異種角膜材料的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種異種角膜材料的制備方法，該方法能夠制備出透明性極高、低免疫原性、生物活性和生物相容性好的異種角膜材料，且保持膠原三維結(jié)構(gòu)與新鮮角膜相近，并通過膠原交聯(lián)進(jìn)一步降低膠原的抗降解性和免疫原性。在制備全過程在保存、輻照和交聯(lián)中使用不同濃度甘油，合理利用不同濃度甘油的特點及作用效果，達(dá)到使其異種角膜植片透明、無病毒及細(xì)胞的特性，并在全眼球保存下使用交聯(lián)劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)交聯(lián)，使其形態(tài)更接近新鮮角膜，并增加其生物力學(xué)性能。本發(fā)明制備的角膜材料在角膜膠原纖維結(jié)構(gòu)的保存和移植后透明性能均有改善，能廣泛應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)。
【專利說明】異種角膜材料的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地說，它涉及一種能直接應(yīng)用于板層角膜移植的異種材料的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]角膜位于眼球前壁的一層透明膜，約占纖維膜的前1/6，從后面看角膜呈正圓形，從前面看為橫橢圓形。角膜是眼睛最前面的透明部分，覆蓋虹膜、瞳孔及前房，并為眼睛提供大部分屈光力，加上晶體的屈光力，光線便可準(zhǔn)確地聚焦在視網(wǎng)膜上構(gòu)成影像。
[0003]同時，因角膜透明性喪失而導(dǎo)致的角膜盲是僅次于白內(nèi)障的引起視力喪失的主要原因。眼外傷和角膜潰瘍每年使150萬~200萬的人們失明。對于這種失明唯一有效的治療是移植人類供體角膜(也稱作“角膜移植術(shù)”)。
[0004]目前，市場上角膜材料的短缺和需求之間的巨大差距，在異體角膜如此缺乏并短期內(nèi)難以改變的情況下，人們只能通過尋找各種方法來研制可替代的新材料來解決角膜的短缺問題。
[0005]已經(jīng)報道并通過驗證的新材料主要包括生物材料和異種角膜材料。按照現(xiàn)有的報道，生物材料的組織相容性差，尚不能在廣泛應(yīng)用；相比較而言，異種角膜材料具有更廣闊的應(yīng)用前景。目前的技術(shù)主要集中于使用蛋白酶(胰蛋白酶)或磷酸脂酶A2等化學(xué)方式去除異種角膜中的細(xì)胞。
[0006]問題是這些酶類 也會對膠原結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，對移植后的角膜細(xì)胞的長入也有一定的抑制作用，以往文獻(xiàn)也發(fā)現(xiàn)移植后早期的植片混濁是異種角膜材料主要的弊端，故上述的具體處理方法和制備方法還有較大的空間去優(yōu)化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種異種角膜材料的制備方法，該方法能夠制備出透明性極高、低免疫原性、生物活性和生物相容性好的異種角膜材料，且保持膠原三維結(jié)構(gòu)與新鮮角膜相近，并通過膠原交聯(lián)進(jìn)一步降低膠原的抗降解性和免疫原性。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案，處理步驟應(yīng)依次為:
一、處理:在動物死亡后四個小時內(nèi)獲取可作為異種角膜材料的眼球，依次用濃度為2%的碘伏和濃度為0.9%的生理鹽水來沖洗整個眼球，然后剪除眼球周圍的筋膜肌肉，接著用濃度為2%的碘伏沖洗整個眼球，沖洗完后再用濃度為0.9%的生理鹽水沖洗整個眼球；
二、滅菌:將整個眼球泡入含有40mg妥布霉素的50%高糖溶液IOml中，泡的時間為至少20分鐘，20分鐘后用濃度為0.9%的生理鹽水對整個眼球進(jìn)行沖洗；
三、細(xì)胞失活:將整個眼球轉(zhuǎn)入溶液中密封保存，保存過程中逐漸降溫，每分鐘降溫
2-3°C，最終在_78°C的溫度下進(jìn)行長期保存，所述保存期限至少為4周，所述溶液包括甘油和緩沖溶液，其中甘油濃度為85%至95%，緩沖溶液濃度為5~15% ；四、滅病毒:將已經(jīng)經(jīng)過密封保存的整個眼球轉(zhuǎn)至_20°C的保溫容器中，用Y射線進(jìn)行輻照，輻照劑量為25kGy ;
五、交聯(lián):將經(jīng)過輻照的整個眼球轉(zhuǎn)至含有20%至80%甘油的交聯(lián)劑中，在4°C的溫度下保存I至72小時，交聯(lián)劑選自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)，它們之間的質(zhì)量比為1:1至3:1 ；EDC在溶液中最終濃度為1.0%至10.0% ；
六、植片制作:將經(jīng)過交聯(lián)的整個眼球取出，放于林格氏液中清洗2次，每次5分鐘，清洗完成后沿眼球角膜緣后2毫米剪開，植片于角膜板層切削器中，切削器對角膜的切削厚度為 200 μ m 至 550 μ m。
[0009]本發(fā)明制備異種角膜材料的方法主要有四大特點。
[0010]第一個特點是使用全眼球保存，使用全眼球保存具有以下優(yōu)點:1、在步驟三中全眼球保存有效地保持了角膜膠原纖維中的三維結(jié)構(gòu)和角膜固有形態(tài)；并且甘油對角膜的脫水過程更加溫、緩慢和均勻，從而使膠原纖維的三維結(jié)構(gòu)免受快速而強烈脫水的破壞；2、在步驟五中全眼球交聯(lián)，在一定濃度的甘油保存下，眼球處于無脫水狀態(tài)，有效的維持角膜的原始形態(tài)、厚度、曲率，角膜膠原纖維的構(gòu)建和排列與新鮮角膜最為接近，在此狀態(tài)下進(jìn)行全眼球交聯(lián)，有效控制交聯(lián)的速度和強度，并在最接近角膜固有形態(tài)的條件下進(jìn)行緩慢而均勻的交聯(lián)，交聯(lián)后能有效保存角膜形態(tài)和膠原纖維構(gòu)象。上述原因使全眼球保存可以獲得與新鮮角膜更為接近的角膜形態(tài)、膠原纖維構(gòu)象，從而獲得更為透明的角膜板層材料。
[0011]第二個特點 是在保存、輻照和交聯(lián)中使用甘油。在步驟三中使用高濃度甘油(濃度為85~95%，其余5~15%使用緩沖溶液)有以下優(yōu)點:a.甘油首先是冷凍保護(hù)劑，甘油具有保護(hù)組織和細(xì)胞免受冷凍和復(fù)溫過程中的冰晶對細(xì)胞和組織損傷，可以有效保護(hù)角膜膠原纖維免受冷凍和復(fù)位的 影響，而且甘油無細(xì)胞毒性、分子量小、易溶于水，更容易洗脫；
b.甘油具有的強吸水作用，使角膜膠原有效地脫水。對膠原最佳的保存方法是脫水，與傳統(tǒng)的冷凍干燥相比，高濃度甘油脫水具有相似的脫水效果，在全眼球下甘油脫水可以有效的保持角膜膠原形態(tài)，并且同時使角膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞失活，降低細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，因此其脫水效果和優(yōu)勢遠(yuǎn)超過冷凍干燥法；c.甘油具有抗菌和病毒失活作用，已有文獻(xiàn)報道甘油的病毒失活作用與甘油濃度、保存時間成正比。85%甘油保存2周可以使動物DNA病毒和RNA病毒失活，本發(fā)明中高于85%的甘油保存4周以上可以有效使病毒失活，使得異種角膜材料更加安全；d.甘油具有保護(hù)膠原纖維的作用。已知Y射線可以使膠原纖維發(fā)生強烈破壞致角膜膠原纖維構(gòu)象改變，而國際公認(rèn)的25kGy的Y射線雖能有效的殺滅細(xì)菌和病毒，但如此強度的射線輻照對角膜膠原纖維的破壞是非常嚴(yán)重的，而本發(fā)明中使用甘油保存，使角膜膠原纖維有效避免高強度的Y射線破壞，并使之更加透明；
e.在交聯(lián)過程中使用具有吸水性甘油，中等濃度的甘油，有效避免角膜交聯(lián)過程中的膠原溶脹，溶脹使角膜膠原纖維直徑和膠原纖維間隙水腫增加而致角膜混濁，原因是角膜透明性與膠原纖維直徑和纖維間隙具有高度相關(guān)性；較高程度的溶脹更使膠原纖維間的連接鍵斷裂，角膜水腫難以恢復(fù)。中等濃度甘油有效的控制溶脹，使角膜厚度保持不變，并且在膠原纖維間隙保持與新鮮角膜相近的同時進(jìn)行交聯(lián)，更增加膠原纖維間的分子作用力，有效保護(hù)膠原三維結(jié)構(gòu)，使之在移植術(shù)后水腫時間縮短、程度減輕，使角膜植片更透明。
[0012]第三個特點是選用的交聯(lián)劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)，使角膜膠原纖維產(chǎn)生緩慢的膠原纖維內(nèi)交聯(lián)和膠原纖維間交聯(lián)；且交聯(lián)劑性質(zhì)非常溫和，膠原反應(yīng)后殘留的水溶性異脲很容易被洗脫。并且全眼球交聯(lián)，使交聯(lián)過程更溫和，有效使交聯(lián)劑更加緩慢地滲透至角膜膠原纖維基質(zhì)和纖維束間，使組織達(dá)到均勻而完全的交聯(lián)。
[0013]第四個特點是現(xiàn)有技術(shù)而言，工藝較簡單，成本較低，且操作簡便，易于工業(yè)化推廣應(yīng)用。
【具體實施方式】
[0014]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0015]實施例1
(1)處理:在豬死亡后2小時內(nèi)獲取豬眼球,依次用濃度為2%的碘伏和濃度為0.9%的生理鹽水來沖洗整個眼球，然后剪除眼球周圍的筋膜肌肉，接著用濃度為2%的碘伏沖洗整個眼球，沖洗完后再用濃度為0.9%的生理鹽水沖洗整個眼球；
(2)滅菌:將整個眼球泡入含有40mg妥布霉素的50%高糖溶液10 m中，泡的時間為至少20分鐘，20分鐘后用濃度為0.9%的生理鹽水對整個眼球進(jìn)行沖洗；
(3)細(xì)胞失活:將整個眼球轉(zhuǎn)入裝有溶液的甘油瓶中密封保存，保存過程中逐漸降溫，每分鐘降溫2-3°C，最終在_78°C的溫度下保存8周，所述溶液包括濃度為95%的滅菌甘油和濃度為5%的緩沖溶液，緩沖溶液為磷酸鹽緩沖液；
(4)滅病毒:將密封保存在甘油瓶內(nèi)的全眼球轉(zhuǎn)至_20°C的保溫盒中，用Y射線進(jìn)行輻照，輻照劑量為25kGy ；
(5)交聯(lián):將保存溶液融化后，把眼球轉(zhuǎn)至含80%甘油的交聯(lián)劑中，在4°C下保存48小時，交聯(lián)劑選自1-(3-二甲氨基丙基`)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)，它們之間的質(zhì)量比為3:1 ;EDC在溶液中最終濃度為10.0%(此處需說明的是，本發(fā)明所提及的交聯(lián)劑可以為內(nèi)交聯(lián)劑或外交聯(lián)劑，交聯(lián)劑種類較多，應(yīng)該實驗表明，與甘油配合使用，來制備眼角膜材料的交聯(lián)劑，效果最佳的是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS))；
(6 )植片制作:將經(jīng)過交聯(lián)的整個眼球取出后，放于林格氏液中清洗2次，每次5min，清洗完成后沿眼球角膜緣后2mm剪開，植片于自動角膜板層切削器中，切削器對角膜的切削厚度為200 μ m，植片應(yīng)用于實驗兔角膜移植術(shù)；
(7)動物準(zhǔn)備:選取新西蘭大白兔，體重2.5-3.0kg,采取3%戊巴比妥鈉(lml/kg即30mg/kg)和速眠新II (0.25ml/kg)進(jìn)行麻醉；
(8)板層角膜移植:選取7.5mm角膜環(huán)鉆，深度約2/3角膜厚度，取下角膜板層片，使用
7.75mm的環(huán)鉆制作異種角膜植片，將異種植片對位縫合于角膜植床上，術(shù)后I天、I周、8周、6月觀察角膜植片透明性，有無排斥反應(yīng)。
[0016]實施例2
(1)處理:在豬死亡后2小時內(nèi)獲取豬眼球,依次用濃度為2%的碘伏和濃度為0.9%的生理鹽水來沖洗整個眼球，然后剪除眼球周圍的筋膜肌肉，接著用濃度為2%的碘伏沖洗整個眼球，沖洗完后再用濃度為0.9%的生理鹽水沖洗整個眼球；
(2)滅菌:將整個眼球泡入含有40mg妥布霉素的50%高糖溶液10 ml中，泡的時間為至少20分鐘，20分鐘后用濃度為0.9%的生理鹽水對整個眼球進(jìn)行沖洗；
(3)細(xì)胞失活:將整個眼球轉(zhuǎn)入裝有溶液的甘油瓶中密封保存，保存過程中逐漸降溫，每分鐘降溫2-3°C，最終在_78°C的溫度下保存10周，所述溶液包括濃度為90%的滅菌甘油和濃度為10%的緩沖溶液，緩沖溶液為磷酸鹽緩沖液；
(4)滅病毒:將密封保存在甘油瓶內(nèi)的全眼球轉(zhuǎn)至-20°C的保溫盒中，用Y射線進(jìn)行輻照，輻照劑量為25kGy ；
(5)交聯(lián):將保存溶液融化后，把眼球轉(zhuǎn)至含50%甘油的交聯(lián)劑中，在4°C下保存48小時，交聯(lián)劑選自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)，它們之間的質(zhì)量比為2:1 ；EDC在溶液中最終濃度為10.0%(此處需說明的是，本發(fā)明所提及的交聯(lián)劑可以為內(nèi)交聯(lián)劑或外交聯(lián)劑，交聯(lián)劑種類較多，應(yīng)該實驗表明，與甘油配合使用，來制備眼角膜材料的交聯(lián)劑，效果最佳的是1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS))；
(6 )植片制作:將經(jīng)過交聯(lián)的整個眼球取出后，放于林格氏液中清洗2次，每次5min，清洗完成后沿眼球角膜緣后2mm剪開，植片于自動角膜板層切削器中，切削器對角膜的切削厚度為200 μ m，植片應(yīng)用于實驗兔角膜移植術(shù)；
(7)動物準(zhǔn)備:選取新西蘭大白兔，體重2.5-3.0kg,采取3%戊巴比妥鈉(lml/kg即30mg/kg)和速眠新II (0.25ml/kg)進(jìn)行麻醉；
(8)板層角膜移植:選取7.75mm角膜環(huán)鉆，深度約7/12角膜厚度，取下角膜板層片，使用8.0Omm的環(huán)鉆制作異種角膜植片，將異種植片對位縫合于角膜植床上，術(shù)后I天、I周、8周、6月觀察角膜植片透明性，有無排斥反應(yīng)。
[0017]實施例3
(1)處理:在豬死亡后2小時內(nèi)獲取豬眼球,依次用濃度為2%的碘伏和濃度為0.9%的生理鹽水來沖洗整個眼球，然后剪除眼球周圍的筋膜肌肉，接著用濃度為2%的碘伏沖洗整個眼球，沖洗完后再用濃度為0.9%的生理鹽水沖洗整個眼球；
(2)滅菌:將整個眼球泡入含有40mg妥布霉素的50%高糖溶液IOml中，泡的時間為至少20分鐘，20分鐘后用濃度為0.9%的生理鹽水對整個眼球進(jìn)行沖洗；
(3)細(xì)胞失活:將整個眼球轉(zhuǎn)入裝有溶液的甘油瓶中密封保存，保存過程中逐漸降溫，每分鐘降溫2-3°C，最終在_78°C的溫度下保存12周，所述溶液包括濃度為85%的滅菌甘油和濃度為15%的緩沖溶液，緩沖溶液為生理鹽水；
(4)滅病毒:將已經(jīng)經(jīng)過密封保存的整個眼球轉(zhuǎn)至-20°C的保溫容器中，用Y射線進(jìn)行輻照，劑量為輻照25kGy ;
(5)交聯(lián):將保存溶液融化后，把眼球轉(zhuǎn)至含20%甘油的交聯(lián)劑中，在4°C下保存48小時，交聯(lián)劑選自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)，它們之間的質(zhì)量比為1:1 ;EDC在溶液中最終濃度為1.0% ；
(6)植片制作:將經(jīng)過交聯(lián)的整個眼球取出，放于林格氏液中清洗2次，每次5分鐘，清洗完成后沿眼球角膜緣后2毫米剪開，植片于角膜板層切削器中，切削器對角膜的切削厚度為150 μ m，植片應(yīng)用于實驗兔角膜移植術(shù)；
(7)動物準(zhǔn)備:選取新西蘭大白兔，體重2.5-3.0kg,采取3%戊巴比妥鈉(lml/kg即30mg/kg)和速眠新II (0.25ml/kg)進(jìn)行麻醉；(8)板層角膜移植:選取10.0mm角膜環(huán)鉆標(biāo)記，在12點鐘深度約1/2角膜厚度，分離角膜層間，層間植入5.5mm大小的異種角膜植片，植片植入，術(shù)后I天、I周、8周、6月觀察角膜植片透明性，有無排斥反應(yīng)。
[0018]本發(fā)明制備的角膜材料在角膜膠原纖維結(jié)構(gòu)的保存和移植后透明性能均有改善，能廣泛應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)。
【權(quán)利要求】
1.一種異種角膜材料的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)細(xì)胞失活:在已死亡動物體上獲取可作為異種角膜材料的眼球，整個眼球轉(zhuǎn)入溶液中密封保存，保存過程中逐漸降溫，每分鐘降溫2-3°C，最終在-78°C的溫度下進(jìn)行長期保存，所述保存期限至少為4周，所述溶液包括甘油和緩沖溶液，其中甘油濃度為85~95%，緩沖溶液濃度為5~15% ； (2)滅病毒:將上述步驟(1)中已經(jīng)經(jīng)過密封保存的整個眼球轉(zhuǎn)至-20°C的保溫容器中，用Y射線進(jìn)行輻照，輻照劑量為25kGy; (3)交聯(lián):將上述步驟(2)中的整個眼球轉(zhuǎn)至含有20~80%甘油的交聯(lián)劑中，在4°C的溫度下保存I~72小時； (4)植片制作:將上述步驟(3)中的整個眼球沿眼球角膜緣后2毫米剪開，植片于角膜板層切削器中，切削器對角膜的切削厚度為200~550 μ m。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異種角膜材料的制備方法，其特征是:交聯(lián)劑選自1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)，它們之間的質(zhì)量比為1:1~3:1 ；EDC在溶液中最終濃度為1.0~10.0%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的異種角膜材料的制備方法，其特征是:眼球應(yīng)是在動物死亡后四個小時內(nèi)獲取,對已獲取的整個眼球在進(jìn)行密封保存之前,應(yīng)依次用濃度為2%的碘伏和濃度為0.9%的生理鹽水來沖洗整個眼球，然后剪除眼球周圍的筋膜肌肉，接著用濃度為2%的碘伏沖洗整個眼球，沖洗完后再用濃度為0.9%的生理鹽水沖洗整個眼球。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的異種角膜材料的制備方法，其特征是:在進(jìn)行密封保存之前，還應(yīng)該將整個眼球泡入含有40毫克妥布霉素的50%高糖溶液中，泡的時間為至少20分鐘，20分鐘后用濃度為0.9%的生理鹽水對整個眼球進(jìn)行沖洗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述`的異種角膜材料的制備方法，其特征是:在沿眼球角膜緣后2毫米剪開之前,應(yīng)該將整個眼球放于林格氏液中清洗2次,每次5分鐘。
【文檔編號】A61L27/24GK103550826SQ201310527550
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】陳蔚, 鄭欽象 申請人:廣州優(yōu)得清生物科技有限公司