一種角膜組織修復(fù)材料及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種角膜組織修復(fù)材料及其制備方法，具體涉及到一種制備具有一面致密，而另一面具有多孔結(jié)構(gòu)的生物材料的制備方法。本發(fā)明所得的材料可應(yīng)用于受損角膜組織的修復(fù)和替代。
【背景技術(shù)】
[0002]角膜疾病是一種十分常見的眼科病，約有三分之一的失明患者是由于角膜疾病而導(dǎo)致的。由于角膜的內(nèi)皮細(xì)胞是不能自動(dòng)修復(fù)或替代的，因此這些角膜疾病患者必須通過手術(shù)用供體的健康角膜來替代其損傷角膜，這就導(dǎo)致了對(duì)眼庫角膜的極大需求量。但是由于健康的捐贈(zèng)角膜的數(shù)量遠(yuǎn)少于角膜移植的需求量，所以人工角膜的研發(fā)就顯得十分必要。
[0003]人工角膜發(fā)展最快的就是其材料的發(fā)展，目前制備人工角膜修復(fù)材料的方法有很多，大多數(shù)都集中在玻璃，聚甲基丙烯酸甲酯，水凝膠，硅凝膠，丙烯酸酯，多孔聚四氟乙烯等材料上。羧甲基殼聚糖(CMC)是甲殼素的一種重要衍生物，其穩(wěn)定的理化性質(zhì)以及抗菌，抗感染，抗病毒和抗腫瘤等藥理作用決定了它在醫(yī)藥、化工、環(huán)保、保健品等領(lǐng)域有著廣泛的用途。明膠(Gel)是一種水溶性蛋白質(zhì)混合物，由皮膚、韌帶和肌腱中的膠原經(jīng)酸或堿部分水解或在水中煮沸而產(chǎn)生，它具有極其優(yōu)良的物理性質(zhì)，如膠凍力、高度分散性、低粘度特性、分散穩(wěn)定性、持水性、韌性及可逆性等，被大量應(yīng)用于醫(yī)用軟硬膠囊、外科敷料、止血海棉、罐頭、肉凍、食品添加劑、糖果、火腿腸等行業(yè)。膠原(Col)是是細(xì)胞外最重要的水不溶性纖維蛋白，在動(dòng)物細(xì)胞中扮演結(jié)合組織的角色，是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的骨架，膠原在細(xì)胞外基質(zhì)中形成半結(jié)晶的纖維，給細(xì)胞提供抗張力和彈性，并在細(xì)胞的迀移和發(fā)育中起作用，膠原是生物科技產(chǎn)業(yè)最重要的原材料之一，其應(yīng)用領(lǐng)域包括生物醫(yī)用材料、化妝品和食品工業(yè)等。
[0004]理想的人工角膜應(yīng)該是一種上皮化的“人工供體角膜”，能像角膜移植術(shù)一樣被植入。這樣的人工角膜材料應(yīng)該具有透明的光學(xué)中央部分和與角膜類似的柔韌性，材料在縫合處應(yīng)有足夠的強(qiáng)度。人工角膜在植入后，其前部表面應(yīng)能上皮化，而鏡柱前表面則要求不被上皮細(xì)胞覆蓋。人工角膜異質(zhì)材料與角膜組織之間的長期緊貼，透明以及生物相容性是其植入成敗的關(guān)鍵因素，所以材料表面能否上皮化顯得十分關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種簡單有效的角膜組織修復(fù)材料的方法。本發(fā)明采用羧甲基殼聚糖，明膠和從牛筋中提取的I型膠原，按照一定的比例，經(jīng)過共混交聯(lián)，冷凍干燥、壓片、涂覆和風(fēng)干等工藝成型，得到一面致密，而另一面有孔的結(jié)構(gòu)梯度分布材料，材料本體無明顯的界面層，且在水中浸泡后不發(fā)生分層。本材料與天然角膜具有相似的光學(xué)和力學(xué)性能，材料在縫合處應(yīng)有足夠的強(qiáng)度。角膜上皮細(xì)胞可以在本材料的多孔面上粘附、增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，使材料的多孔面上皮化，而致密的一面則可以阻止角膜上皮細(xì)胞通過前彈力層向基質(zhì)層迀移，從而獲得具有仿生結(jié)構(gòu)的人工角膜組織。
[0006]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0007]一種角膜組織修復(fù)材料的制備方法，包括以下步驟:
[0008](I)將羧甲基殼聚糖和明膠原料溶解，抽濾純化，用去離子水分別配制羧甲基殼聚糖溶液和明膠溶液；然后混合得共混溶液，加入交聯(lián)劑，在37°C水浴鍋中攪拌24小時(shí)，將交聯(lián)后的溶液澆鑄到模具中；
[0009](2)將步驟(I)所澆鑄的模具中的溶液在_20°C下預(yù)凍4小時(shí)，然后在_80°C條件下預(yù)凍24小時(shí)以上，然后真空冷凍干燥48小時(shí)以上；
[0010](3)將步驟(2)所得的冷凍干燥產(chǎn)物進(jìn)行壓片，即得到角膜組織修復(fù)材料的多孔層；
[0011](4)在步驟(3)所得多孔層材料的一面涂覆含交聯(lián)劑的膠原溶液，涂層膜在室溫下自然風(fēng)干后，即得到角膜組織修復(fù)材料。
[0012]步驟(4)中所述膠原溶液是將從牛筋中提取的I型膠原純化，用乙酸溶液配制的膠原溶液。
[0013]所述膠原溶液中膠原的質(zhì)量體積濃度為6.0?10.0mg/mlo
[0014]步驟⑴中所述的羧甲基殼聚糖溶液中的羧甲基殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2?5%，明膠溶液中明膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3?6%。
[0015]步驟(I)、(4)所述交聯(lián)劑為1-乙基-3 (3- 二甲基氨丙基)碳化二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺的水溶液，1-乙基-3 (3- 二甲基氨丙基)碳化二亞胺與N-羥基丁二酰亞胺的質(zhì)量比為4:1。
[0016]步驟⑴所述明膠與1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺的質(zhì)量比為6:1 ;步驟(4)所述含交聯(lián)劑的膠原溶液中的膠原與1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺的質(zhì)量比為6:1。
[0017]在步驟(I)中所述共混溶液中羧甲基殼聚糖與明膠的質(zhì)量比為(1.5?3.0): (7.0 ?8.5)。
[0018]在步驟(I)中所述的共混溶液中還加有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或透明質(zhì)酸(HA)，共混溶液中羧甲基殼聚糖、明膠與聚乙烯吡咯烷酮或透明質(zhì)酸的質(zhì)量比為(1.5?3.0): (7.0 ?8.5): (0.5 ?1.1)。
[0019]步驟(3)中所述進(jìn)行壓片的壓力為lOMpa，保持此壓力I分鐘以上。
[0020]上述方法制備的角膜組織修復(fù)材料的一面致密，而另一面具有多孔結(jié)構(gòu)。
[0021]本發(fā)明采用羧甲基殼聚糖，明膠和從牛筋中提取的高純度I型膠原，按照一定的比例，經(jīng)過共混交聯(lián)，冷凍干燥、壓片、涂覆和風(fēng)干等工藝成型，得到一面致密，而另一面有孔的結(jié)構(gòu)梯度分布材料，材料本體無明顯的界面層，且在水中浸泡后不發(fā)生分層。本發(fā)明提出的角膜組織修復(fù)材料的生物相容性良好，角膜上皮細(xì)胞可以在本材料的多孔面上粘附、增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，使材料的多孔面上皮化，而致密的一面則可以阻止角膜上皮細(xì)胞通過前彈力層向基質(zhì)層迀移，從而獲得具有仿生結(jié)構(gòu)的人工角膜組織。
[0022]與國內(nèi)外現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0023](I)本發(fā)明制備了具有一面多孔，而另一面致密的結(jié)構(gòu)的角膜組織修復(fù)材料，材料本體無明顯的界面層，且在水中浸泡后不發(fā)生分層。
[0024](2)本發(fā)明所制備的材料具有與天然角膜組織類似的理化性能和生物學(xué)性能，可用于醫(yī)療領(lǐng)域中受損角膜組織的修復(fù)和替代。
[0025](3)本發(fā)明所采用的成型工藝簡單，成本較低，有利于規(guī)模生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0026]圖1是實(shí)施例1制得的CMC-Gel涂層膠原膜材料多孔面的光學(xué)顯微鏡照片(X350)。
[0027]圖2是實(shí)施例1制得的CMC-Gel涂層膠原膜材料致密面的光學(xué)顯微鏡照片(X350)。
[0028]圖3是實(shí)施例2制得的CMC-Gel-PVP涂層膠原膜材料多孔面的光學(xué)顯微鏡照片(X350)。
[0029]圖4是實(shí)施例2制得的CMC-Gel-PVP涂層膠原膜材料致密面的光學(xué)顯微鏡照片(X350)。
[0030]圖5是實(shí)施例3制得的CMC-Gel-HA涂層膠原膜材料多孔面的光學(xué)顯微鏡照片(X350)。
[0031]圖6是實(shí)施例3制得的CMC-Gel-HA涂層膠原膜材料致密面的光學(xué)顯微鏡照片(X350)。
[0032]圖7是人眼角膜上皮細(xì)胞在實(shí)施例1制得的CMC-Gel涂層膠原膜材料表面生長的照片。
【具體實(shí)施方式】
[0033]為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地說明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于提到的實(shí)施例表示的范圍。
[0034]實(shí)施例1
[0035]以羧甲基殼聚糖(CMC)和明膠(Gel)和膠原(Col)為原料，制備一種CMC-Gel涂層膠原膜材料。這種CMC-Gel涂層膠原膜材料的制備步驟如下:
[0036](I)將羧甲基殼聚糖(CMC)和明膠(Gel)原料溶解，抽濾純化后，用去離子水分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的羧甲基殼聚糖溶液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的明膠溶液；將從牛筋中提取的I型膠原純化，用乙酸溶液配制濃度為6mg/mL的膠原溶液；
[0037](2)按照羧甲基殼聚糖與明膠的質(zhì)量比為1.5:8.5配制兩者的共混溶液，加入EDC-NHS溶液(EDC:NHS = 4:1)進(jìn)行交聯(lián)，羧甲基殼聚糖-明膠溶液中的明膠與E