下，經(jīng)口氣管插管，接小動(dòng)物呼吸機(jī)，潮氣量2-3ml，吸呼比I : 2,呼吸頻率60次 /分。沿左胸骨第4~5肋間開胸。暴露心臟并打開心包，在左心耳和右心室流出道之間 以6. 0無(wú)創(chuàng)絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，肉眼觀察前降支供血區(qū)變蒼白，心電圖導(dǎo)聯(lián)ST段 弓背向上抬高，提示AMI手術(shù)成功，然后擠壓胸腔以排出空氣并逐層關(guān)閉胸腔，術(shù)后經(jīng)腹腔 注射慶大霉素2. 4X IO4U. Kg' cf1，共3日，預(yù)防感染。
[0039] AMI術(shù)后4周存活51只，將這些大鼠隨機(jī)分為慢性心力衰竭組（η= 10只，簡(jiǎn)稱為 C組），本發(fā)明藥物高、中、低劑量治療組（n = 11，11，10只，分別簡(jiǎn)稱為Ql、Q2和Q3組），呋 塞米治療組（η = 9,只簡(jiǎn)稱為F組），假手術(shù)組（η = 10只，簡(jiǎn)稱為S組）為僅穿線而未行冠 狀動(dòng)脈結(jié)扎大鼠，各組大鼠經(jīng)苦味酸標(biāo)記，置于代謝籠飼養(yǎng)，待適應(yīng)3日后，開始藥物灌胃， 本發(fā)明藥物粉〇. 3、0. 6、I. 2g溶于2ml去離子水中灌胃，呋塞米組藥物劑量為4mg. kg4，假手 術(shù)組、慢性心衰組大鼠給予生理鹽水2ml灌胃，收集大鼠24小時(shí)尿液并記錄尿量，大鼠灌胃 4周后，稱量大鼠體重，行超聲心動(dòng)圖和血液動(dòng)力學(xué)檢查，然后處死大鼠，采集血液和組織標(biāo) 本。
[0040] I. 2. 2尿液收集和尿滲量的測(cè)定
[0041] 記錄大鼠代謝籠內(nèi)24h尿量，所收集尿液在4°C條件，3000r/min離心10min，去除 細(xì)胞殘骸和食物殘?jiān)?，然后用冰點(diǎn)抑制法測(cè)定尿滲量。
[0042] 1.2.3超聲心動(dòng)圖檢查
[0043] 用彩色Doppler超聲顯像儀，M型曲線在左室短軸乳頭肌水平測(cè)量，測(cè)定大鼠舒張 期左室前壁厚度（AWTd)、后壁厚度（PWTd)、左室舒張末內(nèi)徑（LVEDd)及收縮末內(nèi)徑（LVESd) 等指標(biāo)，計(jì)算出射血分?jǐn)?shù)（EF)、短軸收縮率（FS)等數(shù)值，以連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期測(cè)量值的平均 值作為最后的檢測(cè)數(shù)據(jù)，用MO盤儲(chǔ)存資料，專人分析。
[0044] 1. 2. 4血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測(cè)定
[0045] 戊巴比妥鈉（30mg. kg，腹腔麻醉下，鈍性分離大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈，聚乙烯導(dǎo)管系 統(tǒng)充滿0. 3%肝素生理鹽水以抗凝血，將導(dǎo)管插入頸動(dòng)脈、升主動(dòng)脈，穩(wěn)定IOmin后，應(yīng)用多 道生理儀記錄平均動(dòng)脈壓（MBP)，然后繼續(xù)送入導(dǎo)管，直至出現(xiàn)左心室壓力曲線后，保持血 流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定15min時(shí)，分別記錄左室收縮末壓（LVESP)、左室舒張末壓（LVEDP)、左室內(nèi)壓 最大上升速率（+dp/dtmax)、左室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dtmax)等指標(biāo)，取3次測(cè)定結(jié)果 的平均值作為實(shí)驗(yàn)值，所有電信號(hào)均用計(jì)算機(jī)軟件分析處理。
[0046] L 2. 5免疫熒光
[0047] 大鼠腎臟髓質(zhì)標(biāo)本快速冷凍后，經(jīng)恒溫冷凍切片，片厚3 μπι。冷凍切片在空氣中 自然干燥，加入含30mg/L Triton Χ-100的PBS室溫放置30min，經(jīng)兔抗大鼠 AQP2 (稀釋度 為1 : 200) 4°C孵育12h后，用FITC標(biāo)記的山羊抗兔（稀釋度為1 : 200) IgG抗血清室溫 避光孵育2h。最后用甘油與PBS(1 : 1)的混合液封片。每步驟后均用0.01m〇l/L PBS(pH 7.4)充分洗滌。自然風(fēng)干后，熒光顯微鏡下觀察。
[0048] 1. 2. 6實(shí)時(shí)熒光定量法（qPCR)檢測(cè)大鼠腎臟髓質(zhì)AQP2mRNA表達(dá)
[0049] 用 Trizol 抽提的大鼠腎臟組織總 RNA 1 μ g，按照 First Strand cDNA Synthesis Kit的操作流程用Olig0(KT)18進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得單鏈cDNA。同時(shí)定量PCR的引物設(shè)計(jì)參考基 因在NCBI標(biāo)準(zhǔn)序列，利用Primer Premier 5進(jìn)行跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)，其中Aqp2(NM_012909. 2) 上游引物：5' -ggttgctccatgaatccag-3'，下游引物：5' -ggttgctccatgaatccag-3' ； 內(nèi)參照 GAPDH(NM_017008. 3)上游引物：5' -ggaccaggttgtctcctgtg-3'，下游引物： 5' -tgtaggccatgaggtccac-3'。整個(gè)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)在iQ5?熒光定量PCR儀 (BIO-RAD)上完成，反應(yīng)體系為20 μ 1，包含上下游引物各0.4 yM，2XAllinone? Q-PCR Mix(GeneCopoeia) 10 μ 1，模板 cDNA 0· 5 μ 1。PCR 循環(huán)條件設(shè)置為 95°C預(yù)變性 10min，95°C 變性10s，57°C退火20s，72°C延伸15s并讀熒光，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)基因做3個(gè)復(fù)管，PCR 產(chǎn)物的特異性通過融解曲線分析確認(rèn)。所得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)內(nèi)對(duì)照GAPDH歸一化處理后用 Δ Δ Ct法進(jìn)行Aqp2和NKCC2的表達(dá)量分析。
[0050] I. 2. 7 Western blot檢測(cè)大鼠腎臟髓質(zhì)AQP2蛋白的表達(dá)
[0051] 取腎臟髓質(zhì)l〇〇mg，剪碎后加入I. 5ml含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液（50mmol/L Tris-HCl，ρΗ7· 4, lOmmol/LEDTA，ρΗ7· 2,1 %去氧膽酸鈉，0· 6mmol/L PMSF，4 μ mol/L 亮抑制 肽，lOOkU/L抑肽酶），冰上裂解腎臟髓質(zhì)10min，lOOOOr/min低溫離心15min，取上清裝入 EP管中，總蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。取蛋白質(zhì)樣品每份10 μ 1，加等量樣本處理液， KKTC煮沸5min，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，然后用含5% 脫脂牛奶的TBS-T封閉2h，加入兔抗鼠 AQP2多克隆抗體（I : 500)孵育，4°C過夜，洗膜液 洗滌劑5min，共3次，加入辣根過氧化物酶（HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG(l : 5000)孵育lh，洗膜 液洗5min，共3次，然后顯影并壓片曝光，結(jié)果用圖像分析系統(tǒng)測(cè)定蛋白質(zhì)條帶相對(duì)吸光度 比值（Α)/β -actin比值。
[0052] 1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0053] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（X土s)表示，應(yīng)用SPSS 11. 5軟件包行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 組間比較采用方差分析。P < 0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P < 0. 01為差異有非常顯著意 義。
[0054] 2 結(jié)果
[0055] 2. 1各組大鼠心臟功能的變化（見表1和表2)
[0056] 表1各組大鼠心臟超聲心動(dòng)圖變化（X土s)
[0057]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種中藥組合物在制備治療急性心肌梗死的藥物中的應(yīng)用，所述中藥組合物由如下 重量份的原料藥制成： 黃芪450g、附子112. 5g、人參225g、丹參225g、葶藶子150g、香加皮180g、澤瀉225g、紅 花90g、玉竹75g、陳皮75g、桂枝90g， 該藥物的制備方法： (1) 將黃芪、葶藶子、澤瀉、人參、香加皮按照上述處方加8倍量70%乙醇回流提取2 次，第一次3小時(shí)，第二次2小時(shí)，合并提取液，濾過，濾液減壓回收乙醇，濃縮至60°C測(cè)定相 對(duì)密度為1. 25-1. 30的清膏，備用； (2) 桂枝、陳皮按照比例蒸餾提取揮發(fā)油，提油后的水溶液濾過，備用，殘?jiān)偌?倍量 水煎煮1小時(shí)，濾過，合并水溶液，備用； (3) 附子、丹參、玉竹、紅花加水9倍量煎煮2次，每次2小時(shí)，合并提取液，濾過，與步 驟（2)中桂枝、陳皮水溶液合并，濃縮至60°C測(cè)定相對(duì)密度為1. 25-1. 30清膏，攪拌中加入 乙醇，至醇濃度70%，4°C以下靜置24小時(shí)，濾過，濾液減壓回收乙醇，濃縮至60°C測(cè)定相對(duì) 密度為1. 25-1. 30清膏，與步驟（1)的醇提清膏混合，65-70°C烘干； (4) 干膏混合粉碎成100目粉，加70%乙醇適量制粒，噴入桂枝、陳皮揮發(fā)油，混勻，裝 膠囊，即得； 其特征在于所述藥物具有降低尿滲量的作用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物具有改善心功能的作用。
3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物具有降低腎臟水通道蛋白2表達(dá)的 作用。
4. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物具有降低血漿血管加壓素的作用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種中藥組合物在制備治療急性心肌梗死的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中藥組合物由黃芪、人參、丹參等11味中藥組成，以益氣溫陽(yáng)藥為治絡(luò)強(qiáng)心之本，輔以活血通絡(luò)藥，使氣旺血行絡(luò)通，阻斷血瘀絡(luò)阻。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，本發(fā)明中藥組合物可以顯著降低尿滲量，改善心臟功能。
【IPC分類】A61P13-12, A61P9-12, A61P43-00, A61K9-48, A61P9-10, A61K36-8969, A61K35-64
【公開號(hào)】CN104666893
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410775655
【發(fā)明人】李向軍, 安軍永
【申請(qǐng)人】河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司
【公開日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2009年6月10日