培養(yǎng)基重懸，將其稀釋成2 X 15個細胞/ml。取出transwell小室放入24孔板孔中。每孔已有600 μ I含有血清的培養(yǎng)基，小室上層加入細胞懸液400 μ I。放入孵箱培養(yǎng)4h。取出小室，用棉簽擦去微孔濾膜內(nèi)側(cè)未穿過的細胞。固定液固定2分鐘，純水清洗。蘇木精染色15分鐘，純水清洗；伊紅染色20秒，吹水清洗，棉簽擦干。顯微鏡下取左右上下中五個視野，拍照，取平均值，結(jié)果見圖2。
[0060]4、實驗結(jié)果:
[0061]由圖2可見，千層紙素苷能抑制肝癌細胞HepG2侵襲，并呈濃度依賴性。
[0062]結(jié)論:千層紙素苷具有抑制腫瘤細胞侵襲和迀移的能力。
[0063]制劑實施例1
[0064]取千層紙素苷10g，加入注射劑(包括凍干粉針劑和無菌分裝干粉針劑)適當輔料，按注射劑(包括凍干粉針劑和無菌分裝干粉針劑)工藝制備成抗腫瘤藥注射劑，每支含千層紙素苷500mg。
[0065]制劑實施例2
[0066]取千層紙素苷10g，加入片劑(包括緩控釋片，骨架片，包衣片，分散片等)適當輔料，按片劑(包括緩控釋片，骨架片，包衣片，分散片等)工藝制備成抗腫瘤藥片劑，每片含千層紙素苷300mg。
[0067]制劑實施例3
[0068]取漢千層紙素苷10g，加入膠囊劑適當輔料，按膠囊劑工藝制備成抗腫瘤藥膠囊，每粒含千層紙素苷300mg。
[0069]制劑實施例4
[0070]取千層紙素苷10g，加入口服液適當輔料，按口服液工藝制備成抗腫瘤藥口服液，每支含含千層紙素苷300mg。
【主權(quán)項】
1.千層紙素苷在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤是肝癌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的抗腫瘤轉(zhuǎn)移是指抑制腫瘤細胞侵襲和迀移。
【專利摘要】本發(fā)明屬于抗腫瘤藥領(lǐng)域，公開了千層紙素苷在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明提出了千層紙素苷在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥中的應(yīng)用，可將千層紙素苷制備成各種劑型的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物，為腫瘤病人提供了更好的選擇。
【IPC分類】A61P35-04, A61K31-7048
【公開號】CN104721210
【申請?zhí)枴緾N201510114766
【發(fā)明人】郭青龍, 魏立彬, 盧娜, 趙麗, 周煜新, 李志裕
【申請人】中國藥科大學
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年3月16日