專利名稱：F1t4(VEGFR－3)作為腫瘤顯像和抗腫瘤治療的靶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及受體的基因，尤其是受體酪氨酸激酶的基因，它們向重組DNA載體中的插入，以及在宿主微生物菌株和宿主真核細(xì)胞中結(jié)果蛋白的產(chǎn)生。更具體而言，本發(fā)明涉及Flt4這種受體酪氨酸激酶；編碼Flt4的核苷酸序列；產(chǎn)生Flt4的編碼DNA及其基因產(chǎn)物的方法；特異性識(shí)別(雜交)這些受體的編碼核酸的核酸探針；特異性識(shí)別這些受體的抗體；應(yīng)用這些探針和抗體以及其它Flt4結(jié)合化合物的方法，例如用于在動(dòng)物和人體組織中鑒定淋巴管和高內(nèi)皮小靜脈(HEV)以及用于促進(jìn)或預(yù)防病理狀態(tài)下Flt4表達(dá)細(xì)胞的生長。
背景負(fù)責(zé)分化細(xì)胞和組織的發(fā)育、維持和修復(fù)的細(xì)胞行為很大一部分是通過生長因子和類似的配體及它們的受體間所傳遞的細(xì)胞間信號(hào)來調(diào)節(jié)。所述受體位于應(yīng)答細(xì)胞的表面，它們結(jié)合已知為生長因子以及其它激素樣配體的肽或多肽。該相互作用導(dǎo)致應(yīng)答細(xì)胞中迅速的生物化學(xué)改變以及細(xì)胞基因表達(dá)的迅速和長期的再調(diào)整。與各種細(xì)胞表面相關(guān)的若干受體可以結(jié)合特定的生長因子。
酪氨酸磷酸化是跨質(zhì)膜信號(hào)傳遞的關(guān)鍵方式之一。若干酪氨酸激酶基因編碼肽生長因子和激素的跨膜受體，例如表皮生長因子(EGF)、胰島素、胰島素樣生長因子受體I(IGF-I)、血小板衍生生長因子(PDGF-A和B)及成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)[Heldin等，細(xì)胞調(diào)節(jié)，1555-566(1990)；Ullrich等，細(xì)胞，61243-54(1990)]。幾種造血生長因子的受體都是酪氨酸激酶；這些包括c-fms和c-kit，c-fms是集落刺激因子1受體[Sherr等，細(xì)胞，41665-676(1985)]，c-kit為始祖造血生長因子受體[Huang等，細(xì)胞，63225-33(1990)]。
這些受體的特異性和親和性存在差異。通常，受體酪氨酸激酶是糖蛋白，其包括，胞外結(jié)構(gòu)域(能結(jié)合特異生長因子)，跨膜結(jié)構(gòu)域(通常為蛋白質(zhì)α螺旋部分)；近膜結(jié)構(gòu)域(該受體可通過例如蛋白磷酸化進(jìn)行調(diào)節(jié)的部位)；酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(為該受體的酶性組分)和羧基端尾部(在許多受體中參與酪氨酸激酶底物的識(shí)別和結(jié)合)。
在幾個(gè)受體酪氨酸激酶中，選擇性剪切和選擇性腺苷酸化過程可以從相同的基因中產(chǎn)生幾個(gè)不同的多肽。這些可以包括或不包括上述的各種結(jié)構(gòu)域。因此一些胞外結(jié)構(gòu)域可以作為細(xì)胞分泌的獨(dú)立蛋白而表達(dá)，而且所述受體的一些形式可以缺乏酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域并且僅含有通過跨膜結(jié)構(gòu)域和短羧基端尾部插入到質(zhì)膜的胞外結(jié)構(gòu)域。
血管系統(tǒng)、胚胎血管發(fā)生和血管生成、凝血、傷口愈合和再生以及幾種疾病的生理學(xué)涉及排列于血管內(nèi)壁的血管內(nèi)皮。血管樹的發(fā)生通過血管發(fā)生產(chǎn)生，而且根據(jù)一些理論，淋巴系統(tǒng)的形成緊接著動(dòng)脈和靜脈的發(fā)育，始于從靜脈出芽。見Sabin FR，Am JAant，943(1909)；和van der Putte，S.C.J.Adv Anat Embryol Cell Biol，513(1975)。
胎兒期之后，除了在與新血管形成相關(guān)的血管發(fā)生期間外，內(nèi)皮細(xì)胞增殖非常緩慢。刺激血管發(fā)生的生長因子通過特異性內(nèi)皮細(xì)胞表面受體酪氨酸激酶發(fā)揮其作用。
在受體酪氨酸激酶的配體中，血小板衍生生長因子(PDGF)在雞尿囊絨膜中顯示了血管生成性，雖然很弱。轉(zhuǎn)化生長因子α(TGFα)是由幾種腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的血管生成因子。肝細(xì)胞生長因子(HGF)，即c-met原癌基因編碼的受體的配體，也具有強(qiáng)血管生成性，包括在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中與TGFα作用相似的反應(yīng)。
有證據(jù)表明存在內(nèi)皮細(xì)胞特異性生長因子和受體，其可能主要負(fù)責(zé)刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長、分化以及確定分化的功能。最廣泛研究的生長因子是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，其為PDGF家族成員。血管內(nèi)皮生長因子是兩個(gè)23kDa亞單位通過二硫鍵連接的二聚體糖蛋白，因其對內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂活性和其誘導(dǎo)血管滲透的能力(因此其又被稱為血管滲透因子)而被發(fā)現(xiàn)。報(bào)道的VEGF的其它作用包括細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)員、誘導(dǎo)纖溶酶原刺激因子和纖溶酶原刺激因子抑制劑-1的合成、刺激內(nèi)皮細(xì)胞中已糖轉(zhuǎn)移和在體外促進(jìn)單核細(xì)胞遷移。由不同的mRNA剪切變體編碼的四種VEGF異構(gòu)體表現(xiàn)出相同的刺激內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的能力。VEGF的121個(gè)和165個(gè)氨基酸的異構(gòu)體以可溶的形式分泌，而189個(gè)和206個(gè)氨基酸殘基異構(gòu)體仍然與細(xì)胞表面結(jié)合，并且與肝素有強(qiáng)親和力?？扇苄苑歉嗡亟Y(jié)合和肝素結(jié)合形式還被描述為相關(guān)胚胎生長因子(PIGF，分別為131和152個(gè)氨基酸)，其在人胚胎、滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤和培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。
VEGF表達(dá)模式表明其涉及正常血管系統(tǒng)的發(fā)育和維持以及腫瘤的血管發(fā)生。在小鼠發(fā)育期間，交配后全部7.5天，內(nèi)胚層表達(dá)VEGF，并且在毛細(xì)血管向內(nèi)生長階段室神經(jīng)外胚層產(chǎn)生VEGF。在鵪鶉發(fā)育的第二天，在卵黃囊的血管形成區(qū)域和整個(gè)胚胎均表達(dá)VEGF。另外，在成年小鼠中緊靠穿通內(nèi)皮的內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)表達(dá)VEGF，提示其在這個(gè)特異性內(nèi)皮的表型和功能的維持中起作用。
兩個(gè)VEGF的高親和力受體，VEGFR-1/Flt1(fms樣酪氨酸激酶-1)和VEGFR-2/Kdr/Flk-1(含受體/胎兒肝激酶-1的激酶插入結(jié)構(gòu)域)，其特性已經(jīng)被描述。這些受體分類為PDGF受體家族。然而，VEGF受體在其胞外結(jié)構(gòu)域中具有7個(gè)免疫球蛋白樣環(huán)(而PDGF家族成員有5個(gè)環(huán))而且具有較大的激酶插入片段。雖然一些VEGF受體可以在單核細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞系中出現(xiàn)，VEGF受體的表達(dá)主要發(fā)生在血管內(nèi)皮細(xì)胞中。據(jù)報(bào)道只有內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)答VEGF時(shí)發(fā)生增殖，而且不同來源的內(nèi)皮細(xì)胞顯示不同的應(yīng)答。因此，通過VEGFR-1和VEGF-2介導(dǎo)的信號(hào)表現(xiàn)出細(xì)胞類型特異性。
VEGFR-1和VEGFR-2以高親和力結(jié)合VEGF165(Kd分別約為20pM和200pM)。Flk-1受體也已經(jīng)表明在應(yīng)答VEGF時(shí)發(fā)生自我磷酸化，但是幾乎不能檢測到Flt1的磷酸化。VEGFR-2介導(dǎo)的信號(hào)引起顯著的形態(tài)學(xué)變化、肌動(dòng)蛋白重組和過量表達(dá)這種受體的豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的膜波動(dòng)。在這些細(xì)胞中，VEGFR2還介導(dǎo)配體誘導(dǎo)的趨化作用和有絲分裂發(fā)生作用；而VEGFR-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞缺乏對VEGF的有絲分裂應(yīng)答。相反，VEGF對大鼠中表達(dá)VEGFR-1的竇狀隙內(nèi)皮細(xì)胞具有強(qiáng)生長刺激作用。用VEGFR-1和VEGFR-2進(jìn)行的磷酸蛋白共沉淀存在差別，表明不同的信號(hào)分子與受體特異性細(xì)胞內(nèi)序列相互作用。
在原位雜交研究中，小鼠VEGFR-2mRNA的表達(dá)可見于卵黃囊和胚胎內(nèi)中胚層(對交配后(p.c.)7.5天的胚胎進(jìn)行評估，內(nèi)皮細(xì)胞衍生于該胚胎)，而后見于可能的成血管細(xì)胞、心內(nèi)膜和大的與小的血管內(nèi)皮(12.5天p.c.)。血管芽、胚胎期的分支血管和出生后早期的腦中增殖的內(nèi)皮細(xì)胞中富含VEGFR-2mRNA，在成年腦中它為低表達(dá)，這表明VEGFR-2是血管發(fā)生和血管生成的主要調(diào)節(jié)因子。VEGFR-1表達(dá)同樣與小鼠胚胎中的早期血管發(fā)育和皮膚傷口愈合時(shí)的新血管生成相關(guān)聯(lián)。然而，在成年器官中檢測到高水平的VEGFR-1表達(dá)，表明VEGFR-1在成熟血管的靜止內(nèi)皮細(xì)胞中具有功能，其與細(xì)胞生長無關(guān)。VEGFR-2的鳥類同系物從原腸胚形成開始就在中胚層中發(fā)現(xiàn)，而VEGFR-1同系物首先在共表達(dá)內(nèi)皮標(biāo)記的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。在鵪鶉外胚層體外培養(yǎng)中，這些細(xì)胞的血管發(fā)生性分化所必需的FGF-2上調(diào)VEGFR-2的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在發(fā)育后期兩種VEGF受體的表達(dá)均更受限制。在人胚胎組織中，VEGFR-1和VEGFR-2表現(xiàn)出重疊的但略有差異的表達(dá)模式。這些資料表明VEGF及其受體以旁分泌方式發(fā)揮作用，來調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的分化和組織的新血管發(fā)生。
最近表明VEGF是低氧誘導(dǎo)型內(nèi)皮細(xì)胞生長和血管發(fā)生的刺激因子，而且利用特異性單克隆抗體抑制VEGF的活性以顯示可以降低實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤的生長及其血管密度[Ferrara等，內(nèi)分泌綜述，184-25(1997)；Shibuya等，癌癥研究進(jìn)展，67281-316(1995)；Kim等，自然，362841-844(1993)]。
大小超過幾立方毫米的實(shí)體腫瘤的生長依賴于血管供應(yīng)，使得血管發(fā)生成為抗癌治療的誘人靶點(diǎn)。已經(jīng)報(bào)道用內(nèi)源性血管發(fā)生抑制劑或含有血管他丁(纖溶酶原的片段)和內(nèi)膜他丁(膠原18的片段)的“抑制素”治療腫瘤獲得令人鼓舞的結(jié)果[O′Reilly等，細(xì)胞，79315-328(1994)；O′Reilly等，細(xì)胞，88277-85(1997)]。兩種因子均由原發(fā)腫瘤正常分泌，而且保持轉(zhuǎn)移靜止。在動(dòng)物模型中，任一種抑制素的全身給藥均顯示還可誘導(dǎo)并維持原發(fā)腫瘤的休眠。抑制素的受體和由抑制素介導(dǎo)的信號(hào)傳遞，以及激活它們的蛋白酶尚有待鑒定。需要其它治療性分子用于在癌癥和其它病理狀態(tài)的治療中控制血管生成。
已知原發(fā)乳腺癌表達(dá)幾種血管發(fā)生多肽，其中VEGF的表達(dá)最豐富[見例如Relf等，癌癥研究，57963-969(1997)]。在浸潤型和非浸潤型導(dǎo)管型(原位)乳腺癌中，腫瘤細(xì)胞包括高水平的VEGFmRNA[Brown等，人類病理學(xué)，2686-91(1995).]?？拷涣龅膬?nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGFR-1和VEGFR-2mRNA。VEGF及其受體可以有助于惡性乳腺腫瘤的血管發(fā)生進(jìn)程，因?yàn)樵趲讉€(gè)獨(dú)立的研究中，發(fā)現(xiàn)了腫瘤血管密度和疾病預(yù)后之間的相關(guān)性[Weidner等，J.Natl.CancerInst，841875-1887(1992)]。需要針對乳腺癌和乳腺癌相關(guān)血管發(fā)生的其它標(biāo)記物，來改進(jìn)診斷和普查并作為干預(yù)治療的靶點(diǎn)。
淋巴系統(tǒng)的主要功能是提供組織中液體回流，并且將許多血管外物質(zhì)運(yùn)送回血液。另外，在其成熟過程中，淋巴細(xì)胞離開血液，通過淋巴器官和其它組織進(jìn)行遷移并且進(jìn)入淋巴管，然后通過胸導(dǎo)管返回血液。特化小靜脈，即高內(nèi)皮小靜脈(HEV)，再一次結(jié)合淋巴細(xì)胞并使其外滲到組織中。因此淋巴管和尤其是淋巴結(jié)在免疫和不同腫瘤轉(zhuǎn)移性的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
自從20世紀(jì)初，出現(xiàn)了三個(gè)不同的關(guān)于淋巴系統(tǒng)胚胎起源的理論。然而，由于缺少已知的可用于淋巴管的特殊標(biāo)記物，難于鑒定淋巴管。
對淋巴管的研究通常借助于淋巴照影進(jìn)行。在淋巴照影中，將X-射線對照介質(zhì)直接注射到淋巴管中。該對照介質(zhì)沿淋巴系統(tǒng)的離心導(dǎo)液管方向分布。對照介質(zhì)在淋巴結(jié)中匯集，在此其停留達(dá)半年，這期間X-射線分析允許監(jiān)控淋巴結(jié)的大小和結(jié)構(gòu)。該診斷在帶有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤患者和惡性淋巴瘤患者(如淋巴瘤)中尤其重要。然而，在本領(lǐng)域中，需要對淋巴組織成像的材料和方法進(jìn)行改進(jìn)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了位于5號(hào)染色體的新受體酪氨酸激酶基因，其被鑒定為人白血病細(xì)胞中未知的酪氨酸激酶同源性PCR-cDNA片段[Aprelikova等，癌癥研究，52746-748(1992)]。該基因及其編碼的蛋白命名為Flt4。該簡稱來源于fms-樣酪氨酸激酶4一詞。
Flt4是一種結(jié)構(gòu)上與VEGFR-1和VEGFR-2基因的產(chǎn)物密切相關(guān)的受體酪氨酸激酶。由于這種相似性和隨后發(fā)現(xiàn)的這三種受體之配體間的相似性，F(xiàn)lt4又命名為VEGFR-3。Flt4和VEGFR-3這兩個(gè)名稱在本文中可以互換。盡管這三個(gè)受體之間存在相似性，F(xiàn)lt4的成熟形式與幾種VEGFR存在差別該差異是Flt4的胞外區(qū)被水解成兩個(gè)二硫鍵連接的多肽，125/120kD和75kD。Flt4基因編碼具有可任選的3′外顯子的4.5kb和5.8kbmRNA，分別編碼190kD和195kD的多肽。
另一差異是VEGF不顯示與Flt4的特異性結(jié)合而且不誘導(dǎo)其自我磷酸化。
對Flt4、Fltl和KDR/Flk-1受體mRNA信號(hào)的比較表明在被研究的組織中存在重疊但不相同的表達(dá)模式。Kaipainen等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1782077(1993)。Flt4基因表達(dá)顯得比VEGFR-1和VEGFR-2的表達(dá)受到更多的限制。首次檢測到Flt4的表達(dá)是在小鼠交配后8.5天，在其胚胎的頭部間質(zhì)、主靜脈以及胚外尿囊中對成血管細(xì)胞進(jìn)行原位雜交之時(shí)。在交配后12.5天的胚胎中，F(xiàn)lt4信號(hào)可見于發(fā)育中的靜脈內(nèi)皮及假定的淋巴內(nèi)皮，但動(dòng)脈內(nèi)皮表現(xiàn)為陰性。在發(fā)育后期，F(xiàn)1t4mRNA只見于發(fā)育中的淋巴管。在成人組織中僅有淋巴內(nèi)皮和一些高內(nèi)皮小靜脈表達(dá)Flt4mRNA，而且在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的淋巴竇和淋巴管瘤中其表達(dá)增加。這些結(jié)果支持淋巴管起源于靜脈的理論。
從人紅白血病細(xì)胞系中克隆的Flt4受體酪氨酸激酶cDNA的蛋白產(chǎn)物已N-糖基化并且在其胞外結(jié)構(gòu)域中包括7個(gè)免疫球蛋白樣環(huán)。Flt4的細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域與Fltl和KDR的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域在氨基酸水平上大約有80％的同一性，而與血小板衍生生長因子、集落刺激因子-1、干細(xì)胞因子和Flt3受體有大約60％的同一性。見Pajusola等，癌癥研究，525738(1992)。
本發(fā)明提供了分離的編碼Flt4受體酪氨酸激酶的多核苷酸(例如具有指定結(jié)構(gòu)的DNA或RNA片段)，其可用于制備Flt4蛋白及其肽段并回收其它來源的相關(guān)基因。
本發(fā)明提供了包含編碼上述Flt4受體酪氨酸激酶或相關(guān)蛋白的外源性片段的重組DNA載體，其可插入到微生物或真核細(xì)胞并能表達(dá)編碼的蛋白。
本發(fā)明提供了真核細(xì)胞，其能夠產(chǎn)生有效量的Flt4受體酪氨酸激酶和來源于許多物種的功能相似的蛋白。
本發(fā)明提供了可以在實(shí)驗(yàn)室合成或通過微生物產(chǎn)生的肽，所述肽模擬天然Flt4受體酪氨酸激酶蛋白的活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抑制Flt4受體酪氨酸激酶蛋白活性的肽。
尤其優(yōu)選的肽選自(a)短Flt4形式，其核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列見SEQ ID No 1和2；(b)在其羧基末端具有不同的核苷酸和相應(yīng)氨基酸殘基的第二種形式，即長Flt4形式，其核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列見SEQID No 3和4。長Flt4形式具有1363個(gè)氨基酸殘基。
DNA和RNA分子、重組DNA載體、及包含上述任一種蛋白或多肽之核苷酸序列的修飾型微生物或真核細(xì)胞也是本發(fā)明的一部分。具體而言，含下述兩種DNA序列之部分或全部的序列，互補(bǔ)DNA或RNA序列，或相應(yīng)RNA序列均尤其優(yōu)選(a)諸如SEQID NO1的DNA序列，其編碼短Flt4形式(SEQ ID NO2)，(b)諸如SEQ ID NO3的DNA序列，其編碼的Flt4中SEQ ID NO1的核苷酸3913-4416已改變，其編碼長Flt4形式[SEQ IDNO4]。
本發(fā)明還提供了包括較大序列之片段的DNA和RNA分子，用于進(jìn)行本發(fā)明關(guān)于利用基因工程技術(shù)制備這類肽和制備寡核苷酸探針的優(yōu)選方面。
因?yàn)樵诖舜_定了編碼Flt4蛋白的DNA序列，所以可以利用市售的儀器通過例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或通過化學(xué)合成的方法，制備編碼Flt4蛋白的DNA，其后可以利用已知的重組DNA技術(shù)將該基因插入到任何可用的DNA載體中。而且，還可以應(yīng)用自動(dòng)化儀器，使任何在此公開的多肽的直接合成可以容易地完成。
本發(fā)明還涉及Flt4肽和其它構(gòu)建體，并且涉及將Flt4作為淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的特異標(biāo)記的應(yīng)用。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及識(shí)另 Flt4的核酸探針和抗體，尤其是單克隆抗體和包含此抗體的組合物。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于在組織樣品和生物體中監(jiān)控淋巴管的方法。而且，本發(fā)明的目的是提供可表示生物中淋巴組織尤其是淋巴管的狀態(tài)(炎癥、感染、創(chuàng)傷、生長等)的臨床檢測方法，并且提供用于檢測淋巴管和淋巴管形成的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供特異性識(shí)別Flt4受體蛋白或其各種抗原決定簇的單克隆抗體。本發(fā)明的目的是應(yīng)用這些診斷性單克隆抗體檢測和測定組織中，尤其是在淋巴組織中FIt4受體的量。在抗Flt4抗體的章節(jié)中，術(shù)語“特異性識(shí)另 Flt4”、“特異性結(jié)合Flt4”、“對Flt4特異”等等意指與其它內(nèi)皮細(xì)胞表面受體(包括VEGFR-2/Kdr/Flk-1和VEGFR-1/Fltl)相比抗體優(yōu)先結(jié)合Flt4(與之發(fā)生免疫反應(yīng))。因此，抗Flt4抗體或其它對Flt4“特異”的Flt4結(jié)合化合物可用于，經(jīng)本發(fā)明所述方法(如醫(yī)學(xué)影象、檢測、篩查或靶向治療)對在組織或生物樣品中的Flt4進(jìn)行鑒定和/或標(biāo)記，因?yàn)樗鼈兏揪筒荒芙Y(jié)合其它抗原的抗原決定簇，或者與其它抗原結(jié)合的親和力與Flt4的親和力相比足夠低，低到在這些情況下可以忽略不計(jì)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及檢測細(xì)胞樣品中Flt4受體的存在的方法，其步驟包括(a)將細(xì)胞樣品暴露于本發(fā)明的抗體，尤其是單克隆抗體；(b)檢測該單克隆抗體與Flt4受體的結(jié)合。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及在淋巴管生成中及在炎癥、感染和免疫狀態(tài)中調(diào)節(jié)(例如拮抗或促進(jìn))Flt4功能的方法。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，這類方法包括通過提供足夠量Flt4結(jié)合化合物以阻斷參與此反應(yīng)的Flt4內(nèi)皮細(xì)胞位點(diǎn)，抑制Flt4介導(dǎo)的淋巴管生成，尤其當(dāng)Flt4功能與諸如轉(zhuǎn)移癌、淋巴瘤、炎癥(慢性或急性)、感染和免疫性疾病等疾病相關(guān)時(shí)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及特異性激活Flt4的配體和單克隆體及它們在激活淋巴內(nèi)皮中的應(yīng)用，并且涉及從對配體的研究中得到的片段和多肽以及抗體，以其用來在需要的時(shí)候，例如在涉及Flt4功能的各種疾病狀態(tài)中，抑制Flt4的功能。
本發(fā)明為Flt4受體酪氨酸激酶的配體提供了細(xì)胞系來源。利用這些細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，F(xiàn)lt4配體可經(jīng)本領(lǐng)域常規(guī)方法純化并克隆。利用此條件培養(yǎng)基或純化的配體，可得到用于Flt4和二聚作用抑制劑以及Flt4信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的檢測系統(tǒng)，其可用于鑒定和制備這些抑制劑。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，PC-3細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基包括蛋白或其片段，其能夠激活Flt4受體并且調(diào)節(jié)特定內(nèi)皮細(xì)胞的生長和分化以及其分化功能。Flt4配體或其肽或其衍生物有助于調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的生長、分化和它們的分化功能，而且有助于制備針對此配體的激動(dòng)劑和拮抗劑。Flt4配體尤其有助于調(diào)節(jié)淋巴內(nèi)皮。然而純化的或重組產(chǎn)生的Flt4配體也可以激活相關(guān)的KDR/Flk-1受體。
激活Flt4的配體的鑒定使得直接檢測該配體的抑制劑或Flt4功能的抑制劑成為可能。將這些抑制劑簡單地加到含F(xiàn)lt4配體的條件培養(yǎng)基中，如果它們能抑制自我磷酸化，那么就將其作為Flt4信號(hào)抑制劑。例如，可以分析重組或合成的肽(包括但不限于Flt4胞外結(jié)構(gòu)域的片段)對Flt4-配體相互作用或Flt4二聚作用的抑制。這些推測的Flt4抑制劑和抗Flt4配體的抗體、阻斷Flt4受體-配體相互作用的肽或其它化合物、以及與編碼Flt4配體的mRNA序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸，均有助于調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞并且有助于治療與內(nèi)皮細(xì)胞功能相關(guān)的疾病。
命名為VEGF-C的Flt4配體的詳細(xì)特征見1998年2月2日提交的PCT專利申請PCT/US98/01973，即國際公開號(hào)WO98/33917；1996年8月1日提交的PCT專利申請PCT/FI96/00427，即國際公開號(hào)WO97/05250；以及作為上述專利的優(yōu)先權(quán)的美國專利申請優(yōu)先權(quán)文獻(xiàn)，所有這些在此引入本文作為參考。推導(dǎo)的前VEGF-C氨基酸序列見SEQ ID NO21所示。
對命名為VEGF-D的另一種Flt4配體的詳細(xì)敘述見Achen等，美國國家科學(xué)院院刊，95(2)548-553(1998)和Genbank登記號(hào)AJ000185，二者在此引入本文作為參考。推導(dǎo)的前體VEGF-D氨基酸序列見SEQ ID NO22所示。
本發(fā)明還涉及治療哺乳動(dòng)物的方法，該哺乳動(dòng)物患有以在細(xì)胞中表達(dá)Flt4酪氨酸激酶為特征的疾病，所述方法的步驟包括給哺乳動(dòng)物施用組合物，該組合物包括可有效抑制Flt4配體蛋白與該生物體細(xì)胞中表達(dá)的Flt4結(jié)合的化合物，從而抑制Flt4的功能。所述疾病可以是上述已經(jīng)提及的疾病，例如以不希望有的淋巴管生成為特征的疾病。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Flt4表達(dá)還在相關(guān)于至少部分乳腺癌(可能還其它癌癥)的血管中發(fā)生(即其表達(dá)水平大大超過在相應(yīng)正常(健康)組織的血管系統(tǒng)中幾乎不可檢測或完全不可檢測的表達(dá)水平)。因此在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包括(淋巴管或血管的)內(nèi)皮細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞，例如表達(dá)F1t4的某些淋巴瘤。尤其考慮對人的治療。
“可有效抑制Flt4配體蛋白與生物體細(xì)胞中表達(dá)的Flt4結(jié)合的化合物”意指抑制與在此描述為血管內(nèi)皮生長因子C的Flt4配體(其可從PC-3條件培養(yǎng)基中分離到)結(jié)合的任何化合物。據(jù)信這類化合物還可有效抑制血管內(nèi)皮生長因子D與Flt4的結(jié)合。化合物的實(shí)例包括如下的肽(a)包含抗-Flt4抗體的抗原結(jié)合片段的多肽；(b)包含可溶性Flt4片段(例如胞外結(jié)構(gòu)域片段)的多肽，其中所述片段和多肽可與Flt4配體結(jié)合；(c)包含脊椎動(dòng)物血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)多肽的片段或類似物的多肽，其中所述多肽或片段或類似物可結(jié)合天然宿主細(xì)胞(即在其表面表達(dá)天然Flt4蛋白的生物體細(xì)胞)表達(dá)的Flt4，但是不能激活Flt4；和(d)包含脊椎動(dòng)物血管內(nèi)皮生長因子D(VEGF-D)多肽的片段或類似物的多肽，其中所述多肽或片段或類似物可結(jié)合天然宿主細(xì)胞(即在其表面表達(dá)天然Flt4蛋白的生物體細(xì)胞)表達(dá)的Flt4，但是不能激活Flt4。還考慮了常規(guī)體外篩選檢測中用諸如VEGF-C和重組表達(dá)的Flt4)可鑒定的小分子抑制劑。高度優(yōu)選含抗-Flt4抗體的抗原結(jié)合片段的多肽。這些肽包括例如特異性結(jié)合Flt4的多克隆抗體和單克隆抗體；這些抗體的片段；嵌合或人源化抗體；特異性結(jié)合Flt4并且還特異性結(jié)合另一抗原的雙特異性抗體等等。還考慮了與循環(huán)的Flt4配體結(jié)合并且因此抑制該配體與Flt4結(jié)合的化合物。這類化合物包括抗VEGF-C或抗VEGF-D抗體或包含其抗原結(jié)合片段的多肽。在相關(guān)的變化中，本發(fā)明考慮了阻斷下游細(xì)胞內(nèi)Flt4信號(hào)傳導(dǎo)并因此抑制Flt4功能的治療方法。
在優(yōu)選的變化中，所述化合物還包括可檢測標(biāo)記(如本文他處所述)或細(xì)胞毒試劑。細(xì)胞毒試劑包括植物毒素(例如蓖麻毒蛋白，皂草素)，細(xì)菌或真菌毒素，放射性同位素(例如211-砹、212-鉍、90-釔、131-碘、99m-锝和本文所述的其它同位素)，抗代謝藥(例如氨甲喋呤，5-氟尿嘧啶)，烷化劑(例如苯丁酸氮芥)，抗有絲分裂藥(例如長春花生物堿)和DNA嵌入劑(例如阿霉素)。
同樣，為了改進(jìn)給藥，組合物優(yōu)選還包括可藥用的稀釋劑、佐劑或載體媒介。
如本文所詳述，盡管Flt4的表達(dá)主要限定于健康成人的淋巴管內(nèi)皮，在至少某些腫瘤周圍的血管中發(fā)現(xiàn)了Flt4的表達(dá)。因此本發(fā)明還包括治療哺乳動(dòng)物腫瘤患者的方法，所述腫瘤以在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)Flt4酪氨酸激酶(Flt4)為特征，所述方法包括如下步驟給需要該治療的哺乳動(dòng)物施用組合物，所述組合物包括可有效抑制Flt4配體蛋白與該生物體的血管內(nèi)皮中表達(dá)的Flt4結(jié)合，因此抑制了Flt4介導(dǎo)的血管內(nèi)皮增生的化合物。
特別考慮了對選自癌(例如乳腺癌)、鱗狀細(xì)胞癌、淋巴瘤、黑色素瘤和肉瘤等腫瘤的治療。然而，很顯然在本文中詳細(xì)敘述的檢查技術(shù)可以鑒定其它以在其血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)Flt4為特征的腫瘤，所述腫瘤均對本文中敘述的抗Flt4治療方法敏感。特別考慮了以其血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Flt4為特點(diǎn)的乳腺癌的治療。以在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)Flt4受體酪氨酸激酶為特征的惡性腫瘤意指一種疾病，其中在血管中可以檢測到Flt4，其水平大大超過在健康組織中的幾乎不可檢測或完全不可檢測的水平，如本文中的例證。
可利用本領(lǐng)域公認(rèn)的劑量遞增試驗(yàn)和劑量反應(yīng)試驗(yàn)，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)決定化合物的有效治療量。腫瘤治療的有效治療量是指可以有效減緩腫瘤生長、或有效終止腫瘤的生長、或有效縮小或消除腫瘤，并且對接受腫瘤治療的患者不產(chǎn)生不可接受的副作用的劑量。當(dāng)所述化合物包括抗體或其它多肽時(shí)，優(yōu)選其劑量為約0.1-100mg抗體每公斤體重，更優(yōu)選1-10mg/kg。對通常具有較長血液半衰期的人源性抗體，優(yōu)選從每天給藥到每隔一個(gè)月給藥，更優(yōu)選每周或每隔一周或每三周一次給藥。監(jiān)控治療的進(jìn)展、患者的副作用和循環(huán)抗體的水平將給最佳劑量方案提供額外的指導(dǎo)。在以其它抗體(如抗HER2，抗EGF受體)為基礎(chǔ)的癌癥治療方面，所發(fā)表的資料和正在進(jìn)行的臨床實(shí)驗(yàn)也可有效指導(dǎo)所述劑量方案。
在本文所述治療方法中，優(yōu)選的化合物包括含抗Flt4抗體之抗原結(jié)合片段的多肽和含可溶性Flt4胞外結(jié)構(gòu)域片段的多肽。高度優(yōu)選人和人源化抗Flt4抗體。
預(yù)計(jì)本發(fā)明治療方法的優(yōu)點(diǎn)在于，F(xiàn)lt4在健康組織的血管中通常沒有明顯的表達(dá)。在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療化合物包括雙特異性抗體或其片段，其中所述抗體或片段特異性結(jié)合Flt4并特異性結(jié)合一種血管內(nèi)皮標(biāo)記抗原?！把軆?nèi)皮標(biāo)記抗原”是指任何在增殖的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞表面抗原，并且優(yōu)選不在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的表面抗原。血管內(nèi)皮標(biāo)記的實(shí)例包括PAL-E[deWaal等，美國病理雜志，1501951-1957(1994)]，VEGFR1和VEGFR2[Ferrara等，內(nèi)分泌綜述，184-25(1997)]，Tie[Partanen等，分子細(xì)胞生物學(xué)，121698-1707(1992)]，endoglin[美國專利號(hào)5776427，在此全文引入作為參考]和von Willebrandt因子。預(yù)計(jì)這些雙特異性抗體優(yōu)先定位于同時(shí)表達(dá)Flt4和血管內(nèi)皮標(biāo)記物的腫瘤相關(guān)血管。在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述化合物還包括與該雙特異性抗體偶聯(lián)的抗腫瘤試劑或細(xì)胞毒試劑，其目的是殺傷腫瘤細(xì)胞和/或殺傷為腫瘤細(xì)胞供血的血管。試劑實(shí)例包括上述的那些，還包括在宿主體內(nèi)激活腫瘤免疫應(yīng)答的治療性蛋白，例如抑制素、細(xì)胞因子、趨化因子等等。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物包括抗體(或雙特異性抗體)，其識(shí)別一個(gè)(或多個(gè))包含F(xiàn)lt4/Flt4配體復(fù)合物(例如Flt4與VEGF-C或VEGF-D結(jié)合的復(fù)合物)的抗原決定簇。
還進(jìn)一步考慮了治療性化合物與可有效抑制血管生成因子的廣譜藥物偶聯(lián)或共同給藥。這類試劑有肝素結(jié)合藥物(例如戊聚糖和蘇拉明類似物，其可以抑制與肝素結(jié)合的血管生成因子)，以及阻斷內(nèi)皮細(xì)胞生長和遷移的化學(xué)試劑，例如煙曲霉素類似物。
還考慮了將抗Flt4化合物與藥物前體結(jié)合，使藥物前體通過所述抗Flt4化合物靶向腫瘤血管，然后在腫瘤生長部位被局部激活(例如通過放射)。應(yīng)用這些藥物前體的策略預(yù)計(jì)具有減少藥物對表達(dá)Flt4之健康淋巴管的副作用的優(yōu)點(diǎn)。
同樣，本發(fā)明包括治療患有惡性腫瘤的哺乳動(dòng)物的方法，所述惡性腫瘤的特點(diǎn)是在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)Flt4酪氨酸激酶(Flt4)，該方法包括如下步驟鑒別患有以在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)Flt4為特點(diǎn)的惡性腫瘤的哺乳動(dòng)物體，并且給需要該治療的所述哺乳動(dòng)物施用組合物，該組合物包括有效抑制Flt4配體蛋白與在該生物體血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的Flt4結(jié)合，從而抑制Flt4介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的化合物。
本發(fā)明還提供了檢查生物樣品中Flt4受體酪氨酸激酶蛋白(Flt4)的存在的方法，包括如下步驟(a)使懷疑含有Flt4的生物樣品與包含F(xiàn)lt4結(jié)合化合物的組合物進(jìn)行接觸，其條件可使該化合物與該生物樣品中的Flt4結(jié)合；(b)在可以除去未與生物樣品中Flt4結(jié)合的Flt4結(jié)合化合物的條件下，洗滌生物樣品；并且(c)在洗滌步驟之后，通過檢測與生物樣品中Flt4受體酪氨酸激酶結(jié)合的Flt4結(jié)合化合物，篩選存在Flt4的生物樣品。所述化合物優(yōu)選包括選自如下多肽的多肽(a)包含抗Flt4抗體之抗原結(jié)合片段的多肽；和(b)包括Flt4配體或Flt4結(jié)合片段或其類似物的多肽。高度優(yōu)選特異性結(jié)合Flt4并且還包括可檢測標(biāo)記的抗體。
本發(fā)明還涉及使可能含有表達(dá)Flt4受體酪氨酸激酶蛋白(Flt4)之細(xì)胞的脊椎動(dòng)物組織顯像的方法，其包括如下步驟(a)將脊椎動(dòng)物組織與包含F(xiàn)lt4結(jié)合化合物的組合物接觸；并且(b)通過檢測與該組織結(jié)合的Flt4結(jié)合化合物使該組織顯像。所述組織優(yōu)選人的組織，并且所述方法還包括在接觸步驟之后而在顯像步驟之前洗滌組織的步驟，其條件可以從組織中除去未與Flt4結(jié)合的Flt4化合物。
在相關(guān)的變化中，本發(fā)明提供了使哺乳動(dòng)物組織中腫瘤顯像的方法，其包括如下步驟(a)將疑含腫瘤的脊椎動(dòng)物組織與含有Flt4結(jié)合化合物的組合物接觸；(b)檢測與該組織中細(xì)胞結(jié)合的Flt4結(jié)合化合物；并且(c)通過鑒定被Flt4結(jié)合化合物結(jié)合的血管內(nèi)皮細(xì)胞使實(shí)體腫瘤顯像，其中表達(dá)Flt4的血管與組織中腫瘤的存在和定位相關(guān)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法還包括將所述組織與第二個(gè)化合物(例如抗體)接觸的步驟，該第二個(gè)化合物特異性結(jié)合在淋巴管內(nèi)皮中實(shí)質(zhì)上不出現(xiàn)的血管內(nèi)皮標(biāo)記(例如PAL-E、VEGFR-1、VEGFR-2)；并且檢測與組織中細(xì)胞結(jié)合的所述第二種化合物；其中顯像步驟包括鑒別被所述Flt4結(jié)合化合物和所述第二種化合物標(biāo)記的血管，并且其中被所述Flt4結(jié)合化合物和所述第二種化合物標(biāo)記的血管與組織中腫瘤的存在和定位相關(guān)。應(yīng)當(dāng)理解應(yīng)用第二種化合物有助于開業(yè)醫(yī)生更迅速區(qū)分在其表面表達(dá)Flt4的血管和正常淋巴管。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及監(jiān)測惡性腫瘤狀態(tài)的方法，其包括如下步驟(a)將疑有惡性腫瘤狀態(tài)的哺乳動(dòng)物組織與包含特異性結(jié)合Flt4受體酪氨酸激酶的抗體或抗體片段的組合物接觸；(b)檢測與所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合的抗體或抗體片段；并且(c)根據(jù)與所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合的抗體的量和分布而篩查惡性腫瘤。如同在本文中的敘述，F(xiàn)lt4(其通常在血管中不可檢測或幾乎不可檢測)在至少一些腫瘤的血管中被強(qiáng)染色。因此在一個(gè)實(shí)施方案的篩選步驟中，與血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的抗體或抗體片段的發(fā)現(xiàn)與惡性腫瘤的存在相關(guān)。在本方法中，應(yīng)該理解“發(fā)現(xiàn)”意指發(fā)現(xiàn)高水平的Flt4，其水平顯著高于在相應(yīng)正常組織中的幾乎不可檢測或完全不可檢測的水平，如本文中敘述的一樣。通過與用健康生物體組織進(jìn)行的對照實(shí)驗(yàn)比較可以確證所述差異表達(dá)。尤其優(yōu)選篩查哺乳動(dòng)物組織的腫瘤。如上所述，通過給該哺乳動(dòng)物施用與血管內(nèi)皮標(biāo)記特異性結(jié)合的第二種化合物，可以使所述方法容易進(jìn)行，其中檢測步驟包括檢測與血管生成性內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的所述第一種化合物和所述第二種化合物。
由上述還可知，本發(fā)明方法中所用的各種化合物也屬于本發(fā)明。例如，所述化合物包括上述的抗Flt4抗體和雙特異性抗體。同樣，本文所述任何化合物在生產(chǎn)本文所述治療或診斷或顯像所用藥物中的的應(yīng)用(單獨(dú)或聯(lián)合)也屬于本發(fā)明。所述藥物還包括可以藥用的稀釋劑、佐劑、或載體等等。
類似地，本發(fā)明包括試劑盒，其內(nèi)含本發(fā)明的化合物或組合物，其包裝方式有利于實(shí)施本發(fā)明的方法。在最簡單的實(shí)施例中，這類試劑盒包括由密封瓶或罐等容器容納的本發(fā)明化合物或組合物，描述實(shí)施本發(fā)明方法時(shí)化合物或組合物之用途的標(biāo)簽貼在該容器上或含在包裝中。優(yōu)選將化合物或組合物以單位劑量的形式進(jìn)行包裝。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒將Flt4結(jié)合化合物與第二種化合物包裝在一起，所述第二種化合物能結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞表面所表達(dá)的、淋巴管內(nèi)皮中實(shí)質(zhì)上不出現(xiàn)的標(biāo)記物(抗原)。
根據(jù)本申請的全文(包括詳細(xì)的說明書)，本發(fā)明的其它特點(diǎn)和變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，且所有這些特點(diǎn)均為本發(fā)明的方面。同樣，本文所述本發(fā)明的特點(diǎn)可以重新組合成其它的實(shí)施方案，這也被認(rèn)為屬于本發(fā)明，不管這些特點(diǎn)的聯(lián)合是否在上面的敘述中作為本發(fā)明的一個(gè)方面或?qū)嵤┓桨付痪唧w提及。另外，僅有本文中作為本發(fā)明的關(guān)鍵而被敘述的限制才被視為限制；本文未作為關(guān)鍵來描述的本發(fā)明的無限制改動(dòng)也被認(rèn)為屬于本發(fā)明。
除上述以外，本發(fā)明另包括在任何意義上比上述具體變化范圍更小的本發(fā)明所有實(shí)施方案。雖然申請人發(fā)明了所附權(quán)利要求的全部，但其并不想包含其它人在此領(lǐng)域已作的工作。因此，當(dāng)專利局或其它實(shí)體或個(gè)人提請申請人注意某項(xiàng)權(quán)利要求包括了法定的現(xiàn)有技術(shù)時(shí)，申請人保留根據(jù)專利法進(jìn)行修改的權(quán)利，以重新定義該權(quán)利要求的主體，使之特別排除上述法定現(xiàn)有技術(shù)或使之與現(xiàn)有技術(shù)相比有明顯改變。經(jīng)這類權(quán)利要求的修改而定義的本發(fā)明改變也認(rèn)為屬于本發(fā)明。
附圖簡述

圖1A是Flt4cDNA克隆的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖1B是Northern雜交凝膠的照片復(fù)印件。
圖2A-F表示Flt4的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)示意圖和其與Fltl酪氨酸激酶序列進(jìn)行比較的示意圖。
圖3A是克隆子J.1.1和I.1.1的cDNA插入片段的3’末端示意圖。
圖3B是與反義RNA探針和Flt4RNA的長片段形式和短片段形式雜交的放射自顯影照片的復(fù)印件。
圖3C是與反義RNA探針和Flt4 RNA的長片段形式和短片段形式雜交的放射自顯影照片的復(fù)印件。
圖4是凝膠的照片復(fù)印件，描述對不同物種的DNA樣品中Flt4序列的雜交分析。
圖5A-5H描繪了導(dǎo)管內(nèi)腫瘤中表達(dá)VEGFR-3的血管的免疫組化特點(diǎn)。在相鄰的切片(圖5A，B)中，VEGFR-3和PAL-E在充滿癌細(xì)胞的導(dǎo)管周圍染色成形狀相似的“項(xiàng)鏈”狀血管(箭頭)。另一套相鄰的切片對應(yīng)VEGFR-3(圖5C)、層粘連蛋白(圖5D)、膠原XVIII(圖5E)和SMA(圖5F)的染色。PAL-E和VEGFR-3雙染色的切片(圖5G)與VEGFR-3染色的相鄰切片(圖5H)進(jìn)行比較。與受侵襲的導(dǎo)管相鄰的血管為雙陽性(箭頭)，而VEGFR-3陽性血管出現(xiàn)在距離受侵襲導(dǎo)管一小段距離的導(dǎo)管間基質(zhì)中(箭頭)。值得注意的是在雙染色方法中，基底層為PAL-E陽性。放大倍數(shù)圖5A、B為400×，圖5C、D、E、F為320×，圖5E、F為480×。
詳細(xì)描述被稱為Flt4的新型受體酪氨酸激酶的克隆、測序和表達(dá)如下。Flt4基因位于染色體5q35區(qū)，許多生長因子和生長因子受體定位于此。Flt4的胞外結(jié)構(gòu)域由包括12個(gè)強(qiáng)效糖基化位點(diǎn)的7個(gè)免疫球蛋白樣環(huán)組成。根據(jù)結(jié)構(gòu)的相似性，F(xiàn)lt4與先前已知的Fltl和KDR/FLK1受體可以組成III類酪氨酸激酶的亞家族。Flt4基因表達(dá)產(chǎn)物為5.8kb和4.5kb mRNA，它們的區(qū)別在于3’端序列，以及在HEL和DAMI白血病細(xì)胞中的不同表達(dá)。
Wilm’s腫瘤細(xì)胞系、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系和非分化畸胎瘤細(xì)胞系可表達(dá)Flt4，而分化的畸胎瘤細(xì)胞系則為陰性。大部分胎兒組織也表達(dá)Flt4mRNA，其中脾臟、腦中間區(qū)和肺以最高水平表達(dá)。在成人組織中表達(dá)水平最高的是胎盤，肺、腎、心臟和肝臟的表達(dá)依次遞減。在原位雜交中，F(xiàn)lt4的放射自顯影顆粒分布于胎兒肺的內(nèi)皮細(xì)胞。胎兒組織中Flt4的免疫組化染色證實(shí)了內(nèi)皮細(xì)胞的染色。在18周齡的人胎兒組織中Flt4的表達(dá)模式與Fltl和KDR相比存在很大差異。見Kaipainen等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1782077(1993)。
實(shí)施例4和11敘述了含所述Flt4cDNA的表達(dá)載體的產(chǎn)生及在COS和NIH3T3細(xì)胞中的表達(dá)。
本發(fā)明的Flt4DNA和多肽可用于Flt4配體的純化和各種器官中內(nèi)皮細(xì)胞生長和分化的調(diào)節(jié)。它們還被證實(shí)可用于某些疾病的診斷/治療。
在下面的敘述中，大量應(yīng)用了重組DNA(rDNA)技術(shù)的很多術(shù)語。為了使說明書和權(quán)利要求書(包括這些術(shù)語的范圍)明確并一致，給出下述定義。
基因.包含RNA聚合酶的模板的DNA序列。從基因轉(zhuǎn)錄的RNA能或不能編碼蛋白。編碼蛋白的RNA稱為信使RNA(mRNA)，并且在真核生物中由RNA聚合酶II進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。然而，已知如何構(gòu)建包括RNA聚合酶II模板的基因，其中具有與特定mRNA序列互補(bǔ)但通常不翻譯的RNA序列被轉(zhuǎn)錄。這樣的基因構(gòu)建體在本文中稱為“反義RNA基因”并且將這樣的轉(zhuǎn)錄本稱為“反義RNA”。由于在反義RNA中存在翻譯的終止密碼子，反義RNA通常不翻譯。
“互補(bǔ)DNA”或“cDNA”基因包括通過逆轉(zhuǎn)錄缺少插入序列(內(nèi)含子)的mRNA而合成的重組基因。
克隆載體.質(zhì)粒或噬菌體DNA或其它DNA序列，其可以在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，并且其特征在于具有一個(gè)或幾個(gè)內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，可以用可確定的方式在這些位點(diǎn)切割所述DNA序列而不損害載體的基本生物學(xué)功能，并且為引起其復(fù)制和克隆可以將DNA剪接入該位點(diǎn)。所述克隆載體可以還包括適合在克隆載體所轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定中應(yīng)用的標(biāo)記物。例如標(biāo)記物為四環(huán)素抗性標(biāo)記或氨芐青霉素抗性標(biāo)記。單詞“載體”有時(shí)指“克隆載體”。
表達(dá)載體.與克隆載體相似的載體，轉(zhuǎn)化了宿主細(xì)胞后，其可以表達(dá)克隆到該載體的基因。通常將克隆基因置于如啟動(dòng)子序列等調(diào)控序列的控制(即與調(diào)控序列可操作的連接)之下。表達(dá)調(diào)控序列可以變化，其依賴于設(shè)計(jì)載體是用來在原核宿主細(xì)胞中還是在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)可操作的連接的基因，并且其還可以另外包括如轉(zhuǎn)錄元件如增強(qiáng)子元件、終止序列、組織特異性元件和/或翻譯起始和終止位點(diǎn)。
本發(fā)明涉及重組Flt4蛋白(短和長形式)的表達(dá)，并且涉及這些蛋白的功能性衍生物。
功能性衍生物.Flt4蛋白的功能性衍生物為擁有與非重組Flt4蛋白非常相似的生物活性(功能的或結(jié)構(gòu)的)的蛋白。Flt4蛋白的功能性衍生物可以包括或不包括如共價(jià)連接的碳水化合物等翻譯后修飾，這取決于實(shí)現(xiàn)特定功能時(shí)這些修飾的必要性。術(shù)語“功能性衍生物”被認(rèn)為包括分子的“片段”、“變體”、“類似物”和“化學(xué)衍生物”。
與在本文中應(yīng)用的一樣，當(dāng)一種分子包含通常并非其部分的其它化學(xué)部分時(shí)，其被稱為另一個(gè)分子的“化學(xué)衍生物”。這些部分可以改進(jìn)分子的可溶性、吸收性、生物半衰期等。所述部分也可降低分子的毒性并且消除或降低分子的任何不良副作用等。在Remington′s藥理學(xué)(1980)中公開了能夠介導(dǎo)所述作用的部分。用于將這些部分與分子結(jié)合的方法在本領(lǐng)域中眾所周知。
片段Flt4蛋白等分子的片段意指分子的任何部分，例如肽核心或肽核心的變體。
變體Flt4蛋白等分子的變體意指在結(jié)構(gòu)和生物活性上與完整分子或其片段基本相似的分子。因此，如果兩個(gè)分子擁有相似的活性，即使其中一個(gè)分子的組成或次級、三級或四級結(jié)構(gòu)與另一個(gè)分子不同或者氨基酸序列不同，它們也被認(rèn)為是在此作為術(shù)語的變體。
類似物Flt4蛋白或基因序列的類似物意指在功能上與本文中Flt4蛋白或基因序列非常相似的蛋白或基因序列。
優(yōu)選實(shí)施方案描述本發(fā)明涉及被申請人命名為“Flt4”的酪氨酸激酶的受體、編碼Flt4的核苷酸分子(例如cDNA、基因組DNA、RNA、反義RNA等)、由Flt4基因序列及其產(chǎn)物制備Flt4肽或Flt4蛋白產(chǎn)物、重組Flt4表達(dá)載體、Flt4類似物和衍生物以及應(yīng)用Flt4和相關(guān)蛋白、Flt4配體、Flt4拮抗劑和抗Flt4抗體進(jìn)行診斷和/或治療。
重組體Flt4的制備通過在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中克隆和表達(dá)Flt4編碼序列或其功能等價(jià)物，可以制備具有生物活性的Flt4。
為了便于敘述，可以將利用重組DNA技術(shù)制備Flt4的方法分成下列步驟(1)分離或制備目的Flt4編碼序列(基因)；(2)構(gòu)建能夠指導(dǎo)目的Flt4合成的表達(dá)載體；(3)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化能夠復(fù)制并表達(dá)所述Flt4基因，和/或加工該基因產(chǎn)物來產(chǎn)生目的Flt4的適當(dāng)宿主細(xì)胞；和(4)鑒定并純化目的Flt4產(chǎn)物。
分離或制備所述Flt4基因Flt4的核苷酸編碼序列或其功能等價(jià)物可以被用來構(gòu)建重組表達(dá)載體，該載體可指導(dǎo)目的Flt4產(chǎn)物的表達(dá)。在本發(fā)明方法的實(shí)施中，在本文中描述的核苷酸序列或者其片段或功能等價(jià)物可以被用來制備能指導(dǎo)重組Flt4產(chǎn)物在適當(dāng)宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組分子。Flt4編碼序列可以從各種產(chǎn)生Flt4樣活性和/或表達(dá)Flt4mRNA的細(xì)胞來源中獲得。申請者鑒定了大量的對Flt4適合的人細(xì)胞來源，包括人胎盤白血病細(xì)胞以及一些腫瘤細(xì)胞系。
Flt4編碼序列可以通過從這些細(xì)胞來源中分離并純化的RNA的cDNA克隆獲得或通過基因組克隆獲得。例如利用本領(lǐng)域中熟知的技術(shù)，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可以從cDNA或基因組DNA材料中擴(kuò)增Flt4序列?？梢岳帽绢I(lǐng)域熟知的技術(shù)制備克隆子的cDNA或基因組文庫，并且用與Flt4基因的任何部分基本互補(bǔ)的核苷酸探針針對特定的Flt4DNA篩選文庫。全長克隆，即包含目的Flt4的完整編碼區(qū)域的那些克隆，可以被篩選用于構(gòu)建表達(dá)載體?；蛘?，可用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)化學(xué)合成全部或部分Flt4編碼DNA。由于核苷酸編碼序列固有的簡并性，在本發(fā)明方法的實(shí)施中，可以應(yīng)用編碼基本相似或功能上等價(jià)的氨基酸序列的其它DNA序列。這些Flt4核苷酸序列的變化包括缺失、插入或不同核苷酸的替代，其導(dǎo)致得到編碼相同的或在功能上等價(jià)的基因產(chǎn)物的序列。所述基因產(chǎn)物可以包括導(dǎo)致沉寂改變的該序列內(nèi)氨基酸殘基的缺失、插入或代替，因此產(chǎn)生具有生物活性的蛋白。根據(jù)相關(guān)氨基酸的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性的相似性，可以產(chǎn)生此類氨基酸替代。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；帶有具有相似親水性值之無電荷極性頭部基團(tuán)或非極性頭部基團(tuán)的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸；甘氨酸、丙氨酸；天冬酰胺、谷胺酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸。
構(gòu)建Flt4表達(dá)載體利用此信息，可得到能夠提供適當(dāng)量Flt4受體酪氨酸激酶的各種重組DNA載體。利用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)，可以從所述Flt4受體酪氨酸激酶cDNA制備具有相關(guān)結(jié)構(gòu)的其它重組DNA載體，其編碼具有在此鑒定的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的合成蛋白及編碼其它來源的相同家族的蛋白。本技術(shù)的實(shí)例是Flt4受體酪氨酸激酶的轉(zhuǎn)化表達(dá)(見實(shí)施例3和4)。通過轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，所述新發(fā)現(xiàn)的序列和結(jié)構(gòu)信息可以用來制備用于生物學(xué)目的的Flt4受體酪氨酸激酶及其各種結(jié)構(gòu)域。
鑒定表達(dá)Flt4基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)染體或轉(zhuǎn)化體通過至少下列四種常用的方法可以鑒定包含重組編碼序列并表達(dá)具有生物活性的成熟產(chǎn)物的宿主細(xì)胞(a)DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-反義RNA雜交；(b)“標(biāo)記”基因功能的存在或缺乏；(c)通過檢測宿主細(xì)胞中Flt4mRNA轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)來評估轉(zhuǎn)錄水平；(d)通過免疫檢測并最終通過其生物活性測定成熟基因產(chǎn)物。
在第一種方法中，利用包含與Flt4編碼序列同源的核苷酸序列的探針，通過DNA-DNA雜交可以檢測插入到表達(dá)載體中之Flt4編碼序列的存在。
在第二種方法中，根據(jù)特定“標(biāo)記”基因功能(例如胸腺嘧啶核苷激酶活性、抗生素抗性、氨甲喋呤抗性、轉(zhuǎn)化表型、桿狀病毒中包涵體形成等等)的存在或缺失，可以鑒定并篩選所述重組表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)。例如，如果所述Flt4編碼序列插入到載體的標(biāo)記基因序列之內(nèi)，可以通過檢測標(biāo)記基因功能的缺失鑒定包含該編碼序列的重組體?；蛘邔⑺鰳?biāo)記基因與所述Flt4序列串聯(lián)排列，處于相同或不同的用于調(diào)控所述Flt4編碼序列表達(dá)的啟動(dòng)子控制之下。應(yīng)答誘導(dǎo)或篩選的所述標(biāo)記物的表達(dá)提示Flt4編碼序列的表達(dá)。
在第三種方法中，F(xiàn)lt4編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性可以通過雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。例如，利用與所述Flt4編碼序列或其特殊部分同源的探針，通過Northern雜交可以分離并分析多腺苷酸RNA。或者，可以提取所述宿主細(xì)胞的總核酸并用這類探針進(jìn)行雜交檢測。
在第四種方法中，F(xiàn)lt4的表達(dá)可以用免疫學(xué)方法進(jìn)行檢測，例如Western雜交、放射免疫沉淀等免疫檢測、酶聯(lián)免疫檢測等等。然而，成功的表達(dá)系統(tǒng)的最終檢測包括對生物活性Flt4基因產(chǎn)物的檢測。所述宿主細(xì)胞分泌該基因產(chǎn)物時(shí)，從培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞中獲得的無細(xì)胞培養(yǎng)物可以用于Flt4活性的檢測。基因產(chǎn)物不被分泌時(shí)，可分析細(xì)胞裂解物的這類活性。在這兩種情況中，可以檢測與Flt4結(jié)合的配體或Flt4的其它生物活性。
Flt4衍生物、類似物和肽還考慮了與Flt4相關(guān)的衍生物、類似物和肽的制備和應(yīng)用，而且其在本發(fā)明范疇之內(nèi)。與天然Flt4相比，這些衍生物、類似物或肽可以增加或降低生物活性，這依賴于具體應(yīng)用。本發(fā)明的Flt4相關(guān)衍生物、類似物和肽可以通過各種本領(lǐng)域中熟知的方法制備?；蛩胶偷鞍姿缴系姆椒ê筒僮鲗儆诒景l(fā)明的范疇。本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的肽合成法可以用來獲得Flt4肽。在蛋白水平上，通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，多種化學(xué)修飾可以用來制備Flt4樣衍生物、類似物或肽，所述技術(shù)包括但不限定于內(nèi)肽酶(例如溴化氰、胰蛋白酶、糜蛋白酶、V8蛋白酶等等)或外肽酶的特異性化學(xué)切割、乙酰化、甲?；?、氧化等。
優(yōu)選那些保留Flt4配體結(jié)合活性的衍生物、類似物和肽。那些與Flt4配體結(jié)合但不能傳導(dǎo)其應(yīng)答信號(hào)的衍生物、類似物和肽被用作為Flt4抑制劑。那些與Flt4配體結(jié)合且傳遞其應(yīng)答信號(hào)(例如通過涉及細(xì)胞內(nèi)Flt4自我磷酸化的過程)的衍生物、類似物和肽以天然Flt4相同的方式應(yīng)用。用于這類結(jié)合和/或自我磷酸化檢測的優(yōu)選Flt4配體是可從本文所述之PC-3條件培養(yǎng)基中分離的包含約23kd多肽的配體。在下列PCT專利中詳細(xì)敘述了這個(gè)命名為血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)的配體的特點(diǎn)，PCT/F196/00427，1996年8月1日提交，其國際公開號(hào)為WO97/05250；和其要求優(yōu)先權(quán)的美國專利申請優(yōu)先權(quán)文本，所有這些在此全文引入作為參考。
抗Flt4抗體識(shí)別Flt4蛋白或相關(guān)蛋白的多克隆和單克隆抗體的制備也屬于本發(fā)明的范疇。
可用在本領(lǐng)域中已知的各種方法制備針對Flt4抗原決定簇的多克隆抗體。對于抗體的制備，可以通過注射Flt4或合成的Flt4肽免疫各種宿主動(dòng)物(包括但不限定于兔、小鼠、大鼠等)?？梢砸浪拗鞯姆N類應(yīng)用各種佐劑來增強(qiáng)免疫應(yīng)答，佐劑包括但不限定于弗氏(完全或不完全)佐劑、氧化鋁等礦物膠、如溶血卵磷脂等表面活性物質(zhì)、pluronic多元醇、聚陰離子、乳膠油、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚和如BCG(Bacillus Calmette-Guerin)和小棒狀桿菌等可能有用的人佐劑。
利用通過細(xì)胞系連續(xù)培養(yǎng)制備抗體分子的任何技術(shù)，可以制備針對Flt4抗原決定簇的單克隆抗體。這些技術(shù)包括但不限定于最初由Kohler等，自然，256495-497(1975)描述的雜交瘤技術(shù)，和更近期的人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)[Kosbor等，Immunocology Today，472(1983)]及EBV雜交瘤技術(shù)[Cole等，單克隆抗體和癌癥治療，Alan R Liss，Inc，pp.77-96(1985)]。還可以在細(xì)菌中從克隆的免疫球蛋白cDNA制備抗Flt4抗體。利用重組噬菌體抗體系統(tǒng)，可在細(xì)菌培養(yǎng)中迅速產(chǎn)生并篩選抗體，還可對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行遺傳操作。
包含分子獨(dú)特型的抗體片段可以用已知的技術(shù)制備。例如，這些片段包括但不限于F(ab′)2片段，其可以用胃蛋白酶消化抗體分子來產(chǎn)生；Fab′片段，其可以通過還原F(ab′)2片段的二硫鍵來產(chǎn)生；兩個(gè)Fab片段，它們可以通過用木瓜蛋白酶和還原試劑處理抗體分子來產(chǎn)生。
Flt4抗體可用于成熟Flt4和Flt4前體以及亞成分形式的定性和定量檢測、Flt4多肽的親和純化和Flt4生物合成、代謝及功能的說明。Flt4酪氨酸激酶活性的檢測可以作為此類試驗(yàn)中Flt4特異性信號(hào)之產(chǎn)生和擴(kuò)增的酶方法。Flt4抗體還可以用作為診斷和治療藥物。
Flt4、編碼Flt4的核酸分子和抗Flt4抗體的應(yīng)用申請者考慮了本發(fā)明組合物的各種廣泛應(yīng)用，包括Flt4、Flt4類似物和衍生物、編碼Flt4的核酸分子、反義核酸分子和抗Flt4抗體的診斷和/或治療應(yīng)用。
編碼Flt4的核酸分子或其片段可以作為用來檢測和定量編碼Flt4的mRNA的探針。應(yīng)用核酸探針來檢測已知基因的全部或部分序列的檢測方法在本領(lǐng)域眾所周知。Flt4mRNA水平可以提示惡性腫瘤的出現(xiàn)和/或存在以及提示其它人類疾病的開始和/或發(fā)展。因此，能檢測并定量Flt4mRNA的試驗(yàn)可以為此提供有價(jià)值的診斷工具。
可在以消除Flt4的存在或下調(diào)其水平為目的的治療中，用反義Flt4RNA分子有效抑制編碼Flt4之mRNA的翻譯。例如，當(dāng)Flt4與致病有關(guān)(如由于其過表達(dá))時(shí)，對這類疾病的治療可用Flt4反義RNA作為Flt4拮抗劑。
另外，F(xiàn)lt4反義RNA有助于解釋Flt4的功能機(jī)制。Flt4的核酸分子可以用于產(chǎn)生本文分別論述的重組Flt4蛋白和相關(guān)分子。
抗Flt4抗體可以在多種情況中用于診斷和定量Flt4。例如，抗Flt4各種結(jié)構(gòu)域的抗體可以作為Flt4免疫分析或免疫組化評估的基礎(chǔ)。Flt4的酪氨酸激酶活性可以有助于這些檢測，因?yàn)榭蓪lt4信號(hào)的的產(chǎn)生用酶反應(yīng)擴(kuò)大化?？笷lt4抗體還有助于研究細(xì)胞表面Flt4的量。
可以制備作為Flt4配體激動(dòng)劑或拮抗劑的抗體，并因此使Flt4活性的調(diào)節(jié)成為可能。另外，可合成或從隨機(jī)寡核苷酸中重組產(chǎn)生隨機(jī)肽，并可利用Flt4胞外結(jié)構(gòu)域篩選與所述Flt4受體特異性結(jié)合的隨機(jī)肽。還可用Flt4胞外結(jié)構(gòu)域按本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法從噬菌體展示文庫中篩選此類肽片段。這類肽可能具有激動(dòng)或拮抗活性。與各種用于在體內(nèi)使表達(dá)Flt4的細(xì)胞和組織或腫瘤顯像的化合物結(jié)合后，F(xiàn)lt4抗體還提供了有用的診斷工具。
抗Flt4的單克隆抗體可以與適當(dāng)?shù)某?、順磁、電子密集、產(chǎn)生回波的(echogenic)或放射活性試劑以共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵結(jié)合，制備靶向顯像試劑。可以用通過蛋白水解或化學(xué)處理產(chǎn)生的抗體片段或利用單克隆抗體的抗原決定簇結(jié)合結(jié)構(gòu)域制備的分子替代完整的抗體。然后此顯像試劑將作為對照試劑用于診斷目的的人體X-射線、磁共振、超聲或閃爍顯像。
Flt4的分子生物學(xué)SEQ ID No1和3所示Flt4cDNA克隆的完整序列，依據(jù)兩種不同的剪接分別延伸4195或4795個(gè)核苷酸并包括1298或1363個(gè)氨基酸的開放閱讀框架。所述核苷酸和推導(dǎo)的Flt4氨基酸序列(短形式)見SEQ ID Nos1和2所示。圖2描繪了Flt4氨基酸序列與Fltl酪氨酸激酶氨基酸序列的比較。見Shibuya等，癌基因，5519-524(1990)。
在起始甲硫氨酸之后為推測的大部分是疏水氨基酸的信號(hào)肽序列。相應(yīng)ATG周圍的序列與共有的轉(zhuǎn)錄起始序列一致[Kozak，核酸研究，158125-8135(1987)]。預(yù)測的兩個(gè)Flt4多肽的細(xì)胞外部分長度均為775個(gè)氨基酸，并且包括12個(gè)用于天冬酰胺連接的糖基化(NXS/T)的潛在位點(diǎn)。其還包括顯示免疫球蛋白超家族幾個(gè)成員的間距模式的幾個(gè)氨基酸殘基[Willams等，免疫學(xué)年鑒(Annu Rev Immunol)，6381-405(1988)]。其有12個(gè)半胱氨酸殘基并且它可以組織成7個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。預(yù)測的Ig樣結(jié)構(gòu)域IV缺少半胱氨酸殘基。圖2還顯示了Fltl胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID No.5)，其為與Flt4最相似的人型同系物。從此圖中可以看到半胱氨酸殘基的排列和非常相似的Ig樣區(qū)域的組成。
由23個(gè)疏水氨基酸殘基組成的推測的跨膜結(jié)構(gòu)域域?qū)麧{結(jié)構(gòu)域與胞外結(jié)構(gòu)域分離。該序列在細(xì)胞質(zhì)一側(cè)為一個(gè)堿性區(qū)，它提示跨膜結(jié)構(gòu)域與胞漿結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。酪氨酸激酶同源結(jié)構(gòu)域起始于殘基843，包括ATP結(jié)合口袋，并在Y1068上推測有與c-src之Y416同源的自我磷酸化位點(diǎn)(圖2)。Flt4的酪氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域被包含65個(gè)氨基酸的一個(gè)序列(氨基酸944-1008)分成兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，所述65個(gè)氨基酸序列大部分是親水性氨基酸并且與Flt1沒有同源性。與Flt1不一樣，F(xiàn)lt4在其激酶插入片段中不包括酪氨酸殘基。
第二種Flt4mRNA具有另一種3′末端，其編碼更長形式的Flt4蛋白。
在圖3A-3C中，說明了通過兩種不同剪接產(chǎn)生的短形式和長形式Flt4mRNA。圖3A給出了克隆J.1.1和I.1.1之cDNA插入片段3′末端的結(jié)構(gòu)示意圖。指出了克隆J.1.1的TAG終止密碼子以及聚腺苷酸化(polyA)位點(diǎn)?？寺.1.1與克隆J.1.1的不相同區(qū)域用陰影表示(分別為長形式和短形式Flt4mRNA)。TAA和polyA表明克隆I.1.1的終止密碼子和聚腺苷酸位點(diǎn)。另外，還指出了EcoRI和AvaI的酶切位點(diǎn)。下面給出的是克隆I.1.1中用于cDNA保護(hù)性分析的256 bp EcoRI-AvaI插入片段。濃陰影部分表明用于在體外轉(zhuǎn)錄反義鏈的線性化正義RNA模板中多接頭的序列。還顯示了在RNA酶保護(hù)性分析之后被保護(hù)片段的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3B和3C顯示了256bp35S標(biāo)記的反義RNA探針以及211和124bp消化片段的放射自顯影圖，所述兩片段分別為Flt4 RNA在特定細(xì)胞系(Tera-2為惡性畸胎瘤細(xì)胞系，在此用或不用視黃酸(RA)處理10天后對其進(jìn)行分析)中受到聚腺苷酸化RNA保護(hù)時(shí)的長形式和短形式。(陰性)對照泳道顯示了用轉(zhuǎn)移RNA進(jìn)行保護(hù)的結(jié)果?？梢奣era-2細(xì)胞分化期間Flt4mRNA的下調(diào)。Tera-2細(xì)胞系的克隆13由C.F.Granham博士(牛津大學(xué)動(dòng)物學(xué)系，英國)提供。在本研究中應(yīng)用傳代18-40代的細(xì)胞。在含10％胎牛血清和抗生素的Eagle′s基本培養(yǎng)基(MEM)中培養(yǎng)細(xì)胞。為了誘導(dǎo)分化，將細(xì)胞平鋪于明膠覆蓋的組織培養(yǎng)級培養(yǎng)皿中，其密度為1.5X1013細(xì)胞/cm2。在第二天，向培養(yǎng)基中加入2×10-6MRA。在RA存在的條件下培養(yǎng)細(xì)胞直到10天。
圖3A-C所示結(jié)果表明經(jīng)兩種不同剪接產(chǎn)生Flt4的這兩種形式(短和長)的羧基末端。
根據(jù)Flt4推導(dǎo)的氨基酸序列，其屬于III類RTK。更具體地說，F(xiàn)lt4屬于RTK亞家族，其胞外部分包括7個(gè)Ig環(huán)，因此它不同于III類RTK中包含5個(gè)Ig環(huán)的其它成員。Flt4與FLT家族的原型受體Flt1以及小鼠KLK1受體具有最高特異性，其中Flt1是從一個(gè)人類基因組DNA文庫中克隆的v-ros相關(guān)DNA[Shibuya等，癌基因，5519-524(1990)]，KLK1是從富含造血干細(xì)胞的小鼠肝臟級分中克隆的[Matthews等，細(xì)胞，651143-1152(1991)；Matthews等，美國國家科學(xué)院院刊，889026-9030(1991)]。Flt4的胞外結(jié)構(gòu)域與人Flt1和小鼠FLK1分別有33％和37％的氨基酸序列同一性。與Flt4一樣，F(xiàn)lt1和FLK1在各種正常組織中有廣泛的表達(dá)，例如肺、心臟和腎臟等。另外，最近鑒定的人內(nèi)皮細(xì)胞受體酪氨酸激酶KDR[Terman等，癌基因，61677-1683(1991)]顯示與Flt4和Flt1家族成員具有相當(dāng)?shù)耐葱?。從可用的序列資料中計(jì)算發(fā)現(xiàn)KDR與Flt4在酪氨酸激酶(TK)結(jié)構(gòu)域有81％同一性。另外，KDR的胞外結(jié)構(gòu)域也有7個(gè)Ig環(huán)結(jié)構(gòu)并且其TK1和TK2結(jié)構(gòu)域與小鼠FLK1受體的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域有95％和97％的同一性。這表明KDR是小鼠FLK1的人類同系物。
雖然Flt4TK結(jié)構(gòu)域與Flt1和FLK1/KDR的TK結(jié)構(gòu)域大約有80％相同，但是其與III類RTK的其它受體的TK結(jié)構(gòu)域只有大約60％相同。因?yàn)檫@些其它受體在胞外結(jié)構(gòu)域中僅具有5個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域，可將Flt4、Flt1和FLK1/KDR劃歸III類RTK家族中一個(gè)獨(dú)立的FLT亞家族。
在PDGFR、c-fms和c-kit的激酶插入片段中位于D/E-D/E-Y-M/V-P/D/E-M[Cantley等，細(xì)胞，64281-302(1991)](SEQ ID NO.6)序列中的酪氨酸殘基為自我磷酸化位點(diǎn)，其在磷酸化時(shí)結(jié)合磷脂酰肌醇3′激酶(PI-3K)的SH2結(jié)構(gòu)域[Reedijk等，EMBO J.111365-1372(1992)]。有趣的是，與這些III類RTK不同，F(xiàn)LT亞家族成員或Flt3/FLK2受體不包含這些保守的基序。
8個(gè)人類III類RTK基因集結(jié)在3個(gè)不同的染色體上。4號(hào)染色體上含有c-kit、PDGFR-α和KDR基因[Yarden等，EMBO J.，63341-3351(1987)；Stehman等，基因、染色體、癌癥，1155-158(1989)；Terman等，癌基因，61677-1683(1991)1。Flt1和Flt3位于13號(hào)染色體的q12區(qū)[Satoh等，日本癌癥研究雜志，78772-775(1987)；Rosnet等，基因組學(xué)(Genomics)，9380-385(1991)]，而Flt4位于5號(hào)染色體q35帶[Aprelikova等，癌癥研究，52746-748(1992)]；靠近fms和PDGFR-β基因[warrington等，基因組學(xué)，11701-708(1991)]。5號(hào)染色體的長臂與在白血病細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的易位有關(guān)。在頑固性貧血和巨紅細(xì)胞癥患者骨髓細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)5號(hào)染色體長臂的部分缺失[Van Den Berghe等，自然，25l437-439(1974)]。在幾個(gè)其它骨髓增生性疾病中發(fā)現(xiàn)5q染色體異常，如拌有過量胚細(xì)胞的頑固性貧血[Swolin等，血液，58986-993(1981)]，原因不明的髓樣化生[Whang-Peng等，白血病研究，241-48(1978)]，慢性髓源性白血病[Tomiyasu等，癌癥遺傳學(xué).細(xì)胞遺傳學(xué)，2309-315(1980)]，原發(fā)性脾大性紅細(xì)胞增多(polycythemia vera)[VanDen Berghe等，癌癥遺傳學(xué).細(xì)胞遺傳學(xué)，1157-162(1979)]和特發(fā)性血小板增多[Nowell等，癌癥，422254-2260(1978)]。
關(guān)于Flt4mRNA表達(dá)的發(fā)現(xiàn)表明其蛋白產(chǎn)物為某些白血病細(xì)胞特有。已表明成巨核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞間存在幾個(gè)共同的分化抗原，例如血小板糖蛋白IIIa[Ylanne等，血液，721478-1486(1988)；Kieffer等，血液，721209-1215(1998)；Berridge等，血液，6676-85(1985)]。另外，胚胎期某些內(nèi)皮細(xì)胞，如肺和腎的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Flt4。
為了進(jìn)一步理解Flt4在發(fā)育期間的作用，克隆了小鼠Flt4的部分cDNA。在原位雜交中應(yīng)用這些探針分析了小鼠發(fā)育期間Flt4mRNA的表達(dá)。確定了在淋巴系統(tǒng)的淋巴管發(fā)生和淋巴管生成期間表達(dá)Flt4。還在正常的和病理狀態(tài)的成人組織中證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)的關(guān)聯(lián)性，例如在正常和病理?xiàng)l件下的成人組織的淋巴管內(nèi)皮及一些高內(nèi)皮小靜脈(HEVs)中均發(fā)現(xiàn)了Flt4。
小鼠Flt4cDNA片段的克隆表明其推導(dǎo)的氨基酸序列與人的相應(yīng)序列幾乎相同(在所研究的兩個(gè)片段中氨基酸同源性大約96％)。從Northern雜交實(shí)驗(yàn)中獲得了對于小鼠Flt4cDNA同一性的進(jìn)一步證據(jù)，其中兩個(gè)物種的探針均在小鼠組織中產(chǎn)生典型的5.8kb mRNA信號(hào)。對從成年小鼠組織中分離的RNA的分析表明Flt4在肝臟、肺、心臟、脾和腎臟中表達(dá)，而在腦組織和睪丸中沒有或有非常少的雜交。此模式與早期由Galland等，癌基因，81233(1993)中報(bào)道的模式相似。RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，小鼠發(fā)育期間，從交配后8.5天開始就需要Flt4基因，其相對表達(dá)水平較穩(wěn)定。
為了進(jìn)行原位雜交，篩選了兩個(gè)編碼胞外結(jié)構(gòu)域序列的小鼠Flt4cDNA片段。這可使Flt4與相關(guān)的FLK-1和Flt1受體(其與Flt4在胞外區(qū)的序列同一性很低)的雜交模式明確區(qū)分。見Millauer等，細(xì)胞，72835(1993)；Yamaguchi等，發(fā)育，118489(1993)；Peters等，美國國家科學(xué)院院刊，908915(1993)；Finnerty等，癌基因，82293(1993)。
與FLK-1、Flt1、Tie和Tek內(nèi)皮受體酪氨酸激酶基因相似，F(xiàn)lt4在交配后(p.c.)7.5天的胚胎中不表達(dá)。在交配后8.5天的胚胎中，最強(qiáng)的Flt4信號(hào)位于尿囊、腦間充質(zhì)的成血管細(xì)胞、背側(cè)大動(dòng)脈和主靜脈。在心內(nèi)膜中可見弱信號(hào)。相反，與FLK-1和Flt1、Tie和Tek不同的是，F(xiàn)lt4在卵黃囊的成血管細(xì)胞中為陰性。見Korhonen等，癌基因，8395(1993)；和Peters等，美國國家科學(xué)院院刊，908915(1993)。Flt4表達(dá)限定于靜脈系統(tǒng)的現(xiàn)象在11.5天小鼠胚胎樣品中更清楚，而此時(shí)Tie mRNA在動(dòng)脈中也表達(dá)。在交配后12.5的胚胎中，F(xiàn)lt4信號(hào)分布于發(fā)育中的靜脈和可能的淋巴管內(nèi)皮中，但是與內(nèi)皮的Tie受體酪氨酸激酶不同的是，其在動(dòng)脈內(nèi)皮中為陰性。在發(fā)育后期，F(xiàn)lt4mRNA僅限于不含血細(xì)胞的血管叢(其代表發(fā)育中的淋巴管)中。在成人組織中，只有淋巴管內(nèi)皮和一些高內(nèi)皮小靜脈表達(dá)Flt4mRNA。表達(dá)的增加可見于淋巴竇和高內(nèi)皮小靜脈、轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)，以及淋巴管瘤。
由于解釋來自小鼠胚胎的資料有困難，研究了人的內(nèi)皮，因?yàn)槿说牧馨拖到y(tǒng)更明確。還可以在細(xì)胞培養(yǎng)中研究從各種內(nèi)皮中建立的細(xì)胞，以驗(yàn)證在體外條件下是否保持特異性Flt4表達(dá)。已知內(nèi)皮細(xì)胞系在體外培養(yǎng)中將失去分化特點(diǎn)。因此，預(yù)計(jì)它們?yōu)镕lt4mRNA陰性。培養(yǎng)的動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞也無Flt4mRNA。然而，人的微脈管系統(tǒng)、股動(dòng)脈和臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞中也獲得了信號(hào)。因此，F(xiàn)lt4表達(dá)的特異性在細(xì)胞培養(yǎng)中至少保留了部分。
成人組織的原位雜交分析證實(shí)了在發(fā)育的小鼠胚胎中見到的Flt4限定于淋巴系統(tǒng)的現(xiàn)象。在人淋巴結(jié)的淋巴內(nèi)皮和竇中發(fā)現(xiàn)Flt4表達(dá)。有趣的是部分HEVs也為Flt4陽性，它們具有方狀內(nèi)皮，在白細(xì)胞到淋巴結(jié)的運(yùn)輸中起作用。而且，平行雜交分析表明，與正常淋巴結(jié)相比，在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的這些結(jié)構(gòu)中Flt4mRNA水平增加。Flt4在淋巴管瘤中也非常明顯，所述淋巴管瘤為良性腫瘤，其由結(jié)締組織基質(zhì)和正生長的內(nèi)皮狀排列的淋巴管道組成。Flt4mRNA被限定于這些腫瘤的淋巴管內(nèi)皮中，而且在其動(dòng)脈、靜脈和毛細(xì)血管中缺乏。在人肺中，僅淋巴結(jié)構(gòu)被鑒定為Flt4陽性脈管。
上述的結(jié)果表明Flt4是成人組織中淋巴管和一些高內(nèi)皮小靜脈的新標(biāo)記物。這些結(jié)果還支持淋巴管起源于靜脈的理論。作為生長因子受體，F(xiàn)lt4可能參與這些脈管的分化和功能。在1996年8月1日提交的PCT/FI96/00427(國際公開號(hào)WO97/05250)中提供了Flt4與Flt4配體(VEGF-C)所介導(dǎo)的生物效應(yīng)的詳細(xì)特征。
根據(jù)這些結(jié)果，以及本發(fā)明的Flt4結(jié)合化合物，可以選擇性標(biāo)記淋巴內(nèi)皮，尤其可利用與放射活性、電子密度或其它可視受體物質(zhì)偶聯(lián)的本發(fā)明抗體。可向淋巴系統(tǒng)中注射含有誘導(dǎo)Flt4受體內(nèi)在化的單克隆抗體或配體的物質(zhì)，并因此將指定分子導(dǎo)入淋巴內(nèi)皮中。還可用本發(fā)明的Flt4結(jié)合化合物檢測高內(nèi)皮小靜脈，尤其是Flt4受體表達(dá)水平增高的活化HEV。據(jù)我們了解，目前針對淋巴管內(nèi)皮尚無如此特異性的標(biāo)記物。
以下實(shí)施例僅為舉例說明本發(fā)明，并非對發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例1編碼Flt4的cDNA克隆的分離及鑒定材料和方法以oligo-dT為引物，在噬菌體λgtll中的人HEL細(xì)胞cDNA文庫[Mortimer Poncz博士惠贈(zèng)，費(fèi)城兒童醫(yī)院；Poncz等，血液，69219-223(1987)]用來自相同文庫的經(jīng)過PCR擴(kuò)增的cDNA片段進(jìn)行篩選[Aprelikova等，癌癥研究，52746-748(1992)]。按[Sambrook等，分子克隆-實(shí)驗(yàn)室指南，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989)]中敘述的方法，鑒定并純化陽性噬菌斑。分離λ噬菌體的cDNA插入子作為EcoRI片段并將其亞克隆到GEM3Zf(+)質(zhì)粒(Promega)。分離完整的Flt4蛋白編碼區(qū)域。根據(jù)所獲序列設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，用于經(jīng)雙脫氧鏈終止法對從HEL-文庫中分離的三個(gè)重疊克隆(如圖1所示)測序。對所述cDNA兩條鏈的所有部分均進(jìn)行測序。用GCG軟件包進(jìn)行序列分析[Devereux等，核酸研究，12387-395(1984)和Prosite programs forApple MacIntosh]。
圖1A為所分析的Flt4cDNA克隆的結(jié)構(gòu)示意圖。箭頭表示亞克隆的限制性片段(其單位為kb)，其用于探測圖1B所示的Northern印跡。E＝EcoRI位點(diǎn)，S＝SphI位點(diǎn)。圖1B為用圖1A所示探針對DAMI和HEL白血病細(xì)胞RNA的Northern雜交分析。
結(jié)果通過PCR克隆法從HEL細(xì)胞cDNA文庫中分離的210bp長Flt4cDNA片段被用作分子探針以篩選oligo-dT為引物的人紅白血病cDNA文庫。
對克隆子的核酸序列分析揭示了包含1298個(gè)氨基酸殘基的一個(gè)開放閱讀框架(SEQ ID NO2，圖2)。在圖中標(biāo)出的翻譯起始點(diǎn)甲硫氨酸被一個(gè)常見的保守序列[Kozak，核酸研究，12857-872(1984)]包圍并且其后跟著一個(gè)疏水性氨基酸序列，該序列具有轉(zhuǎn)位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)序列的特征。
Flt4的胞外結(jié)構(gòu)域可以排列成7個(gè)免疫球蛋白樣環(huán)(圖2)。此圖還給出了Flt4與結(jié)構(gòu)非常相似的Flt1的比較。Flt1的氨基酸序列見SEQ ID NO5所示。
氨基酸775-798構(gòu)成序列的疏水性區(qū)域，其功能可能是作為受體的跨膜結(jié)構(gòu)域，其后跟著若干堿性殘基，它們位于所述序列的推測細(xì)胞質(zhì)側(cè)。酪氨酸激酶同源序列始于氨基酸842處，它前面為44個(gè)殘基的近膜結(jié)構(gòu)域。一段65個(gè)氨基酸的激酶插入片段使同源序列在所述受體羧基端的1175氨基酸處首次中斷同源性。在氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(Swissprot & NBRF)中對相關(guān)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的搜索發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lt4和PDGRB酪氨酸激酶在催化性酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中分別具有約80％和60％的同源性。
實(shí)施例2抗Flt4抗血清的制備將657 bp EcoRI片段(其編碼預(yù)測的Flt4短形式的C末端)與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶編碼區(qū)克隆到pGEX-1λT細(xì)菌表達(dá)載體中的同一閱讀框架內(nèi)，以便在大腸桿菌中產(chǎn)生GST-Flt4融合蛋白。所得融合蛋白在細(xì)菌中產(chǎn)生，并且按說明書用谷胱甘肽親和層析法純化。用此蛋白免疫家兔以制備抗Flt4多克隆抗體。在第三次加強(qiáng)免疫后，取抗血清備用。
實(shí)施例3COS細(xì)胞中Flt4的表達(dá)材料和方法將全長Flt4蛋白編碼序列(由3個(gè)克隆組合而成，圖1)插入SVpoly哺乳動(dòng)物表達(dá)載體[Stacey等，核酸研究，182829(1990)]構(gòu)建體SV14-2的HindIII-BamHI位點(diǎn)。通過DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法[McCutchan等，J.Natl.CancerInst，41351-357(1968)]，將表達(dá)載體(短SV-FLT4和長SV-FLT4，包括相應(yīng)形式的Flt4 cDNA)導(dǎo)入COS細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染兩天后，用磷酸緩中液(PBS)洗滌細(xì)胞并將其刮到免疫沉淀緩中液中(10mM Tris pH7.5，50mM NaCl，0.5％去氧膽酸鈉，0.5％Nonidet P40，0.1％SDS，0.1 TIU/ml抑酶肽)。超聲處理細(xì)胞裂解物，10000×g離心15分鐘并與3ml抗血清在冰上保溫過夜。加入蛋白A sepharose并繼續(xù)旋轉(zhuǎn)保溫30分鐘。在SDS-PAGE分析之前，用免疫沉淀緩沖液洗滌沉淀物四次，用PBS和水各洗滌一次。
結(jié)果通過將全長Flt4短及長形式蛋白編碼區(qū)克隆到pSVpoly表達(dá)載體的HindIII-BamHI位點(diǎn)并將這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞中，檢測了Flt4cDNA序列的結(jié)構(gòu)預(yù)測。通過這兩個(gè)構(gòu)建體制備的蛋白在C末端存在差異長形式包含額外的65個(gè)氨基酸。在轉(zhuǎn)染兩天后，裂解細(xì)胞并利用抗GST-Flt4融合蛋白抗體進(jìn)行免疫沉淀，其中GST-Flt4融合蛋白包括預(yù)測的Flt4蛋白短形式的40個(gè)羧基末端氨基酸(即Flt4的短形式和長形式共有的部分)。通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析免疫沉淀的多肽。免疫前的血清未發(fā)現(xiàn)任何特異性條帶，而Flt4特異性抗體識(shí)別大約170KD和190KD的兩條條帶。這兩條帶可以代表Flt4蛋白的不同糖基化形式。
實(shí)施例4NIH3T3細(xì)胞中Flt4的表達(dá)材料和方法將全長Flt4cDNA(短形式)亞克隆至包含Moloney鼠類白血病病毒長末端重復(fù)的啟動(dòng)子的LTRpoly載體(見Makela等，基因，118293-294(1994)，其公開了pLTRpoly載體，其ATCC登記號(hào)為77109，Genebank登記號(hào)為X60280)。此LTR-FLT4表達(dá)載體與pSV2neo標(biāo)記質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到NIH3T3細(xì)胞，分析G418抗性克隆的Flt4表達(dá)。
為了進(jìn)行Western免疫雜交分析，將一個(gè)大融合平板上的細(xì)胞在2.5％SDS、125mM Tris、pH6.5中裂解。將細(xì)胞裂解物在SDS-PAGE上進(jìn)行電泳并電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。將此膜與抗Flt4羧基末端肽的抗血清一起保溫，用偶聯(lián)辣根過氧化物酶的豬抗兔抗血清(Dako)和ECL試劑(Amersham)使結(jié)合的抗體顯色。為了對代謝進(jìn)行標(biāo)記，用100μCi/ml35S-甲硫氨酸標(biāo)記所述培養(yǎng)物1小時(shí)。標(biāo)記之后，洗滌細(xì)胞兩次并在其生長培養(yǎng)基中溫育1或2小時(shí)，裂解細(xì)胞，用抗Flt4抗體進(jìn)行免疫沉淀，并且通過SDS-PAGE和熒光自顯影進(jìn)行分析。
結(jié)果在Flt4短形式轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞中可以檢測到170KD和190KD多肽，而在僅轉(zhuǎn)染pSV2neo的細(xì)胞中則未檢測到。除了這兩條帶，在產(chǎn)生Flt4的克隆中發(fā)現(xiàn)了約120Kd的一條明顯帶。代謝標(biāo)記和脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)表明此蛋白短形式Flt4多肽翻譯后加工的產(chǎn)物。
實(shí)施例5 Flt4基因座的染色體定位因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)一些III類受體基因簇，故確定Flt4的染色體位置非常重要。因此分析了嚙齒類動(dòng)物-人類細(xì)胞的雜交細(xì)胞，表明Flt4連鎖于人的5號(hào)染色體。
利用攜帶部分染色體5s的雜交細(xì)胞確定Flt4基因位于5q33-＞5qter區(qū)。通過膜雜交檢測這些雜交細(xì)胞是否存在Flt4基因座。Flt4陽性雜交細(xì)胞共有而在Flt4陰性雜交細(xì)胞中缺陷的5號(hào)染色體區(qū)域是5q33.1-qer。因此雜交細(xì)胞中人類染色體5q33-qer的存在與Flt4序列的存在相關(guān)。所述區(qū)域定位結(jié)果表明Flt4基因座與CSGlR/血小板衍生生長因子受體β(PDGFRB)基因座以及β腎上腺素能受體(ADRBR)基因座相對應(yīng)(is telomeric to)，因?yàn)檫@些基因座在Flt4陰性的雜交細(xì)胞GBl3中均存在。
實(shí)施例6腫瘤細(xì)胞系和內(nèi)皮細(xì)胞中Flt4mRNA的表達(dá)在本研究中應(yīng)用的白血病細(xì)胞系在幾個(gè)以前的出版物中已經(jīng)報(bào)道，即K562[Lozzio等，血液，45321-334(1975)]，HL-60[Collins等，自然，270347-349(1977)]，HEL[Martin等，科學(xué)，2161233-1235(1982)]，DAMI[Greenberg等，血液，721968-1977(1988)]，MOLT-4[Minowada等，J Nalt Cancer Inst，49891-895(1972)]，Jurkat[Schwenk等，Blut，31299-306(1975)]，U937[Sundstrom等，國際癌癥雜志，17565-577(1976)]，KG-1[Koeffler等，科學(xué)，2001153-1154(1978)]，JOK-1[Aandersson等，1982，在R.F.Revoltella(編)，腫瘤細(xì)胞中分化功能的表達(dá)，239-245，Raven出版社，紐約]和ML-2[Gahmberg等，1985，在L.C.Andersson等(編.)，正常分化和惡性分化期間的基因表達(dá)，107-123，Academic出版社，倫敦]。還分析了從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得的下述腫瘤細(xì)胞系JEG-3絨毛膜癌；A204橫紋肌肉瘤；SK-NEP-1腎母細(xì)胞瘤；BT-474乳腺癌；Y79視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。在含10％胎牛血清(FCS)和抗生素的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述白血病細(xì)胞。在含10％馬血清的Iscove′s改良型DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)Dami細(xì)胞。在含10％FCS和抗生素的DMEM-HAT培養(yǎng)基中，培養(yǎng)由原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與A549肺癌細(xì)胞融合獲得的永生化內(nèi)皮雜交細(xì)胞[Edgell等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，503734-3737(1983)]。
按報(bào)道的方法[Sambrook等，見上述]從所述細(xì)胞系提取Poly(A)+RNA。取5μg Poly(A)+RNA在含甲醛的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并在標(biāo)準(zhǔn)條件[sambrook等，見上述]下進(jìn)行印跡。用隨機(jī)引物法標(biāo)記Flt4cDNA克隆的插入片段并且與上述印跡進(jìn)行雜交。在下述溶液中42℃雜交18-24小時(shí)，即含50％甲酰胺、5X Denhardt′s溶液(100X Denhardt′s溶液為Ficoll、聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白各2％)、5X SSPE(3M NaCl，200mM NaH2PO4·H2O，20mM EDTA，pH7.0)、0.1％SDS(十二烷基磺酸鈉)和0.1mg/ml超聲處理的鮭精DNA的溶液。在1X SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸鈉，pH7.0)、0.1％SDS中65℃洗滌雜交膜并于Kodak XAR-5膠片上曝光。
用從8個(gè)白血病細(xì)胞系(HEL、K562、DAMI、U937、MOLT4、HL60、Jurkat和KG-1)和內(nèi)皮雜交細(xì)胞系(EAhy926)中提取的Poly(A)+RNA進(jìn)行Northern分析。用與GAPDH探針的雜交作為內(nèi)對照，用來分析RNA平均上樣量。只有HEL紅白血病細(xì)胞和DAMI成巨核細(xì)胞白血病的細(xì)胞表達(dá)5.8kb和4.5kb的Flt4mRNA。在K562紅白血病、Jurkat和MOLT-4T細(xì)胞白血病以及HL-60前髓細(xì)胞白血病、U937單核細(xì)胞白血病和KG-1髓樣白血病的細(xì)胞中Flt4 mRNA為陰性。
用從5個(gè)腫瘤細(xì)胞系(JEG-3、A-204、SK-NEP-1、BT-474和Y79)和兩個(gè)上述的白血病細(xì)胞系(JOK-1、MOLT4)中提取的Poly(A)+RNA進(jìn)行Northern分析。用標(biāo)記的S2.5cDNA克隆作為雜交探針。用與β-肌動(dòng)蛋白探針的雜交作為內(nèi)對照，用來分析RNA平均上樣量。發(fā)現(xiàn)只有SK-NEP-1腎母細(xì)胞瘤和Y79視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中有Flt4轉(zhuǎn)錄。
用載體(vehicle)(-)或視黃酸(+)處理以誘導(dǎo)神經(jīng)元分化，10天后分析了Tera-2畸胎瘤細(xì)胞[Thompson等，細(xì)胞科學(xué)雜志，7237-64(1984)]。在從所述細(xì)胞中分離的Poly(A)+RNA的Northern雜交中發(fā)現(xiàn)未分化細(xì)胞表達(dá)5.8kb和4.7kb的Flt4mRNA，但是10天分化之后，在Northern印跡和雜交中不能檢測到Flt4mRNA。這些結(jié)果說明在這些細(xì)胞分化期間Flt4下調(diào)。
還分析了未分化和TPA誘導(dǎo)分化的HEL細(xì)胞的Flt4mRNA表達(dá)。HEL和DAMI細(xì)胞系均擁有紅細(xì)胞/成巨核細(xì)胞雙表型，并且通過用腫瘤促進(jìn)劑12-O-四葵酰佛波醇-13乙酸酯(TPA)處理可以進(jìn)一步表達(dá)成巨核細(xì)胞標(biāo)記物。我們分析了在這些細(xì)胞分化期間Flt4表達(dá)是否受到刺激。在用TPA或用來溶解TPA的DMSO處理2天后，分析了HEL細(xì)胞。在剝離Flt4信號(hào)后，用Rb-1和β-肌動(dòng)蛋白cDNA探針進(jìn)行雜交，來證實(shí)泳道的平均負(fù)載。根據(jù)放射自顯影光密度掃描分析并針對GAPDH基因組成型表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化之后，確定當(dāng)在TPA誘導(dǎo)的HEL細(xì)胞進(jìn)行成巨核細(xì)胞分化時(shí)其Flt4mRNA水平增加約3.4倍。
實(shí)施例7胚肺中Flt4的表達(dá)原位雜交在大學(xué)中心醫(yī)院和芬蘭Turku大學(xué)的聯(lián)合倫理委員會(huì)的許可下，得到15周齡人胚肺組織。用10％甲醛將樣品4℃固定18小時(shí)，脫水，石蠟包埋，切為6μm切片。用SP6和T7聚合酶及[35S]-UTP從線性化質(zhì)粒DNA中制備206和157個(gè)堿基(反義和正義)的RNA探針。根據(jù)Wilkinson等，發(fā)育，99493-500(1987)；Wilkinson，細(xì)胞，5079-88(1987)中的萬法進(jìn)行切片原位雜交，有如下的修改1)在石蠟包埋前應(yīng)用二甲苯而不是甲苯；2)將切為6μm的切片放置在用2％3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(Sigma)預(yù)處理的玻片表面上的二乙基焦碳酸酯處理的水層上；3)省略對探針的堿性水解步驟；4)雜交混合物包括60％去離子甲酰胺；5)在含50mM DTT和1X SSC的溶液中65℃高嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌80分鐘；6)用NTB2-乳劑(Kodak)覆蓋切片并在4℃保存。在暴露14天后，將所述玻片在Kodak D-19顯色劑中顯色2.5分鐘并用Unifix固定5分鐘。將切片用蘇木精在水中染色。
在所述利用反義探針的雜交研究中，主要在15周齡胚肺的某些內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Flt4mRNA。在用正義鏈探針和RNA酶A處理的切片進(jìn)行的對照雜交實(shí)驗(yàn)中未產(chǎn)生超出上述背景的信號(hào)。
對于免疫過氧化酶染色，應(yīng)用了1∶100稀釋的抗Flt4抗體，過氧化酶偶聯(lián)的豬抗兔抗體和本領(lǐng)域中應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)方法。用免疫前血清或免疫原封閉的血清進(jìn)行的對照染色沒有信號(hào)。分析了17周齡胚肺組織，結(jié)果與mRNA原位雜交的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致肺的某些大血管內(nèi)皮兔抗Flt4抗血清染色為陽性。
實(shí)施例8在非人類哺乳動(dòng)物中鑒定Flt4基因圖4中給出了在不同物種DNA中檢測Flt4序列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為了揭示Flt4基因在進(jìn)化中的較高保守程度，將2.5kb cDNA片段(見圖1)與從不同動(dòng)物和酵母中純化并用EcoR I消化的染色體DNA進(jìn)行雜交。雜交溶液包括50％甲酰胺、5X Denhardt′s溶液(100X Denhardt′s溶液為Ficoll、聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白各2％)、5X生理鹽水-磷酸鈉-EDTA(3M NaCl，200mM Na2PO4H2O，20mM EDTA，pH7.0)、0.1％SDS(十二烷基磺酸鈉)和0.1mg/ml超聲處理的鮭精DNA。在42℃雜交24小時(shí)。在1X標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽(150mM NaCl，15mM檸檬酸鈉，pH7.0)、0.1％SDS中65℃洗滌雜交膜并于Kodalk XAR-5膠片上曝光。在猴、大鼠、小鼠、狗、牛、兔、和雞DNA中觀察到特異性條帶，但在酵母中沒有信號(hào)。曾經(jīng)從鵪鶉中分離了Flt4cDNA。見Eichmann等，基因，174(1)3-8(1996年9月26日)，其Genebank登記號(hào)為X83827。
實(shí)施例9成人組織中Flt4基因的表達(dá)通過用2微克來自心臟、腦、胎盤、肺、肝臟、骨骼肌、腎和胰腺組織的poly(A)+RNA與Flt4cDNA探針雜交，分析了成人組織中Flt4mRNA的表達(dá)(多組織Northern印跡，Clontech Inc)。與組成型表達(dá)基因的探針進(jìn)行的對照雜交給出各泳道的平均上樣量。
各種人組織的poly(A)+RNA與Flt4cDNA探針的雜交顯示在胎盤、肺、心和腎組織中有5.8和4.5kb移動(dòng)性mRNA帶和6.2kb弱標(biāo)記條帶。在肝臟和骨骼肌組織中見到模糊的mRNA條帶，而在胰腺和腦組織中即便有Flt4RNA也極少。
實(shí)施例10人胚胎組織中Flt4的表達(dá)為了檢測人胚胎組織中F1t4mRNA的表達(dá)，將包括下列16-19周齡人胚胎組織的總RNA與1.9kb Flt4cDNA片段進(jìn)行Northern雜交(見圖1)，并將得到的放射自顯影照片用密度僅進(jìn)行掃描。用從相應(yīng)溴乙啶(EtBr)染色的凝膠UV照片中估計(jì)的RNA量將結(jié)果標(biāo)化。下述符號(hào)代表mRNA水平依次遞增-、+、++ +++。
表1胚胎組織 MRNA腦腦脊膜 +皮質(zhì)板 ++中間帶 +++室管膜帶+小腦++脈絡(luò)叢 +肝 +胰腺 +小腸 -心臟 +肺 +++腎 ++腎上腺 ++皮膚 ++脾臟 +++胸腺 -人胚胎組織的分析表明除了胸腺和小腸，所有組織均有Flt4轉(zhuǎn)錄。肺和脾中表達(dá)水平最高。
實(shí)施例11 Flt4表達(dá)載體通過下述步驟制備全長Flt4cDNA(短形式)a)利用兩個(gè)SphI位點(diǎn)將SphI切割的Flt4cDNA片段[用引物寡核苷酸5′-ACATGCATGCCACCATGCAGCGGGGCGCCGCGCTGTGCCTGCGACTGTGGCTCTGCCTGG GACTCCTGGA-3′(SEQ ID NO.7)(正向引物)和5′-ACATGCATGC CCCGCCGGT CATCC-3′(反向引物)(SEQ ID N0.8)從S2.5kb克隆(見圖1)中擴(kuò)增]連接到已亞克隆到pSP73載體(Promega)的S2.5kb片段的5′末端；b)用寡核苷酸引物5′-CGGAATTCCC CATGACCCCA AC-3′(SEQ ID NO.9)(正向)和5′-CCATCGATGG ATCCTACCTG AAGCCGCTTTCTT-3′(SEQ ID NO.10)(反向)從0.6kb EcoRI片段(圖1)中PCR擴(kuò)增最后138bp的片段，利用EcoRI和BamHI位點(diǎn)將此PCR片段連接到構(gòu)建體a)的3’末端；c)在構(gòu)建體b)的EcoRI位點(diǎn)連接1.2kb EcoRI片段；d)將所得全長HindIII-BamHI片段連接入HindIII-BamHI切割的SV-poly表達(dá)載體[Stacey等，核酸研究，182829(1990)]。
實(shí)施例12 Flt4配體的鑒定將PC-3前列腺腺癌細(xì)胞系(ATCC CRL 1435)在無胎牛血清(FBS)的F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，將由此得到的條件培養(yǎng)物16000×g離心20分鐘，使其變清，并且對其誘導(dǎo)Flt4酪氨酸磷酸化的能力進(jìn)行篩選。
將重組表達(dá)Flt4的NIH3T3細(xì)胞(見實(shí)施例13)再種植于直徑為5cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并且在含10％胎牛血清和抗生素的Dulbecco’改良型最低基本培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)至融合。用磷酸緩沖液(PBS)將融合的細(xì)胞洗滌2次，并且在DMEM/0.2％牛血清白蛋白中饑餓培養(yǎng)過夜。為激活細(xì)胞，用1ml所述條件培養(yǎng)物取代饑餓培養(yǎng)基，并且將所述細(xì)胞37℃溫育5分鐘。
用PC-3條件培養(yǎng)物刺激后，將含有細(xì)胞的培養(yǎng)皿置于冰上，用Tris-HClpH7.4，含100mM NaVO4的150mM NaCl洗滌兩次。除去培養(yǎng)皿中洗滌液，在含抑酶肽、1mM PMSF和1mM NaVO4的RIPA緩沖液[10mM Tris-HCl pH7.5，50mM NaCl，0.5％去氧膽酸鈉，0.5％Nonidet P40，0.1％十二烷基磺酸鈉(SDS)]中裂解細(xì)胞，將細(xì)胞裂解物超聲10秒，進(jìn)行兩次。然后將裂解物16000×g離心30分鐘，將上清轉(zhuǎn)入新試管中，用于免疫沉淀。
抗Flt4 C-末端(見上述)的多克隆抗體被用于免疫沉淀。將細(xì)胞裂解物上清與2-4μl兔多克隆抗Flt4抗血清在冰上保溫2小時(shí)。加入50％(體積/體積)的蛋白A-Sepharose(Pharmacia)之PBS溶液約30μl，4℃旋轉(zhuǎn)保溫45分鐘。免疫沉淀物用RIPA洗滌3次，用PBS洗滌1次。
然后將免疫沉淀沉淀物在7.5％的凝膠中進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并印跡至硝酸纖維素膜上。將這些Western印跡與單克隆抗磷酸酪氨酸(anti-P-Tyr)抗體(1∶2000稀釋的PT-66 Sigma，目錄號(hào)P-3300)進(jìn)行溫育，隨后利用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(Amersham)，用過氧化物酶結(jié)合的兔抗小鼠抗體進(jìn)行檢測。有時(shí)，將印跡膜在含100mM 2-巰基乙醇、2％SDS、62.5mM Tris-HCl pH6.7的溶液于50℃放置30分鐘并偶而攪動(dòng)，以徹底去掉印跡膜此前所帶的信號(hào)，用抗Flt4抗體(1∶1000稀釋)再染色，隨后用過氧化物酶結(jié)合的豬抗兔抗體(1∶1000稀釋，Dako，P217)進(jìn)行染色。將表達(dá)Flt4的NIH3T3細(xì)胞用100mM酪氨酰磷酸酶抑制劑過釩酸鈉(PerVO4)處理20分鐘，然后獲取該細(xì)胞的抗-Flt4免疫沉淀物，作為Flt4酪氨酸磷酸化的陽性對照。用過釩酸鈉對細(xì)胞的處理通過下述方法進(jìn)行，即向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入100mM(終濃度)正釩酸鈉和2mM(終濃度)過氧化氫，并將所述細(xì)胞在37℃5％CO2溫育20分鐘。此步驟導(dǎo)致產(chǎn)生釩酸鹽的過氧化形式(氧釩基氫過氧化物)，其在活細(xì)胞中是蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶的強(qiáng)效抑制劑。
PC-3條件培養(yǎng)物刺激120KD多肽的酪氨酸磷酸化，該多肽與Flt4的酪氨酸磷酸化、加工成熟的形式共遷移。用抗Flt4抗體再次染色該印跡可證實(shí)共遷移。
為了證實(shí)120KD多肽不是所述條件培養(yǎng)液的非特異性組分，將15ml條件培養(yǎng)基通過SDS-PAGE分離，印跡在硝酸纖維素膜上，并用抗P-Tyr抗體將所述印跡染色。檢測了幾個(gè)多肽，無一與Flt4共遷移，表明所述120KD帶的確是從激活細(xì)胞中免疫沉淀的酪氨酸磷酸化蛋白。對在室溫下用肝素-Sepharose CL-6B(Pharmacia)預(yù)處理2小時(shí)的PC-3條件培養(yǎng)基(第3泳道)的刺激進(jìn)行的分析表明Flt4配體不與肝素結(jié)合。
非條件培養(yǎng)基不誘導(dǎo)Flt4自我磷酸化。另外，非轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞或FGFR-4轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞用PC-3細(xì)胞條件培養(yǎng)基刺激均不表現(xiàn)120KD多肽的酪氨酸磷酸化。當(dāng)將PC-3條件培養(yǎng)用Centricon-10濃縮器(Amicon)濃縮4倍時(shí)，刺激活性顯著增加。還有，通過濃縮獲得的包含分子量小于10000(＜10000)的蛋白的流出液不激活Flt4的磷酸化。用與CNBr-活化的Sepharose(1mg/ml)偶聯(lián)的Flt4胞外結(jié)構(gòu)域(Flt4EC-6xHis，見下)50ml按說明書預(yù)處理濃縮的PC-3細(xì)胞條件培養(yǎng)基，可完全消除Flt4的酪氨酸磷酸化。用SepharoseCL-4B對條件培養(yǎng)基進(jìn)行類似預(yù)處理不影響其刺激活性。
這些資料證實(shí)PC-3細(xì)胞產(chǎn)生可溶性Flt4配體。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)所述配體與重組Flt4EC結(jié)構(gòu)域結(jié)合。因此，該配體可以在親和層析中利用重組Flt4EC結(jié)構(gòu)域進(jìn)行純化?？梢詫⒃摷兓鞍自赟DS-PAGE中進(jìn)行電泳，印跡到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并且可以用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法測定其氨基末端序列?；蛘撸瑢⑺黾兓呐潴w消化成肽，用于氨基末端序列測定。從純化蛋白中獲得的肽序列被用于合成編碼這些序列的寡核苷酸混合物。可以將這些寡核苷酸及其互補(bǔ)DNA鏈進(jìn)行放射性標(biāo)記，并且將其用于篩選由PC-3細(xì)胞制備的cDNA文庫，以獲得編碼所述配體的cDNA，所用的所有方法均為本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法(Wen等，細(xì)胞69559-572(1992))?；蛘撸@些寡核苷酸及其互補(bǔ)鏈作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的引物，以由PC-3細(xì)胞RNA制備的cDNA為模板擴(kuò)增編碼配體的序列。這些用于cDNA合成和PCR(RT-PCR)的方法為本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法(Innis等，1990，PCR方案，Academic Press；McPherson M.J.等，1991，PCR，實(shí)用方法，IRL出版社；Partanen等，美國國家科學(xué)院院刊，878913-8917(1990))。還有另一個(gè)選擇是通過利用克隆到真核細(xì)胞表達(dá)載體的cDNA(例如應(yīng)用Invitrogen Librarian克隆試劑盒及其提供的載體，如pcDNAI和pcDNAIII)，從PC-3細(xì)胞中克隆所述Flt4配體，用FIt4堿性磷酸酶(Cheng和Flanagan，細(xì)胞，79157-168(1994))、Flt4免疫球蛋白(Flt4-Ig)(Lyman等，細(xì)胞，751157-1167(1993))或類似親和試劑，篩選這些轉(zhuǎn)染入例如COS細(xì)胞的文庫，所用的方法為本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法。
實(shí)施例13 細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染在含10％FCS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞和293-EBNA細(xì)胞(Invitrogen)。為了穩(wěn)定的表達(dá)，利用DOTAP轉(zhuǎn)染試劑(Boehringer-Mannheim)通過脂轉(zhuǎn)染方法，用LTR-Flt41載體與pSV-neo載體一同轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，此時(shí)Flt4cDNA的表達(dá)受Moloney鼠白血病病毒LTR啟動(dòng)子的調(diào)控。用DEAE葡聚糖法轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞(McClutchan和Pagano，J.Natl.Cancer Inst，41351-35(1968))。在500mg/ml新霉素中篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
實(shí)施例14 Flt4融合蛋白的構(gòu)建和表達(dá)pVTBac-FLT4EC-6xHis融合構(gòu)建體對編碼Flt4的cDNA的末端作如下修飾擴(kuò)增編碼胞外結(jié)構(gòu)域(EC)的Flt4cDNA序列的3’末端，所用的寡核苷酸為5，-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3’(SEQ ID NO13，下劃線為SalI位點(diǎn)，所含序列對應(yīng)于SEQ ID NO1中核苷酸2184-2204)和5’-CGCGGATCCCTAGTGATGGTGATGGTGATGTCTACCTTCGATCATGCTGCCCTTATCCTC-3’(SEQ ID NO14，下劃線為BamHI位點(diǎn)，包括與SEQ ID NO1中核苷酸2341-2324互補(bǔ)的序列)編碼與Ni-NTA柱(Qiagen，Hilden，德國)結(jié)合的6個(gè)組胺酸殘基，其后為終止密碼子。用SalI和BamHI消化該擴(kuò)增片段，將其作為SalI-BamHI片段連接入LTR-Flt4l載體(見實(shí)施例4)，取代唯一的SalI-BamHI片段，該片段包含編碼Flt4跨膜結(jié)構(gòu)域和胞漿結(jié)構(gòu)域的序列。
通過PCR擴(kuò)增Flt4 cDNA的5’末端，其不含F(xiàn)lt4信號(hào)序列編碼區(qū)，所用的寡核苷酸為5’-CCCAAGCTTGGATCCAAGTGGCTACTCCATGACC-3’(SEQ ID NO11，下劃線為HindIII和BamHI位點(diǎn)，包括相應(yīng)于SEQID NO1的核苷酸86-103的序列)和5’-GTTGCCTGTGATGTGCACCA-3’(SEQ ID NO12，包括與SEQ ID NO1的核苷酸700-681互補(bǔ)的序列)。該擴(kuò)增片段(其包括SEQ ID NO1的核苷酸86-700)用HindIII和SphI(SphI位點(diǎn)相應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸588-593，在Flt4cDNA的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi))消化。
用所得HindIII-SphI片段取代上面剛剛敘述的修飾型LTR-FLT4l載體中的HindIII-SphI片段(HindIII位點(diǎn)位于Flt4插入片段與載體pLTRpoly部分的5’端連接處內(nèi)，SphI位點(diǎn)位于Flt4 cDNA之內(nèi)，相應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸588-593)。然后將得到的Flt4EC-6xHis插入片段作為BamHI片段連接至pVTBac質(zhì)粒的BamHI位點(diǎn)(Tessier等，基因98177-183(1991))。用脂轉(zhuǎn)染法使該構(gòu)建體與桿狀病毒基因組DNA共同轉(zhuǎn)染SF-9細(xì)胞。產(chǎn)生重組病毒并將其用于感染High-Five細(xì)胞(Invitrogen)Flt4-AP融合構(gòu)建體擴(kuò)增Flt4EC結(jié)構(gòu)域編碼序列的3’末端，所用寡核苷酸為5’-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3’(SEQ ID NO15)和5’-CGGGATCCCTCCATGCTGCCCTTATCCT-3’(SEQ ID NO16)，將其作為SalI-BamHI片段連接至LTR-TLF4l載體，取代編碼跨膜結(jié)構(gòu)域和胞漿結(jié)構(gòu)域的序列。然后將所得插入片段作為HindIII-BamHI片段連接至APtag-1質(zhì)粒的HindIII-BglII位點(diǎn)，使其與堿性磷酸酶編碼區(qū)在同一閱讀框架內(nèi)(Flanagan和Leder，1990，細(xì)胞63185-194)。利用DOTAP轉(zhuǎn)染試劑(Boehringer)，通過脂轉(zhuǎn)染法用此Flt4-AP構(gòu)建體和pSV2neo共轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞(Southern和Berg，J.Mo1.Appl.Genet 1327-341(1982))，在有500mg/ml新霉素的條件下篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞。產(chǎn)生在培養(yǎng)液中的重組蛋白用針對堿性磷酸酶活性的比色反應(yīng)進(jìn)行檢測(Cheng & Flanagan，細(xì)胞79157-168(1994))。
Flt4-Ig構(gòu)建體編碼Flt4-免疫球蛋白嵌合體的重組DNA按如下方法構(gòu)建。通過PCR擴(kuò)增編碼Flt4(包括編碼信號(hào)序列的Flt4核苷酸)的cDNA的5’末端，所用引物為5’-GGCAAGCTTGAATTCGCCACCATGCAGCGGGGCGCC-3’(SEQ ID NO17)和5’-GTTGCCTGTGATGTGCACCA-3’(SEQ IDNO18)，將其作為HindIII-SphI片段連接至LTR-FLT4l載體。擴(kuò)增Flt4EC編碼區(qū)的3’末端，所用寡核苷酸為5’-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3’(SEQ ID NO19)和5’-CGCGGATCCAAGCTTACTTACCTTCCATGCTGCCCTTATCCTCG-3’(SEQ ID NO20)，將其作為SalI-BamHI片段連接至LTR-FLT41載體，取代編碼跨膜結(jié)構(gòu)域和胞漿結(jié)構(gòu)域的序列。將此包含剪接共體位點(diǎn)的Flt4EC插入片段首先連接至pHγCE2，其包含編碼人免疫球蛋白重鏈鉸鏈區(qū)的外顯子以及恒定區(qū)外顯子(Karjalainen K.，TIBTECH，9109-113(1991))。含F(xiàn)lt4-Ig嵌合體的EcoRI-BamHI插入片段再用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法(Klenow)鈍化，并且與pREP7內(nèi)鈍化的HindIII位點(diǎn)連接。利用磷酸鈣沉淀法將此構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至293-EBNA細(xì)胞，用所述條件培養(yǎng)基經(jīng)蛋白A-Sepharose親和層析來分離Flt4-Ig蛋白。
實(shí)施例15-17 Flt4配體的純化及測序用Centriprep過濾盒將由PC-3細(xì)胞在無血清培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)液上清濃縮30-50倍，上樣于固相Flt4胞外結(jié)構(gòu)域的柱上。利用兩種可選擇的構(gòu)建體和方法制備兩種親和基質(zhì)。在第一種情況中，將Flt4EC-6xHis融合蛋白與CNBr-激活的Sepharose 4B(Pharmacia)交聯(lián)，而在第二種情況中，利用二甲基庚二酸酯(dimethylpimelidate)將Flt4-Ig融合蛋白與蛋白ASepharose結(jié)合(Schneider等，1982，生物化學(xué)雜志，25710766-10769)。從親和柱中洗脫的物質(zhì)被進(jìn)一步純化，所用方法有離子交換層析、反向高效層析、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。檢測層析級分刺激Flt4的酪氨酸磷酸化的能力。對純化的具有生物活性的配體蛋白進(jìn)行顯微測序，并且根據(jù)獲得的氨基酸序列制備簡并的寡核苷酸，用于分離和克隆編碼配體的cDNA；例如，從由PC-3細(xì)胞中分離的poly(A)+RNA制備的cDNA文庫中分離和克隆。
命名為血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)的Flt4配體，以及天然人、非人類哺乳動(dòng)物、和禽類的編碼VEGF-C、VEGF-C變體和其類似物的多核苷酸序列的詳細(xì)特點(diǎn)公開于PCT/US98/01973，1998年2月2日提交(1998年8月6日公開，國際公開號(hào)為WO98/33917)；Joukov等，生物化學(xué)雜志，273(12)6599-6602(1998)；Joukov等，EMBO J，16(13)3898-3911(1997)；和PCT/F196/00427，1996年8月1日提交(國際專利公開號(hào)為WO97/05250)，所有均全文引入本文作為參考。如上述文獻(xiàn)所詳述，在人的細(xì)胞中最初產(chǎn)生的人VEGF-C是419個(gè)氨基酸的前原-VEGF-C多肽。人前原-VEGF-C多肽的氨基酸序列見SEQ ID NO21所示，并且根據(jù)Budapest條約的條款，已將編碼人VEGF-C的cDNA保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd，Manassas，VA 20110-2209(美國)(保存日期為1995年7月24日，ATCC登記號(hào)為97231)。其它物種的VEGF-C序列也已經(jīng)被報(bào)道。例如見Genebank登記號(hào)MMU73620(鼠骨骼肌)和CCY15837(鵪鶉Coturnix coturnix)，在此引入本文作為參考。
前原-VEGF-C多肽經(jīng)多步驟加工產(chǎn)生約21-23KD(在還原條件下通過SDS-PAGE估測)的成熟且活性最強(qiáng)的VEGF-C多肽。此加工過程包括剪切信號(hào)肽(SEQ ID NO21，殘基1-31)；剪切羧基末端肽(對應(yīng)于大約SEQ IDNO21的氨基酸228-419，并具有類似于Balbiani環(huán)3蛋白(BR3P)序列[Dignam等，基因，88133-40(1990)；Paulsson等，生物化學(xué)雜志，211331-49(1990)]的間隔的半胱氨酸殘基模式)以產(chǎn)生29KD的部分加工形式；(主要在細(xì)胞外)剪切氨基端肽(對應(yīng)于大約SEQ ID NO21的氨基酸32-103)以產(chǎn)生約21-23KD的完全加工的成熟形式。實(shí)驗(yàn)證據(jù)證實(shí)VEGF-C的部分加工形式(例如29KD形式)可以與Flt4(VEGFR-3)受體結(jié)合，然而只有VEGF-C的完全加工形式與VEGFR-2發(fā)生高親和性結(jié)合。這表明VEGF-C多肽天然地連接成非二硫鍵連接的二聚體。
而且，已經(jīng)證實(shí)SEQ ID NO2的氨基酸103-227對維持VEGF-C的功能并非都是關(guān)鍵的。由SEQ ID NO2的氨基酸113-213(缺少殘基103-112和214-227)組成的多肽仍然保留結(jié)合并激活VEGF-C受體的能力，并且預(yù)計(jì)跨越約131位殘基到約211位殘基的多肽仍將保留VEGF-C的生物活性。已經(jīng)表明156位上的半胱氨酸對于VEGFR-2的結(jié)合活性非常重要。然而，VEGF-C△C156多肽(即由于缺失或替代而缺少此半胱氨酸的類似物)仍然是VEGFR-3的有效激活劑。SEQ ID NO2的165位半胱氨酸對于與任何一個(gè)受體結(jié)合是必需的，然而缺少83或137位半胱氨酸的類似物與天然VEGF-C競爭結(jié)合這兩個(gè)受體并激活這兩個(gè)受體。
人VEGF-C與其它物種VEGF-C的序列比對(應(yīng)用任何通常被接受的算法進(jìn)行)表明存在額外的殘基，其中引入了并沒有破壞VEGF-C生物活性的變化(例如插入、替代和/或缺失)。在兩個(gè)或更多物種的VEGF-C多肽的對比中存在不同氨基酸的任何位點(diǎn)，尤其是具有不同化學(xué)特性的側(cè)鏈的不同氨基酸的位點(diǎn)，很可能是易于改變并且不拌有功能消失的位點(diǎn)。在PCT/US98/01973的圖5中給出了人、鼠和鵪鶉VEGF-C的比對實(shí)例。
除上述的考慮之外，應(yīng)該理解可以對野生型VEGF-C序列進(jìn)行無數(shù)的保守氨基酸替代，尤其是如果此替代數(shù)目不大時(shí)，其很可能會(huì)獲得仍具有VEGF-C生物活性的多肽。“保守氨基酸替代”是指用具有相似化學(xué)特性之側(cè)鏈的氨基酸進(jìn)行的氨基酸替代。用于保守氨基酸替代的相似氨基酸包括具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(谷氨酸，天冬氨酸)；具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(精氨酸、賴氨酸、組胺酸)；具有極性酰胺側(cè)鏈的氨基酸(谷胺酰胺、天冬酰胺)；具有疏水性脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、甘氨酸)；或具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)；具有小側(cè)鏈的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸)；或具有脂肪族羥基側(cè)鏈的氨基酸(絲氨酸、蘇氨酸)。還考慮了增加或去掉一個(gè)或幾個(gè)內(nèi)部氨基酸而不破壞VEGF-C生物活性。
從上述中應(yīng)該理解許多VEGF-C多肽及其變體將與Flt4(VEGFR-3)以高親和力結(jié)合，并且因此在本發(fā)明一些方面中被用作Flt4結(jié)合化合物，這些本發(fā)明的方面涉及利用Flt4結(jié)合化合物顯像或篩查組織樣品。特殊的目的是包含變化的VEGF-C形式，其降低或消除VEGFR-2結(jié)合親和力，而得到的多肽對VEGFR-3的結(jié)合特異性增加。如上所述，這樣的變化包括去除或取代基本上消除VEGFR-3結(jié)合親和力的Cys156，或改變破壞天然前原-VEGF-C-蛋白裂解位點(diǎn)的氨基酸序列(因?yàn)閂EGFR2對完全加工型VEGF-C的親和力最高)。另外，經(jīng)過修飾仍具有Flt4結(jié)合親和力但不能激活Flt4自我磷酸化的VEGF-C分子在本文敘述的治療方法中是有用的Flt4拮抗劑。從上述介紹中應(yīng)該進(jìn)一步清楚本文中所述Flt4配體可以用于檢測，以其作為附加的指征來證實(shí)人Flt4等位基因變體的同一性，并且證實(shí)在本文中介紹的與Flt4序列同源的非人基因序列實(shí)際上是Flt4的非人類對應(yīng)物。推導(dǎo)的前原VEGF-C氨基酸序列見SEQ ID NO21所示。
命名為血管內(nèi)皮生長因子D(VEGF-D)的第二個(gè)Flt4配體以及編碼VEGF-D、VEGF-D變體及其類似物的人類多核苷酸序列詳述于PCT/US97/14696，1997年8月21日提交并于1998年2月26日公開為WO98/7832；Achen等，美國國家科學(xué)院院刊95(2)548-553(1998)，在此引入本文作為參考。如上述文獻(xiàn)所詳述，在人的細(xì)胞中最初產(chǎn)生的人VEGF-D是354個(gè)氨基酸的前原-VEGF-D多肽。前原VEGF-D的cDNA和推導(dǎo)的氨基酸序列見SEQ ID NO22所示。其它物種的VEGF-D序列也已經(jīng)報(bào)道。例如見Genebank登記號(hào)D89628(鼠骨骼肌)；和AF014827(褐家鼠)，在此引入本文作為參考。
所述前原VEGF-D多肽具有21個(gè)氨基酸的假定信號(hào)肽，似乎其蛋白裂解式加工方式類似于前原VEGF-C的?！爸亟M的成熟”VEGF-D缺乏SEQ IDNO22D 1-92殘基和202-354殘基，它保留活化VEGFR-2和VEGFR-3受體的能力，且很可能形成非共價(jià)連接的二聚體。VEGF-D多肽作為本發(fā)明Flt4結(jié)合化合物的應(yīng)用類似于VEGF-C的那些。同樣，預(yù)計(jì)對VEGF-D的類似修改(以除去VEGF同源性結(jié)構(gòu)域中8個(gè)保守的半胱氨酸中的第二個(gè)Cys136，或除去蛋白裂解位點(diǎn))將產(chǎn)生如下多肽，其VEGFR-2結(jié)合親和力已降低或消除，并因此使Flt4特異性增強(qiáng)。已經(jīng)過修改而保留了Flt4結(jié)合親和力但不能激活Flt4自我磷酸化的VEGF-D分子是本文所述方法的有效Flt4拮抗劑。
實(shí)施例18小鼠Flt4 cDNA探針的克隆用上述覆蓋胞外結(jié)構(gòu)域的S2.5人Flt4受體cDNA片段篩選129SV小鼠λFIXII基因組文庫(Stratagene)的大約106個(gè)噬菌斑。另見Pajusola等，癌癥研究，525738(1992)。從陽性噬菌斑中亞克隆2.5kb BamHI片段并測定其兩端的序列。從這個(gè)亞克隆中應(yīng)用PCR擴(kuò)增包括小鼠Flt4cDNA序列之核苷酸1745-2049的外顯子片段，并將其克隆到pBluescript KSII+/-載體(Stratagene)。見Finnerty等，癌基因，82293(1993)。
用相似的方法克隆包括核苷酸1-192的第二個(gè)片段。
實(shí)施例19小鼠組織中Flt4mRNA的分析根據(jù)Chomczynski等，Anal Biochem 162156(1987)的方法，從發(fā)育中的胚胎(交配后8-18天和1日齡的小鼠)分離總RNA。交配后8天的胚胎的樣品還包括胎盤。
對于RNA酶保護(hù)分析，利用[32P]-UTP和T7聚合酶針對從實(shí)施例18獲得的線性化鼠Flt4質(zhì)粒制備反義RNA探針。應(yīng)用β-肌動(dòng)蛋白探針，其對應(yīng)于公開的小鼠β-肌動(dòng)蛋白序列的核苷酸1187-1279。見Tokunaga等，核酸研究，141829(1986)。在6％聚丙烯酰胺/7M尿素凝膠上純化之后，將標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄本與30μg總RNA在52℃雜交過夜。將未雜交的RNA用RNA酶A(10U/ml)和T1(1mg/ml)在37℃ pH7.5條件下消化1小時(shí)。通過蛋白酶K37℃消化15分鐘滅活RNA酶，并且將樣品在6％聚丙烯酰胺/7M尿素凝膠上進(jìn)行分析。
在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中分析的Flt4表達(dá)模式表明從肺、肝臟、心臟、腎臟、骨骼肌和脾臟獲得的mRNA信號(hào)很弱，而在睪丸和腦組織中顯然無特異性信號(hào)。通過RNA酶保護(hù)試驗(yàn)對在小鼠不同發(fā)育階段收集的一系列RNA進(jìn)行的分析表明在從交配后8天到新生小鼠的整個(gè)胚胎發(fā)育期間，F(xiàn)lt4mRNA均表達(dá)，并且信號(hào)強(qiáng)度無大的變化。
實(shí)施例20 小鼠胚胎中Flt4的原位雜交為了更好的確定細(xì)胞和組織中的Flt4轉(zhuǎn)錄本，將交配后7.5天和8.5天的小鼠胚胎的切片與標(biāo)記的Flt4RNA進(jìn)行雜交。小鼠胚胎來源于CBA和NMRJ小鼠的交配。通過頸脫臼處死懷孕小鼠，并將胚胎立即冰凍保存或通過磷酸鹽緩沖液轉(zhuǎn)入4％多聚甲醛中。將所述胚胎和分離的小鼠器官4℃固定18小時(shí)，脫水，石蠟包埋并切割成6μm的切片。
用[35S]-UTP從線性化的質(zhì)粒中制備192個(gè)和305個(gè)核苷酸(見實(shí)施例18)的RNA探針(反義和正義)。根據(jù)下述方法進(jìn)行切片原位雜交，所述方法為Wilkinson等，發(fā)育，99493(1987)；Wilkinson等，細(xì)胞，5079(1987)(在此引入本文作為參考)中介紹的方法，并進(jìn)行了如下了修改1)在石蠟包埋前應(yīng)用二甲苯而不是甲苯；2)將切為6μm的切片放置在用2％3-三乙氧基甲硅烷基丙胺預(yù)處理的玻片表面用二乙基焦碳酸酯處理的水層上；3)省略探針的堿性水解步驟；4)在含30mM DTT和1X SSC的溶液中65℃高嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌80分鐘。用NTB-2乳劑(Kodak)覆蓋切片并在4℃保存。將所述切片暴露14天、顯影并用蘇木精染色。與正義鏈雜交的對照和RNA酶A處理的切片中沒有產(chǎn)生超出背景的特異性信號(hào)。
在交配后7.5天的小鼠胚胎中沒有檢測到Flt4mRNA表達(dá)，但在發(fā)育的第8.5天于發(fā)育的主動(dòng)脈中檢測到亮信號(hào)。相反，發(fā)育中的卵黃囊為Flt4陰性。在胚胎外組織中，F(xiàn)lt4在尿囊中顯著表達(dá)，而卵黃囊的發(fā)育中的血細(xì)胞島為陰性。在另一方面，腦間充質(zhì)的成血管細(xì)胞為Flt4強(qiáng)陽性。在發(fā)育中的胎盤中，F(xiàn)lt4信號(hào)首先見于竇狀隙靜脈中。在交配后9.5天的胎盤中，靜脈腔隙的內(nèi)皮和與Reichert＇s膜部分融合的巨細(xì)胞表達(dá)Flt4mRNA。
因此，雖然在最早期的內(nèi)皮細(xì)胞前體，成血管細(xì)胞中，F(xiàn)1t4表達(dá)非常顯著，但其僅限定于交配后8.5天胚胎的某些血管中。已知Tie受體在小鼠胚胎發(fā)育期間的所有內(nèi)皮中均表達(dá)，因此為這些細(xì)胞提供了標(biāo)記物。見Korhonen等，癌基因，8395(1993)；和Korhonen等，血液，802548-2555(1992)。值得注意的是，與Tie探針相比，F(xiàn)lt4探針如果與交配后11.5天胚胎的動(dòng)脈內(nèi)皮雜交，例如與發(fā)育中的背主動(dòng)脈或頸總動(dòng)脈的內(nèi)皮雜交，其雜交信號(hào)很弱。相反，在發(fā)育中的靜脈中，F(xiàn)lt4信號(hào)則強(qiáng)得多。例如，在發(fā)育的后腎周圍的靜脈中可檢測到Fit4信號(hào)，而Tie探針主要識(shí)別后腎內(nèi)的毛細(xì)血管。
發(fā)現(xiàn)Flt4mRNA分布于交配后12.5天小鼠胚胎的幾個(gè)區(qū)域，在腋區(qū)的擴(kuò)張血管中尤其突出。在頸靜脈區(qū)域的中矢狀切片中發(fā)現(xiàn)了相似的Flt4陽性血管結(jié)構(gòu)(資料未給出)。表達(dá)Flt4的血管的叢樣模式出現(xiàn)于眶周區(qū)和發(fā)育中的脊椎周圍。另外在緊靠發(fā)育中的皮膚的下層，存在Flt4陽性血管網(wǎng)。從幾個(gè)部位中，包括發(fā)育中的腦，可獲得較弱的毛細(xì)血管信號(hào)。還可以在頸部、發(fā)育中的口鼻部和發(fā)育中的舌底以及尾部中檢測到Flt4mRNA。另外，肝臟的Flt4mRNA表達(dá)為強(qiáng)陽性，其為斑點(diǎn)樣模式。
在進(jìn)一步發(fā)育期間，F(xiàn)lt4mRNA表現(xiàn)出更進(jìn)一步限定于胚胎的某些血管中。交配后14.5天的胚胎很好的表現(xiàn)了這種限定表達(dá)的模式。在此類胚胎的中矢狀切片中，在其前面部分沿著發(fā)育中脊椎管觀察到最顯著的Flt4信號(hào)。此信號(hào)被認(rèn)為來源于胸導(dǎo)管的內(nèi)皮細(xì)胞，在這個(gè)發(fā)育時(shí)間點(diǎn)上胸導(dǎo)管是最大的淋巴管。相反，背主動(dòng)脈和次級腔靜脈為陰性。擴(kuò)張的腸系膜區(qū)血管也為Flt4強(qiáng)陽性。而且，在交配后12.5天的胚胎中，眶周、下領(lǐng)中沿著其解剖邊界的血管網(wǎng)以及頸部的血管網(wǎng)包含F(xiàn)lt4陽性內(nèi)皮。在心包間隙和整個(gè)皮下組織中出現(xiàn)相似的結(jié)構(gòu)。值得注意的是與Flt4陰性血管相反，所有的Flt4陽性血管在其腔隙中無血細(xì)胞。這些表達(dá)模式表明在發(fā)育的這個(gè)時(shí)間點(diǎn)上Flt4變成限定于所述淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。我們觀察到Flt4表達(dá)的另一位點(diǎn)是發(fā)育中骨髓的竇狀隙。
還分析了與Flt4探針雜交的交配后16.5天胚胎之胸廓上部的橫切切片。進(jìn)行蘇木精-伊紅染色檢測此區(qū)域中血管的不同類型。這些包括頸總動(dòng)脈和頭臂動(dòng)脈、腔靜脈和大小較小且缺少肌肉組織和結(jié)締組織包繞的胸導(dǎo)管。在較高放大倍數(shù)下，觀察胸導(dǎo)管及其附近小血管的內(nèi)皮細(xì)胞與Flt4探針的雜交。
實(shí)施例21培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中Flt4mRNA的分析實(shí)施例20中所述原位雜交的結(jié)果表明Flt4在靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，稍后在淋巴管和一些靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，但是不在動(dòng)脈內(nèi)皮中表達(dá)。為了確定在體外此調(diào)節(jié)是否維持，利用Northern印跡和雜交分析我們研究了培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞。
分離并培養(yǎng)人的主動(dòng)脈、股靜脈、臍靜脈和包皮微血管的內(nèi)皮細(xì)胞，并且按在本領(lǐng)域中先前所述方法定性。見Van Hinsberg等，動(dòng)脈硬化，7389(1987)；和Van Hinsberg等，Thromb.Haemostas，57148(1987)。取傳代5到8代后(分裂比率1∶3)的融合內(nèi)皮細(xì)胞用于分離聚腺苷酸化RNA。
內(nèi)皮細(xì)胞系EA hy926(Edgell等，美國國家科學(xué)院院刊，803734-3737(1983))、BCE(Folkman等，美國國家科學(xué)院院刊，765217-5221(1979))和LEII(Schreiber等，美國國家科學(xué)院院刊，826138(1985))不表達(dá)Flt4。然而，培養(yǎng)的人微血管、靜脈和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對Flt4特異的5.8和4.5kbmRNA為陽性，而動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞為陰性。相反，另一種內(nèi)皮受體酪氨酸激酶基因Tie則在所有研究的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)為4.4kb mRNA。
實(shí)施例22成人組織中Flt4mRNA實(shí)施例20中得到的結(jié)果表明在發(fā)育期間，F(xiàn)lt4mRNA變?yōu)樵诤艽蟪潭壬舷薅ㄓ诹馨凸軆?nèi)皮。由于此發(fā)現(xiàn)在人體中的潛在的重要性，我們利用人Flt4探針在成人組織中研究了Flt4表達(dá)。應(yīng)用的人Flt4探針是包括所述cDNA(SEQ ID NO1)之堿基對1-595的EcoRI-SphI片段。另見Pajusola等，癌癥研究，525738(1992)。所述von Willebrand因子探針是包括堿基對1-2334的EcoRI-HindIII片段。Bonthron等，核酸研究，1417125(1986)。
我們應(yīng)用了用于組織學(xué)診斷的常規(guī)固定材料。正常肺組織是從切除的患有表皮樣腫瘤的左側(cè)次級肺葉中取得。從患有結(jié)腸腺癌的患者取得腸系膜和腸系膜的淋巴結(jié)。因大小異常，摘除靠近唾液腺的正常淋巴結(jié)。從兩個(gè)患者得到的扁桃體和兩個(gè)闌尾沒有診斷學(xué)上的變化。研究了兩例淋巴管瘤和三例膀胱淋巴管瘤，結(jié)果類似。
對于用10％福爾馬林固定的作為組織學(xué)診斷常規(guī)標(biāo)本的人組織，正常的原位雜交方法僅僅給出背景，然而用微波而不是蛋白酶K處理使其能夠特異性雜交。見Shi等，生物化學(xué)雜志，2665774(1991)；Catoretti等，病理學(xué)雜志，168357(1992)。
在腸系膜、肺和闌尾中淋巴管內(nèi)皮有Flt4信號(hào)，而靜脈、動(dòng)脈和毛細(xì)血管為陰性。為了研究Flt4是否在HEVs中表達(dá)，研究了扁桃體。在扁桃體的一些HEVs中的確檢測到Flt4特異性放射自顯影顆粒。
實(shí)施例23正常及轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)和淋巴管瘤中Flt4mRNA的分析分析了人正常腸系膜淋巴結(jié)(見實(shí)施例22)一個(gè)部分的Flt4表達(dá)。在淋巴竇和傳出及傳入淋巴管中觀察到Flt4表達(dá)。在包括腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中可觀察到相同的模式。在正常和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中一些HEVs也均為陽性。在膀胱淋巴管瘤中Flt4特異表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮，與血管中針對von Willebrandt因子的原位雜交信號(hào)的比較一樣明顯。
與這些結(jié)果相一致，F(xiàn)lt4的免疫染色在皮膚淋巴管瘤病的內(nèi)皮中為強(qiáng)陽性，皮膚淋巴管瘤病是以推測的淋巴管內(nèi)皮增生為特點(diǎn)的稀有疾病。見Lymboussaki等，美國病理學(xué)雜志，153(2)395-403(1998年8月)，在此全文引入本文作為參考。
另外，F(xiàn)1t4免疫染色鑒定了在Kaposi′s肉瘤皮膚結(jié)節(jié)損傷組織樣品之內(nèi)的紡錘細(xì)胞。見Jussila等，癌癥研究，581599-1604(1998年4月)?？紤]到Flt4的明顯的淋巴管特異性，可以認(rèn)為這些結(jié)果與Kaposi′s肉瘤中某些細(xì)胞是起源于淋巴內(nèi)皮的建議相一致。例如見Beckstead等，美國病理學(xué)雜志，119294-300(1985)；和Dictor等，美國病理學(xué)雜志，130411-417(1988)。
實(shí)施例24胎兒內(nèi)皮細(xì)胞中Flt4的定位如實(shí)施例2所述，編碼短形式的40個(gè)羧基末端氨基酸的Flt4cDNA片段，以657bp EcoRI片段被克隆入pGEX-1λT細(xì)菌表達(dá)載體(Pharmaci)，其與谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶編碼區(qū)在同一個(gè)閱讀框架中。在大腸桿菌中制備由上述所得的GST-Flt4融合蛋白并通過利用谷光甘肽-Sepharose 4B柱的親和層析將其純化。將純化的蛋白凍干、溶于PBS、與弗氏佐劑混合并將其用于免疫家兔。在第三次加強(qiáng)免疫之后，取抗血清備用。
從用前列腺素誘導(dǎo)的合法流產(chǎn)中取得17-20周齡人胎兒組織。本研究由Helsinki大學(xué)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。用胎兒腳長估計(jì)孕齡。將胎兒組織包埋于Tissue-Tek(Miles)、立即冰凍并在-70℃保存。
將抗Flt4抗血清與GST-Sepharose柱交叉吸收，去除抗GST抗體，然后通過GST-Flt4親和層析將其純化。用丙酮將幾個(gè)6微米厚的冰凍組織切片固定，并用0.3％H2O2的甲醇液處理30分鐘，阻斷內(nèi)原性過氧化酶活性。洗滌之后，將所述切片用5％正常豬血清溫育。然后將切片與抗Flt4抗體溫育并洗滌。用過氧化酶偶聯(lián)的豬抗兔IgG檢測結(jié)合的抗體，隨后以0.2％3，3-二氨基聯(lián)苯胺(Amersham)為底物進(jìn)行過氧化酶活性染色。將所述切片在Meyer′s蘇木精中進(jìn)行對比染色。
人胎兒腸系膜的抗Flt4免疫過氧化酶染色表明在幾個(gè)脈管的內(nèi)皮細(xì)胞中存在Flt4蛋白，而用抗原阻斷的抗Flt4抗體和免疫前血清進(jìn)行的對照染色為陰性。為了比較，用血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的VIII因子相關(guān)抗原的抗血清將切片染色。在不含有紅細(xì)胞的脈管內(nèi)皮細(xì)胞上觀察到Flt4免疫過氧化酶染色，而在血管中為陰性。無紅細(xì)胞的脈管很可能是淋巴內(nèi)皮，此類脈管在腸系膜中尤其常見?？筕III因子相關(guān)抗原的抗體在所有脈管中均將內(nèi)皮細(xì)胞染色。
實(shí)施例25抗Flt4單克隆抗體的制備融合蛋白I通過在High-Five細(xì)胞中表達(dá)Flt4EC-6xHis-pVTBac質(zhì)粒構(gòu)建體(實(shí)施例14)，制備重組FIt4胞外結(jié)構(gòu)域蛋白。根據(jù)廠商(Qiagen)的說明書，通過利用Ni-NTA親和層析結(jié)合并洗脫在重組Flt4胞外結(jié)構(gòu)域的COOH末端中編碼的6xHis標(biāo)簽，從轉(zhuǎn)染的High-Five細(xì)胞培養(yǎng)基中純化Flt4胞外結(jié)構(gòu)域(Flt4EC)。
通過腹膜內(nèi)注射經(jīng)弗氏完全佐劑乳化之純化的重組制備的Flt4胞外結(jié)構(gòu)域(150μg/小鼠)，免疫四月齡的Balb/c雄性小鼠。間隔三到四周后注射150μg加強(qiáng)免疫，并且在再間隔三周之后，進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫(10μg溶于PBS的Flt4EC，腹膜內(nèi)給藥)。在最后一次加強(qiáng)免疫給藥后4天，處死小鼠，并將小鼠脾淋巴細(xì)胞與SP 2/0漿細(xì)胞瘤的細(xì)胞以2∶1比率進(jìn)行融合。
在96孔培養(yǎng)板(NUNC)上含20％胎牛血清和HAT(次黃嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷，GIBCO，043-01060H；稀釋50倍)的Ex-Cell320培養(yǎng)基(SERALAB)中培養(yǎng)融合細(xì)胞。在37℃ 5％CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞。10天后，將含HAT的培養(yǎng)基換成含HT的細(xì)胞培養(yǎng)基(GIBCO；043-01065H，稀釋50倍)。HT培養(yǎng)基與HAT培養(yǎng)基相同，但其沒有氨基蝶呤。
三周后，通過下面實(shí)施例26所述抗原特異性免疫熒光測定法(IFMA)確定特異性抗體的產(chǎn)生。按Staszewski等，耶魯大學(xué)生物和醫(yī)學(xué)雜志，57865-868(1984)所述方法通過有限稀釋法，將主要克隆進(jìn)行克隆。將陽性克隆在24孔組織培養(yǎng)板(NUNC)中擴(kuò)增培養(yǎng)、再克隆并用相同的方法進(jìn)行再檢測。通過熒光激活細(xì)胞分類法(FACS)檢測陽性克隆。
除了一個(gè)克隆分泌的Ig可能屬于IgA類之外，穩(wěn)定克隆分泌的免疫球蛋白屬于IgG1類。利用抗小鼠亞類的生物素偶聯(lián)的(SEROTEC)大鼠單克隆抗體，用IFMA法確定單克隆抗體的亞類。
利用Balb/c小鼠在其腹水中制備單克隆抗體。在用降植烷(2，6，10，14-四甲基十五烷98％，ALDRJCH-CHEMIC D7924 Steinheim，目錄號(hào)T2280-2)預(yù)處理動(dòng)物之后，將上述的雜交瘤給小鼠腹腔注射。在注射雜交瘤細(xì)胞之前，注射(i.v.)0.5ml降植烷約兩周。注射的細(xì)胞總量約為每只小鼠7.5-9×106。在注射雜交瘤10-14天后，收集腹水。
融合蛋白II通過腹膜內(nèi)注射用弗氏完全佐劑乳化的重組制備的Flt4胞外結(jié)構(gòu)域蛋白(20μg/小鼠)，免疫二月齡的Balb/c(雌性)小鼠。間隔三到四周后注射20μg加強(qiáng)免疫，并且在再間隔三周之后，進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫(10μg溶于PBS的Flt4，i.v.給藥)。在最后一次加強(qiáng)免疫給藥后4天，處死小鼠，并將小鼠脾淋巴細(xì)胞與SP 2/0漿細(xì)胞瘤以2∶1比率進(jìn)行融合。
將融合細(xì)胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板(FALCON)上含20％胎牛血清和HAT(次黃嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷，GIBCO BRL，21060-017；稀釋50倍)的OptiMEMl(含Glutamax，1,51985-026 GIBCO BRL)培養(yǎng)基中。在37℃5％CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞。10天后，將含HAT的培養(yǎng)基換成含HT的細(xì)胞培養(yǎng)基(GIBCO BRL；41065-012，稀釋50倍)。
三周后，通過下面實(shí)施例26中所述抗原特異性免疫熒光測定法(IFMA)確定特異性抗體產(chǎn)物。按Staszewski等(1984)所述方法通過有限稀釋法，將主要克隆進(jìn)行克隆。將陽性克隆在24孔組織培養(yǎng)板(FALCON)中擴(kuò)增培養(yǎng)、再克隆并用相同的方法再檢測。通過FACS法檢測陽性克隆。
2Ell和6B2克隆分泌的免疫球蛋白屬于IgG1類，2B12克隆產(chǎn)生的Ig屬于IgM亞類。利用抗小鼠亞類重鏈的生物素偶聯(lián)大鼠單克隆抗體(SEROTEC)，用IFMA法確定小鼠亞類IgG1，并且用小鼠單克隆抗體獨(dú)特型試劑盒(Dipstick Format)(19663-012，Life Technologies Inc)確定小鼠亞類IgM。
實(shí)施例26抗Flt4單克隆抗體的特異性將純化的重組Flt4胞外結(jié)構(gòu)域-6xHis融合蛋白產(chǎn)物(按實(shí)施例14和25中所述方法制備)用銪標(biāo)記，使用的方法是根據(jù)Mukkala等，Anal.Biochem，176(2)319-325(1989)中所述方法，并進(jìn)行了如下修改將摩爾濃度過量250倍的異硫氰酸DTTA-Eu(N1螯合物，WALLAC，芬蘭)加入Flt4溶液(溶于PBS，0.5mg/ml)，并且通過加入pH9.8的0.5M碳酸鈉緩沖液將pH值調(diào)到9左右。4℃標(biāo)記過夜。利用PD-10(PHARMACIA，瑞典)以TSA(50mMTris-HCl，pH7.8，含0.15MNaCl)作為洗脫液去除未結(jié)合的標(biāo)記物。
純化之后，向標(biāo)記的Flt4中加入1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，4℃保存。摻入到每個(gè)Flt4分子中的銪離子平均數(shù)目為1.9，其是通過測量相對于已知EuCl3標(biāo)準(zhǔn)品的熒光比率而確定的(Hemmila等，Anal Biochem，137335-343(1984))。
用兔抗小鼠Ig(Z 259，DAKOPATTS)包被的微滴定條孔(strip wells)(NUNC)經(jīng)夾心免疫熒光試驗(yàn)篩選在實(shí)施例25中制備的抗體。用DELFIA洗滌液在Platewash 1296-024(WALLAC)上將預(yù)包被孔洗一次。所述DELFIA試驗(yàn)緩沖液作為稀釋緩沖液，用于稀釋初篩中的細(xì)胞培養(yǎng)上清和作為陽性對照的脾切除小鼠之血清(1∶1000到1∶100000稀釋)。
在Plateshake震蕩器(1296-001，WALLAC)上震動(dòng)5分鐘，隨后用上述洗滌溶液洗滌4次，4℃孵育過夜(或在室溫下溫育2小時(shí))。
將1∶500稀釋的所述銪標(biāo)記Flt4加入到100μl檢測緩沖液中。在Plateshake震蕩器上震蕩5分鐘并在室溫下溫育1小時(shí)之后，按上述方法洗滌所述條孔。
加入增強(qiáng)溶液(DELFIA)200微升/孔。將平板在Plareshake震蕩器上震蕩5分鐘，用ARCUS-1230(WALLAC)檢測熒光強(qiáng)度10-15分鐘(Lovgren等，見Collins W.P.(主編)，AlternativeImmunoassays，John Wiley和Sons Ltd(1985)，203-216頁)。DELFIA結(jié)果表明，檢測的所有單克隆抗體均結(jié)合Flt4EC抗原。挑選與Flt4反應(yīng)的單克隆抗體(和產(chǎn)生這些抗體的雜交瘤)用于進(jìn)一步篩選。
用所得單克隆抗體對表達(dá)LTR-FLT41構(gòu)建體的NIH3T3細(xì)胞和轉(zhuǎn)染新霉素抗性的NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行雙抗免疫熒光染色。細(xì)胞用EDTA從培養(yǎng)板上脫落，染色，在熒光激活細(xì)胞分類器(FACS)上進(jìn)行分析。FACS分析的結(jié)果表示為用指定單克隆抗體染色的陽性細(xì)胞的百分率(見下表2)。
a)LTR感染細(xì)胞的FACS結(jié)果b)NEO感染細(xì)胞的FACS結(jié)果LTR-FLT41轉(zhuǎn)染細(xì)胞的FACS結(jié)果表明所述抗體有效地識(shí)別Flt4-表達(dá)細(xì)胞。這些相同抗體在新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞中只給出背景染色。因此，所述抗體特異性識(shí)別細(xì)胞表面的Flt4酪氨酸激酶。
發(fā)現(xiàn)一個(gè)命名為抗Flt4雜交瘤9D9F9的克隆穩(wěn)定地分泌單克隆抗體，通過IFMA確定其為IgG1類免疫球蛋白。雜交瘤9D9F9于1995年3月23日保藏于德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，人類細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物及病毒部，Mascheroder Weg 1b，3300 Braunschweig，德國，登記號(hào)為ACC2210。
融合蛋白II抗體上述銪標(biāo)記的Flt4胞外結(jié)構(gòu)域蛋白還被用來篩選實(shí)施例25中所述融合蛋白II的抗體。應(yīng)用兔抗小鼠Ig(Z 259 DAKO)包被的微滴定孔(Nunc，Polysorb)，用Flt4特異的IFMA篩選所述抗體。通過應(yīng)用DELFIA平板洗滌佼，用洗滌溶液(Wallac)洗滌所述預(yù)包被孔一次。
用DELFIA檢測緩沖液稀釋細(xì)胞培養(yǎng)上清(在初步篩選中1∶2稀釋)和作為陽性對照的脾切除小鼠血清(1∶1000到1∶100000稀釋)。與標(biāo)準(zhǔn)一樣，純化的抗Flt49D9F9(小鼠IgG1亞類)的使用濃度為1.0ng/ml-250ng/ml。首先在室溫下將樣品在Plateshake上震蕩5分鐘，然后4℃孵育大約18小時(shí)。首先將框架洗滌4次，然后加入Eu標(biāo)記的Flt4(1∶2000，溶于100μl檢測緩沖液中)，最后在室溫下將框架孵育1小時(shí)。按所述方法洗滌之后，加入增強(qiáng)溶液(200μl/孔，Wallac)，并將此框架在Plateshake震蕩器上震蕩5分鐘。用ARCUS-1230(Wallac)測定熒光強(qiáng)度。挑選與Flt4反應(yīng)的單克隆抗體，進(jìn)一步在使用Flt4表達(dá)型NIH3T3細(xì)胞的雙抗體免疫熒光染色檢測進(jìn)行篩選，方法按上述。
在表3中概括了所得抗Flt4的融合蛋白II單克隆抗體及其相應(yīng)的FACS分析結(jié)果(用指定單克隆抗體染色為陽性的細(xì)胞的百分率表示)。
用親和純化的抗-Flt49D9F9制備用于抗Flt4抗體定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性范圍為1.0ng/ml到250ng/ml。
將用pLTRELT41構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染的在表面表達(dá)全長Flt4的NIH3T3細(xì)胞裂解，使裂解物在6.5％SDS-PAGE中電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜(0.45μm，SCHLEICHER and SCHUELL)上，用含單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清(1∶10，含4％甲醇和0.04％SDS的50mM TRIS-40mM甘氨酸緩沖液)進(jìn)行免疫雜交。與HRP偶聯(lián)型兔抗小鼠Ig(P161，DAKO，在含150mM生理鹽水和5％奶粉的20mM TRIS緩沖液，pH7.5中1∶1000稀釋)和ECL(增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光劑，AMERSHAM)溫育，檢測單克隆抗體的特異性。
a)LTR轉(zhuǎn)染細(xì)胞的FACS結(jié)果b)NEO細(xì)胞(對照)的FACS結(jié)果c)以親和純化的抗FLT 9D9F9抗體為標(biāo)準(zhǔn)，定量Mab的產(chǎn)量NF在FACS中無功能WB成功的用于Western免疫雜交實(shí)施例27應(yīng)用抗Flt4抗體鑒定細(xì)胞裂解物中的Flt4和在人類組織的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的Flt4將由前面的實(shí)施例中所述雜交瘤9D9產(chǎn)生的單克隆抗體用于HEL細(xì)胞裂解物的免疫沉淀和Western雜交。如實(shí)施例6中所述，已經(jīng)在HEL細(xì)胞中觀察到Flt4 mRNA表達(dá)。將大約2×107個(gè)HEL培養(yǎng)細(xì)胞在實(shí)施例11中敘述的RIPA緩沖液中裂解，并與約2微克9D9抗體(相當(dāng)于實(shí)施例11的多克隆抗體)免疫沉淀。使免疫沉淀物在SDS-PAGE(6％凝膠)上電泳，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜進(jìn)行Western分析。在免疫沉淀物的Western雜交分析中，用1微克/ml 9D9抗體檢測到175KD和125KD的多肽條帶，它們對應(yīng)于Flt4多肽。
用9D9單克隆抗體和堿性磷酸酶ABC-AP試劑盒(Dako)對人皮膚組織進(jìn)行免疫染色。簡言之，在室溫(RT)下將成人皮膚樣品的6μm切片干燥30分鐘，用冷丙酮固定10分鐘，然后用磷酸鹽緩中液(PBS)洗滌一次，5分鐘。然后將樣品與2％馬血清在室溫下孵育30分鐘，并用PBS洗滌三次，每次5分鐘。
為進(jìn)行免疫染色，將樣品與9D9第一抗體室溫溫育1小時(shí)，用PBS洗滌三次，每次5分鐘。洗滌后，將樣品與生物素化的兔抗小鼠第二抗體室溫孵育30分鐘，再用PBS洗滌三次，每次5分鐘。
所結(jié)合的抗體如下進(jìn)行檢測在室溫下與ABC-AP混合物溫育30分鐘，用PBS洗滌三次，與AP底物(SigmaFastRedTR/Naphtol AS-MX(目錄號(hào)為F-4648))在室溫下溫育15分鐘，用水洗滌。然后用Mayer′s蘇木精對染30秒，并用水清洗。應(yīng)用Aquamount和蓋玻片，在顯微鏡下分析樣品。在這些人類皮膚切片中的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中觀察到9D9抗體染色。血管內(nèi)皮染色很弱或未被染色。還利用其它分析證實(shí)對淋巴管內(nèi)皮的顯著特異性。見Lymboussaki等，美國病理學(xué)雜志，153(2)395-403(1998年8月)；和Jussila等，癌癥研究，581599-1604(1998年4月)，二者均全文引入作為參考。
這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，F(xiàn)lt4可作為淋巴管內(nèi)皮的有效標(biāo)記物使用，抗Flt4抗體可用于鑒定并顯示組織樣品的這些細(xì)胞中所表達(dá)的Flt4。
實(shí)施例28在乳腺癌血管發(fā)生中VEGF-C/VEGFR-3信號(hào)途徑的上調(diào)上述實(shí)施例證實(shí)Flt4(VEGFR-3)是正常組織中有效的淋巴管內(nèi)皮特異性抗原標(biāo)記。下述方法還證實(shí)VEGFR-3是惡性乳腺癌的有效抗原標(biāo)記(如用于診斷和普查)和治療藥物。與組織學(xué)上正常的乳腺組織相比，在浸潤性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)VEGFR-3陽性脈管的數(shù)量大大增加(P＜0.0001)。
材料和方法從Helsinki大學(xué)病理系的標(biāo)本庫中取得新鮮的冰凍乳腺組織樣品。這些樣品包括導(dǎo)管癌(n＝6)、小葉癌(n＝6)、導(dǎo)管內(nèi)癌(n＝8)、纖維腺瘤(n＝4)和組織學(xué)上正常的乳腺組織(n＝12)。所有樣品均在切除術(shù)后立即凍于液氮，并在-70℃保存。
基本上按上述實(shí)施例(例如實(shí)施例25)中的方法制備的小鼠抗人Flt4(VEGFR-3)單克隆抗體(Mab)。通過重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)VEGFR-3胞外結(jié)構(gòu)域(VEGFR-3EC)，并從培養(yǎng)基中純化。然后用標(biāo)淮的方法制備小鼠抗VEGFR-3EC單克隆抗體，并用蛋白A親和層析從雜交瘤腹水或Tecnomouse培養(yǎng)上清中純化免疫球蛋白級分。
將所述組織樣品的5微米冰凍切片在空氣中干燥，并用冷丙酮固定10分鐘。將所述切片在磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行再水化，并與5％正常馬血清在室溫下溫育30分鐘。然后將所述切片與濃度為1.0μg/ml的Mab 9D9F9(實(shí)施例26)在潮濕的空氣中室溫溫育2小時(shí)。還研究了抗VEGFR-3EC的不同抗原決定簇的其它抗VEGFR-3Mab；克隆2E11D11(實(shí)施例26)和7B8F9(基本上按實(shí)施例26所述方法制備)的使用濃度分別為9.5和8.5μg/ml。在生物素化的抗小鼠血清中溫育30分鐘，隨后用VectastainElite小鼠IgGABC試劑盒(載體實(shí)驗(yàn)室，Burlingame，美國)的試劑溫育60分鐘。用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC，Sigma，St.Louis，USA)使過氧化酶活性顯色10分鐘。最后，用蘇木精將切片染色20秒。通過省略第一抗體或應(yīng)用具有相同獨(dú)特型的無關(guān)第一抗體，進(jìn)行陰性對照實(shí)驗(yàn)。用純化的桿狀病毒免疫原阻斷9D9抗體的結(jié)合，以其作為另一個(gè)陰性對照。在這些實(shí)驗(yàn)中，所述抗體均與摩爾過量10倍的VEGFRR-3EC蛋白在PBS中溫育過夜。4℃，4000rpm離心4分鐘后，小心地收集上清，并將其作為第一抗體。選取與抗VEGFR-3抗體染色陽性的切片相鄰的5μm冰凍切片進(jìn)行血管內(nèi)皮標(biāo)記物的免疫染色，這些標(biāo)記物包括PAL-E(0.15μg/ml，Monosan，Uden，荷蘭)、層粘連蛋白(克隆LAM-89的上清的1∶4000稀釋，Sigma，St Louis，MO)、膠原XVIII(1.9μg/ml)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA，0.5μg/ml，克隆1A4，Sigma)、VEGFR-1(克隆19上清的1∶200稀釋)或VEGFR-2(1∶100稀釋)。
染色后對所有樣品進(jìn)行病理學(xué)檢查。按照Gasparini和Harris建議的方法[Gasparini G和Harris A，臨床腫瘤學(xué)雜志，13765-782(1995)]，從PAL-E染色的切片中獲得血管密度。用相同的方法研究VEGFR-3陽性脈管的密度。首先在低倍顯微鏡下瀏覽切片，然后通過在血管密度最高的區(qū)域(血管熱點(diǎn)區(qū))或在VEGFR-3陽性脈管密度最高的區(qū)域中計(jì)數(shù)每400x高倍視野中染色脈管的數(shù)目，從而估測腫瘤內(nèi)血管密度。每張切片最少計(jì)數(shù)5個(gè)視野，之后取最高的3個(gè)計(jì)數(shù)的平均值。
在兩個(gè)導(dǎo)管內(nèi)瘤中，用雙染色來區(qū)分淋巴管和血管的免疫組化染色。將丙酮固定的5μm冰凍切片與用抗-PAL-E抗體溫育1小時(shí)，與生物素化的馬抗小鼠抗體(VestastainElite小鼠IgGABC試劑盒，載體實(shí)驗(yàn)室，Burlingame，美國)溫育30分鐘，與ABC過氧化酶(Vestastain，1∶100)溫育45分鐘，用AEC顯色10分鐘。在第二步中，根據(jù)先前在文獻(xiàn)中敘述的用于ISH信號(hào)增強(qiáng)的方法[Kerstens等，組織化學(xué)細(xì)胞化學(xué)雜志，43347-352(1995)]，將切片與抗VEGFR-3抗體溫育1小時(shí)(0.14μg/ml)，隨后與生物素化的抗小鼠抗體溫育30分鐘(克隆上清的1∶200稀釋)，與ABC過氧化酶溫育30分鐘(1∶100)，與含0.01％過氧化物的生物素化酪胺溶液(1∶2000)溫育5分鐘，與ABC堿性磷酸酶(1∶100)溫育20分鐘，并用FastBlue(Sigma，StLouis，美國)顯色20分鐘。將臨近雙染色切片的冰凍切片(5μm)僅用VEGFR-3抗體按上述方法進(jìn)行免疫染色。
按文獻(xiàn)[Joukov等，EMBO J，163898-3911(1997)，在此全文引入作為參考]所述，在兔中制備人工合成多肽的多克隆抗體，所述多肽相應(yīng)于成熟、分泌型人血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)的N末端氨基酸殘基2-18(VEGF-C前原VEGF-C多肽的氨基酸殘基104-120)。使免疫原性多肽與環(huán)氧樹脂激活的Sepharose-6B柱偶聯(lián)，抗血清用其進(jìn)行親和純化，并利用表達(dá)VEGF-C或?qū)φ咋掳肴樘擒彰傅南俨《靖腥镜募?xì)胞檢測對VEGF-C的特異性染色。
選擇8個(gè)導(dǎo)管內(nèi)腫瘤和所有用于VEGFR-3分析的浸潤性腫瘤，進(jìn)一步分析VEGF-C的表達(dá)。將與VEGFR-3抗體染色陽性的切片臨近的5微米冰凍切片在空氣中干燥，并用冷丙酮固定10分鐘。將這些切片在PBS中再水化，并在5％正常山羊血清中溫育30分鐘，然后與在PBS中1∶200稀釋的免抗人VEGF-C多克隆抗體，在潮濕的空氣中室溫溫育2小時(shí)。然后在生物素化的抗兔血清中溫育30分鐘，隨后用VestastainElitc兔IgGABC試劑盒(載體實(shí)驗(yàn)室，Burlingame，美國)的試劑溫育60分鐘。按上述方法進(jìn)一步處理所述切片。將所述純化的免疫原用于阻斷VEGF-C抗體，以其作為陰性對照。在這些實(shí)驗(yàn)中，將VEGF-C抗體與10倍摩爾過量的VEGF-C蛋白在PBS中溫育過夜。4℃，4000rpm離心4分鐘后，小心地收集上清并將其用于免疫染色。
DiaBor Ltd(Oulu，芬蘭)通過用重組多肽QH48.18[Saarela等，MatrixBiology，16319-28(1998)]免疫小鼠，制備了抗人型XVIII膠原的單克隆抗體，其中所述重組多肽對應(yīng)于人型XVIII膠原N末端NCl結(jié)構(gòu)域的共同區(qū)。所得克隆用多肽QH48.18經(jīng)ELISA和Western分析，以及人的冰凍組織切片的免疫熒光染色進(jìn)行篩選。對雜交瘤克隆的篩選獲得3個(gè)單克隆抗體，它們在上述三個(gè)試驗(yàn)(ELISA，Western，免疫熒光染色)中均為陽性。信號(hào)最強(qiáng)的抗體DB144-N2被用于隨后的實(shí)驗(yàn)。它的染色模式(例如，在成人皮膚和腎臟樣品中)與多克隆抗全hu(VXIII)的模式一樣。
結(jié)果A.組織學(xué)上正常的乳腺組織和良性纖維腺瘤中的VEGFR-3正常乳腺組織中VEGFR-3的免疫組化染色表明在導(dǎo)管間間質(zhì)的毛細(xì)血管中染色很弱。這些血管不形成任何特殊的模式，而是彌散分布于整個(gè)間質(zhì)中。正常乳腺組織樣品中VEGFR-3陽性血管的密度范圍為6-17/hpf，中間值為9(n＝12)。此類脈管的大部分對血管內(nèi)皮標(biāo)記物PAL-E和基底層粘連蛋白組分，膠原XVIII的染色為強(qiáng)陽性，表明VEGFR-3在正常乳腺組織血管中表達(dá)很弱。然而，基質(zhì)中VEGFR-3清晰染色的一些小脈管對PAL-E染色為陰性，對膠原XVIII染色很弱，表明它們是淋巴管。在良性纖維腺瘤中也發(fā)現(xiàn)了均一的VEGFR-3陽性脈管，其密度(均值為8個(gè)脈管/hpf，范圍為3-19，n＝4)與組織學(xué)上正常的乳腺組織的密度沒有差別(均值8對9，Mann-Whiteney檢驗(yàn)P＞0.1)。
B.導(dǎo)管內(nèi)腫瘤中的VEGFR-3陽性脈管在導(dǎo)管內(nèi)腫瘤中觀察強(qiáng)染色的VEGFR-3陽性脈管的不同模式。這些脈管在受侵襲的導(dǎo)管周圍形成弓樣結(jié)構(gòu)(圖5A)。對臨近切片的血管內(nèi)皮標(biāo)記物PAL-E的染色中，也觀察到此“項(xiàng)鏈狀”結(jié)構(gòu)(圖5B)，表明在毛細(xì)血管內(nèi)皮中VEGFR-3表達(dá)增加。為了更進(jìn)一步明確區(qū)分血管和淋巴管，并搜索脈管壁中平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞的存在，另用抗平滑肌α肌動(dòng)蛋白(SMA)、基底層組分層粘連蛋白及XVIII型膠原的抗體進(jìn)行染色。根據(jù)此染色，靠近導(dǎo)管內(nèi)腫瘤的小脈管同時(shí)表達(dá)VEGFR-3和基底層蛋白，但是對SMA染色較弱，表明它們被所述脈管壁中的周細(xì)胞/平滑肌細(xì)胞不完全覆蓋(圖5C-5F中黑色箭頭)。相反，離導(dǎo)管內(nèi)損傷一定距離的大血管通常為VEGFR-3陰性，但其層粘連蛋白、膠原XVIII和SMA為陽性(紅色箭頭)。另外，發(fā)現(xiàn)了對VEGFR-3為陽性，而對基底層的層粘連蛋白和XVIII型膠原染色很弱，而且SMA根本未染色(綠箭頭)的脈管。認(rèn)為這些脈管代表淋巴管。
C.血管和淋巴管的差異復(fù)染選擇兩個(gè)導(dǎo)管內(nèi)腫瘤進(jìn)行免疫組化復(fù)染，以便更進(jìn)一步明確區(qū)分血管和淋巴管[見de Waal等，美國病理學(xué)雜志，1501951-1957(1997)]。應(yīng)用這種方法，VEGFR-3陽性血管被染成蘭色，而PAL-E陽性血管和基底層被染成褐色。兩個(gè)檢測的樣品均顯示相似的染色模式排列于填滿腫瘤的導(dǎo)管中的血管主要為PAL-E陽性(圖5G和5H中箭頭所指)，而在導(dǎo)管間基質(zhì)中離其一小段距離的可能的VEGFR-3陽性淋巴管為PAL-E陰性(圖5G和圖5H中黑色箭頭)。為了排除由于可能的復(fù)染假象造成的誤解，單獨(dú)用抗VEGFR-3染色臨近的5微米切片。此染色證實(shí)，若干PAL-E陽性血管對VEGFR-3也為陽性。
D.導(dǎo)管內(nèi)腫瘤細(xì)胞中的VEGF-C、VEGFR-1和VEGFR-2以及臨近脈管中的它的受體用抗人VEGF-C的親和純化的多克隆抗體對8例導(dǎo)管內(nèi)腫瘤樣品染色。所有檢測樣品包括至少一些VEGF-C，但發(fā)現(xiàn)其染色強(qiáng)度和表達(dá)模式有明顯異質(zhì)性。在一些病例中，大部分腫瘤細(xì)胞對VEGF-C為強(qiáng)陽性，而在其它病例中，只有一些腫瘤細(xì)胞給出染色信號(hào)。相反，雖然在未受侵襲的正常導(dǎo)管內(nèi)皮中有弱信號(hào)，在受侵襲導(dǎo)管周圍的正常組織中發(fā)現(xiàn)幾乎沒有或根本沒有染色?？乖钄鄬?shí)驗(yàn)表明對VEGF-C的染色是特異性的。在臨近導(dǎo)管內(nèi)腫瘤細(xì)胞的相同“項(xiàng)鏈”狀脈管中，另一VEGF-C受體VEGFR-2以及另一VEGF受體(VEGFR-1)均進(jìn)行表達(dá)。
E.侵襲性乳腺癌中的VEGFR-3陽性脈管和VEGF-CVEGFR-3染色強(qiáng)陽性脈管還出現(xiàn)于所研究的所有侵襲性導(dǎo)管癌和小葉癌中。所述VEGFR-3陽性脈管不形成任何特殊的分布模式；這些脈管的大部分還對PAL-E抗原具有免疫反應(yīng)性。侵襲性乳腺癌中腫瘤內(nèi)VEGFR-3陽性脈管密度(均值為21，范圍為9-56脈管/hpf，n＝12)，與正常乳腺組織的密度相比顯著增加(均值21比9；Mann-Whitney檢測P＜0.0001)。偶爾可以觀察到腫瘤細(xì)胞侵入VEGFR-3陽性淋巴管。
在所研究的侵潤腫瘤中，對VEGF-C的免疫染色差別很大(n＝12)。一些腫瘤細(xì)胞對VEGF-C染色為強(qiáng)陽性，而其它腫瘤染色很弱，或者在一些病例中沒有發(fā)現(xiàn)染色。與導(dǎo)管內(nèi)腫瘤的情況一樣，在這些切片的結(jié)締組織中幾乎沒有或根本沒有發(fā)現(xiàn)染色。
上述的資料表明在大部分成人組織中是主要的淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物的VEGFR-3在正常乳腺組織毛細(xì)血管內(nèi)皮中表達(dá)很弱。在導(dǎo)管內(nèi)腫瘤中，檢測到VEGFR-3強(qiáng)陽性脈管的“項(xiàng)鏈”狀模式比較明顯的排列于填滿腫瘤的導(dǎo)管中。大部分的這些脈管表達(dá)血管內(nèi)皮標(biāo)記物PAL-E和基底層組分層粘連蛋白和膠原XVIII，但是其周細(xì)胞/平滑肌細(xì)胞數(shù)明顯比離腫瘤細(xì)胞較遠(yuǎn)的血管的少，如抗SMA抗體染色所示。這些特征表明所述“項(xiàng)鏈”狀脈管正在經(jīng)歷血管發(fā)生。離受侵襲導(dǎo)管一段距離的第二組脈管對VEGFR-3為陽性，但是對基底層組分為弱陽性，且對PAL-E為陰性，表明它們是淋巴管。這些脈管也缺乏SMA陽性的周細(xì)胞組分。另外在浸潤性乳腺癌中，VEGFR-3在PAL-E陽性血管中上調(diào)，但所見脈管模式在腫瘤細(xì)胞周圍的結(jié)締組織基質(zhì)中分布更隨機(jī)。這些結(jié)果表明在與腫瘤生長相關(guān)的血管發(fā)生期間，乳腺癌中VEGFR-3表達(dá)上調(diào)。在腫瘤原位中VEGFR-3陽性脈管數(shù)大大增加的發(fā)現(xiàn)，符合以下假說，即腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了可活化其緊鄰區(qū)血管生長的因子。
因?yàn)閂EGF-C與VEGFR-3和VEGFR-2均高親和力結(jié)合，并且因?yàn)閷?dǎo)管內(nèi)腫瘤和侵襲性腫瘤對VEGF-C染色經(jīng)常為陽性，此生長因子是腫瘤中VEGFR-3和VEGFR-2陽性脈管的侯選生長因子。這些資料與另一研究相一致，該研究在Northern雜交分析中發(fā)現(xiàn)35例未篩選的惡性浸潤性腫瘤(包括乳腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、淋巴瘤、黑色素瘤和肉瘤)的近一半包括VEGF-CmRNA[見Salven等，美國病理學(xué)雜志，153(1)103-108(1998年7月)，已引入本文作參考]?？偠灾诒疚乃鲑Y料可指導(dǎo)用阻斷VEGF-C所介導(dǎo)的VEGFR-2和/或VEGFR-3刺激作用的試劑對乳腺癌(可能還包括其它非淋巴管性腫瘤)的治療。可選的阻斷劑包括抗VEGF-C抗體；抗VEGFR-3抗體；抗VEGFR-2抗體；與VEGFR-3和VEGFR-2或VEGFR-1結(jié)合的雙特異性抗體；與循環(huán)的VEGF-C結(jié)合的VEGFR-3可溶性胞外片段；結(jié)合VEGFR-3和/或VEGFR-2并抑制此類受體活化的VEGF-C片段和類似物；與VECFR-3和/或VEGFR-2結(jié)合并結(jié)合適當(dāng)治療藥物的VEGF-C多肽、片段和類似物；VEGFR-3酪氨酸激酶抑制劑；和結(jié)合并抑制這些受體的小分子。另外，因?yàn)閂EGF-D與VEGFR-3和VECFR-2均結(jié)合，考慮抗VEGF-D抗體和抑制性VEGF-D片段和類似物為合適的阻斷藥物。當(dāng)選用抗體治療人類時(shí)，優(yōu)選人或人源化抗體及其片段。另外，本發(fā)明另一方面涉及在體內(nèi)或體外利用上述任何藥物評估哺乳動(dòng)物組織，例如用于診斷和普查惡性腫瘤及其傳播。
可對上述任何試劑進(jìn)行進(jìn)一步改良，使其適用與診斷和普查，改良方法有結(jié)合可檢測的標(biāo)記，其包括但不限于放射性同位素(例如14C、133I、125I)、發(fā)色基團(tuán)(例如熒光素，藻膽蛋白；四乙基羅丹明；可產(chǎn)生熒光或發(fā)色物質(zhì)以便熒光檢測的酶；可產(chǎn)生電子致密產(chǎn)物以便電子顯微鏡鏡檢的吸收光、可見色或凝集作用)；或電子致密分子如鐵蛋白、過氧化酶或金顆粒等。同樣，可通過結(jié)合(如偶聯(lián))以下分子或與它們一起施用，從而改良所述試劑使其適用于治療，所述分子有具有抗腫瘤特性的分子，例如植物、動(dòng)物、微生物或真菌來源的毒素；放射性同位素；藥物；酶；和/或細(xì)胞因子和其它治療性蛋白(見例如Pietersz和McKenzie，“用于癌癥治療的抗體結(jié)合物”，免疫學(xué)綜述，12957-80(1992)，在此引入本文作為參考。)實(shí)施例29抗-Flt4抗體作為治療藥物給人施用A.抗Flt4單克隆抗體的人源化在本文中(例如實(shí)施例28中)報(bào)道的Flt4的生物學(xué)，表明了對阻斷配體介導(dǎo)之Flt4受體信號(hào)傳遞的Flt4抑制劑(拮抗劑)的治療應(yīng)用。中和Flt4的抗體包括一類作為Flt4拮抗劑的治療藥物。下面所述是實(shí)驗(yàn)方案，其用來改進(jìn)在人類中作為治療藥物的抗Flt4單克隆抗體的應(yīng)用，其通過“人源化”所述單克隆抗體來改進(jìn)其在人體內(nèi)的血清半衰期并降低其免疫原性(即用來防止人體對非人抗Flt4抗體的抗體應(yīng)答)。
在文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了人源化的原則，通過抗體蛋白的分子重排促進(jìn)人源化。為了使結(jié)合補(bǔ)體的可能性最小，優(yōu)選IgG4同種型的人源化抗體。
例如，通過制備嵌合抗體達(dá)到人源化水平，所述嵌合抗體包括目的非人抗體蛋白(例如本文中所述抗Flt4單克隆抗體)的可變區(qū)，和人抗體分子的恒定區(qū)[見例如Morrison和Oi，免疫學(xué)進(jìn)展，4465-92(1989)]。從B細(xì)胞雜交瘤的染色體DNA或從目的雜交瘤的mRNA制備的cDNA中克隆出中和抗Flt4抗體的Flt4可變區(qū)。將V區(qū)基因片段與編碼人抗體恒定區(qū)的外顯子連接，并將得到的構(gòu)建體在適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物宿主細(xì)胞(例如骨髓瘤或CHO細(xì)胞)中表達(dá)。
為了獲得更高的人源化水平，僅將那些編碼非人單克隆抗體基因之抗原結(jié)合互補(bǔ)決定區(qū)(“CDR”)的可變區(qū)基因片段的部分克隆到人抗體序列中[見例如Jones等，自然，321522-525(1986)；Riechmann等，自然，332323-327(1988)；Verhoeyen等，科學(xué)，2391534-36(1988)；和Tempest等，生物/技術(shù)，9266-71(1991)]。必要時(shí)，還可修飾圍繞CDR3區(qū)的人抗體β片層框架，從而更能影映原始單克隆抗體抗原結(jié)合區(qū)的三維結(jié)構(gòu)[見Kettleborough等，蛋白質(zhì)工程，4773-783(1991)；和Foote等，分子生物學(xué)雜志，224487-499(1992)]。
在另一個(gè)方法中，通過如定點(diǎn)誘變改變非人抗體表面的指定殘基，但保留非人抗體的所有內(nèi)部殘基和用于連接的殘基，可使目的非人單克隆抗體的表面人源化。見Padlan，分子免疫學(xué)，28(4/5)489-98(1991)。
可用上述方法，通過中和Flt4的抗-Flt4單克隆抗體和產(chǎn)生它們的雜交瘤，例如抗體9D9F9，來產(chǎn)生人源化Flt4中和抗體，其可作為藥物有效治療和緩解以Flt4表達(dá)為害的病情。
B.源自噬菌體展示的人源FIt4中和抗體用噬菌體展示技術(shù)(如下述)制備人源Flt4中和抗體Aujanme等，人類抗體，8(4)155-168(1997)；Hoogenboom等，TIBTECH，1562-70(1997)；和Rader等，Curr.Opin.Biotechnol.8503-508(1997)，均引入本文作為參考。例如，將抗體可變區(qū)如Fab片段或相連的單鏈Fv片段與絲狀噬菌體小衣殼蛋白pIII的氨基末端融合。融合蛋白的表達(dá)及其向成熟噬菌體衣殼中的摻入導(dǎo)致產(chǎn)生的噬菌體顆粒在其表面出現(xiàn)抗體并包含編碼該抗體的遺傳物質(zhì)。將包括這些構(gòu)建體的噬菌體文庫在細(xì)菌中表達(dá)，并利用標(biāo)記的或固相化Flt4作為抗原探針，篩選所述文庫的Flt4特異性噬菌體抗體。
C.源自轉(zhuǎn)基因小鼠的人Flt4中和抗體基本如Bruggemann和Nueberger，今日免疫學(xué)，17(8)391-97(1996)和Bruggemann和Taussig等，Curr.Opin.Biotechnol，8455-58(1997)中所述在轉(zhuǎn)基因小鼠中制備人F1t4中和抗體。利用傳統(tǒng)的免疫方法，用Flt4組合物對在其種系構(gòu)型中攜帶人V基因片段并在其淋巴組織中表達(dá)這些轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫。用傳統(tǒng)方法免疫小鼠，取其B細(xì)胞制備雜交瘤，通過篩選來鑒定分泌抗Flt4人源抗體的雜交瘤(例如，如上所述)。
D.雙特異性抗體用文獻(xiàn)所述的標(biāo)準(zhǔn)方法，制備、分離和檢驗(yàn)與Flt4特異性結(jié)合并且相關(guān)于病理或治療的其它抗原特異性結(jié)合的雙特異性抗體。見，例如，Pluckthun和Pack，免疫技術(shù)，383-105(1997)；Carter等，血液治療雜志，4463-470(1995)；Renner和Pfreundschuh等，免疫學(xué)綜述，1995，145期，179-209頁；Pfreundschuh，美國專利號(hào)5643759；Segal等，血液治療雜志，4377-382；Segal等，免疫生物學(xué)，185390-402(1992)；和Bolhuis等，癌癥免疫學(xué).免疫治療，341-8(1991)，均全文引入本文作為參考。
實(shí)施例30用來證明抗Flt4的癌癥治療功效的動(dòng)物模型癌癥治療可接受的任何動(dòng)物均可用于證實(shí)抗Flt4的癌癥治療功效。用標(biāo)準(zhǔn)的劑量-應(yīng)答研究證實(shí)對乳腺癌的治療功效的模型有Tekmal和Durgam，Cancer Lett，118(1)21-28(1997)；Moshakis等，英國癌癥雜志，43575-580(1981)；和Williams等，J.Nat.Cancer.Inst 66147-155(1981)所述。除了小鼠模型，狗和豬的模型也可考慮，因?yàn)橹辽倌承┤薋lt4抗體(例如所述9D9抗體)還識(shí)別狗或豬的Flt4。監(jiān)測腫瘤大小和副作用來證實(shí)與對照相比的治療功效。
所有文獻(xiàn)，包括本發(fā)明所簡要引用或詳細(xì)敘述的專利和期刊文章，均全文引入本文作為參考。
雖然本發(fā)明用具體實(shí)施方案進(jìn)行描述，但應(yīng)該理解它能夠進(jìn)一步修改，而且本申請意圖覆蓋總體上符合本發(fā)明原則而對本發(fā)明進(jìn)行的任何改變、應(yīng)用或調(diào)整，其包括根據(jù)本發(fā)明所屬領(lǐng)域已知或常規(guī)的實(shí)踐所作的不同于本文的改動(dòng)，符合本文所述基本特征的改動(dòng)，以及包含在所附權(quán)利要求書范圍之內(nèi)的改動(dòng)。
序列表<1l0>Helsinki University Licensing Ltd.，OYLudwig Institute For Cancer Research<120>Flt4(VEGFR-3)作為腫瘤顯像和抗腫瘤治療的靶<130>28113/34891<140><141><150>09/169,079<151>1998-10-09<160>22<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>4195<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(20)..(3913)<400>1ccacgcgcag cggccggag atg cag cgg ggc gcc gcg ctg tgc ctg cga ctg 52Met Gln Arg Gly Ala Ala Leu Cys Leu Arg Leu1 5 10tgg ctc tgc ctg gga ctc ctg gac ggc ctg gtg agt ggc tac tcc atg 100Trp Leu Cys Leu Gly Leu Leu Asp Gly Leu Val Set Gly Tyr Ser Met15 20 25acc ccc ccg acc ttg aac atc acg gag gag tca cac gtc atc gac acc 148Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val Ile Asp Thr30 35 40ggt gac agc ctg tcc arc tcc tgc agg gga cag cac ccc ctc gag tgg 196Gly Asp Ser Leu Ser Ile Set Cys Arg Gly Gln His Pro Leu Glu Trp45 50 55gct tgg cca gga gct cag gag gcg cca gcc acc gga gac aag gac agc 244Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp Lys Asp Ser60 65 70 75gag gac acg ggg gtg gtg cga gac tgc gag ggc aca gac gcc agg ccc 292Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp Ala Arg Pro80 85 90tac tgc aag gtg ttg ctg ctg cac gag gta cat gcc aac gac aca ggc 34061Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val His Ala Asn Asp Thr Gly95 100 105agc tac gtc tgc tac tac aag tac atc aag gca cgc arc gag ggc acc 388Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala Arg Ile Glu Gly Thr110 115 120acg gcc gcc age tcc tac gtg ttc gtg aga gac ttt gag cag cca ttc 436Thr Ala Ala Ser Ser Tyr Val Phe Val Arg Asp Phe Glu Gln Pro Phe125 130 135atc aac aag cct gac acg ctc ttg gtc aac agg aag gac gcc atg tgg 484Ile Asn Lys Pro Asp Thr Leu Leu Val Asn Arg Lys Asp Ala Met Trp140 145 150 155gtg ccc tgt ctg gtg tcc atc ccc ggc ctc aat gtc acg ctg cgc tcg 532Val Pro Cys Leu Val Ser Ile Pro Gly Leu Asn Val Thr Leu Arg Ser160 165 170caa agc tcg gtg ctg tgg cea gac ggg cag gag gtg gtg tgg gat gac 580Gln Ser Set Val Leu Trp Pro Asp Gly Gln Glu Val Val Trp Asp Asp175 180 185cgg cgg ggc atg ctc gtg tcc acg cca ctg ctg cac gat gcc ctg tac 628Arg Arg Gly Met Leu Val Ser Thr Pro Leu Leu His Asp Ala Leu Tyr190 195 200ctg cag tgc gag acc acc tgg gga gac tag gac ttc ctt tcc aac ccc 676Leu Gln Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu Ser Asn Pro205 210 215ttc ctg gtg cac atc aca ggc aac gag ctc tat gac atc cag ctg ttg 724Phe Leu Val His Ile Thr Gly Asn Glu Leu Tyr Asp Ile Gln Leu Leu220 225 230 235ccc agg aag tcg ctg gag ctg ctg gta ggg gag aag ctg gtc ctg aac 772Pro Arg Lys Set Leu Glu Leu Leu Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn240 245 250tgc acc gtg tgg gct gag ttt aac tca ggt gtc acc ttt gac tgg gac 820Cys Thr Val Trp Ala Glu Phe Asn Set Gly Val Thr Phe Asp Trp Asp255 260 265tac cea ggg aag cag gca gag egg ggt aag tgg gtg ccc gag cga cgc 868Tyr Pro Gly Lys Gln Ala Glu Arg Gly Lys Trp Val Pro Glu Arg Arg270 275 280tcc cag cag acc cac aca gaa ctc tcc agc atc ctg acc atc cac aac 916Ser Gln Gln Thr His Thr Glu Leu Ser Ser Ile Leu Thr Ile His Asn285 290 295gtc agc cag cac gac ctg ggc tcg tat gtg tgc aag gcc aac aac ggc 964Val Set Gln His 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Val Ser Ala Met Tyr Lys Cys Val Val Ser Asn Lys525 530 535gtg ggc cag gat gag cgg ctc atc tac ttc tat gtg acc acc atc ccc 1684Val G1y Gln Asp Glu Arg Leu Ile Tyr Phe Tyr Val Thr Thr Ile Pro540 545 550 555gac ggc ttc acc atc gaa tcc aag cca tcc gag gag cta cta gag ggc 1732Asp Gly Phe Thr Ile Glu Ser Lys Pro Ser Glu Glu Leu Leu Glu Gly560 565 570cag ccg gtg ctc ctg agc tgc caa gcc gac agc tac aag tac gag cat 1780Gln Pro Val Leu Leu Ser Cys Gln Ala Asp Ser Tyr Lys Tyr Glu His575 580 585ctg cgc tgg tac cgc ctc aac ctg tcc acg ctg cac gat gcg cac ggg 1828Leu Arg Trp Tyr Arg Leu Asn Leu Ser Thr Leu His Asp Ala His Gly590 595 600aac ccg ctt ctg ctc gac tgc aag aac gtg cat ctg ttc gcc acc cct 1876Asn Pro Leu Leu Leu Asp Cys Lys Asn Val His Leu Phe Ala Thr Pro605 610 615ctg gcc gcc agc ctg gag gag gtg gca cct ggg gcg cgc cac gcc acg 1924Leu Ala Ala Ser Leu Glu Glu Val Ala Pro Gly Ala Arg His Ala Thr620 625 630 635ctc agc ctg agt atc ccc cgc gtc gcg ccc gag cac gag ggc cac tat 1972Leu Ser Leu 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750 755 760gcc gtg gaa ggc tcc gag gat aag ggc agc atg gag atc gtg atc ctt 2356Ala Val Glu Gly Ser Glu Asp Lys Gly Ser Met Glu Ile Val Ile Leu765 770 775gtc ggt acc ggc gtc atc gct gtc ttc ttc tgg gtc ctc ctc ctc ctc 2404Val Gly Thr Gly Val Ile Ala Val Phe Phe Trp Val Leu Leu Leu Leu780 785 790 795atc ttc tgt aac atg agg agg ccg gcc cac gca gac atc aag acg ggc 2452Ile Phe Cys Asn Met Arg Arg Pro Ala His Ala Asp Ile Lys Thr Gly800 805 810tac ctg tcc atc atc atg gac ccc ggg gag gtg cct ctg gag gag caa 2500Tyr Leu Ser Ile Ile Met Asp Pro Gly Glu Val Pro Leu Glu Glu Gln815 820 825tgc gaa tac ctg tcc tac gat gcc agc cag tgg gaa ttc ccc cga gag 2548Cys Glu Tyr Leu Ser Tyr Asp Ala Ser Gln Trp Glu Phe Pro Arg Glu830 835 840cgg ctg cac ctg ggg aga gtg ctc ggc tac ggc gcc ttc ggg aag gtg 2596Arg Leu His Leu Gly Arg Val Leu Gly Tyr Gly Ala Phe Gly Lys Val845 850 855gtg gaa gcc tcc gct ttc ggc atc cac aag ggc agc agc tgt gac acc 2644Val Glu Ala Ser Ala Phe Gly Ile His Lys Gly Ser Ser Cys Asp 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Leu His Ile Ala Gln120012051210gct gac gct gag gac agc ccg cca agc ctg cag cgc cac agc ctg gcc 3700Ala Asp Ala Glu Asp Ser Pro Pro Ser Leu Gln Arg His Ser Leu Ala121512201225gcc agg tat tac aac tgg gtg tcc ttt ccc ggg tgc ctg gcc aga ggg 3748Ala Arg Tyr Tyr Asn Trp Val Ser Phe Pro Gly Cys Leu Ala Arg Gly123012351240gct gag acc cgt ggt tcc tcc agg atg aag aca ttt gag gaa ttc ccc 3796Ala Glu Thr Arg Gly Ser Ser Arg Met Lys Thr Phe Glu Glu Phe Pro124512501255atg acc cca acg acc tac aaa ggc tct gtg gac aac cag aca gac agt 3844Met Thr Pro Thr Thr Tyr Lys Gly Ser Val Asp Asn Gln Thr Asp Ser1260126512701275ggg atg gtg ctg gcc tcg gag gag ttt gag cag ata gag agc agg cat 3892Gly Met Val Leu Ala Ser Glu Glu Phe Glu Gln Ile Glu Ser Arg His128012851290aga caa gaa agc ggc ttc agg tagctgaagc agagagagag aaggcagcat 3943Arg Gln Glu Ser Gly Phe Arg1295acgtcagcat tttcttctct gcacttataa gaaagatcaa agactttaag actttcgcta 4003tttcttctac tgctatctac tacaaacttc aaagaggaac caggaggaca agaggagcat 4063gaaagtggac 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50 55 60Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val65 70 75 80Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp Ala Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu85 90 95Leu Leu His Glu Val His Ala Asn Asp Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr100 105 110Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala Arg Ile Glu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Ser115 120 125Tyr Val Phe Val Arg Asp Phe Glu Gln Pro Phe Ile Asn Lys Pro Asp130135 140Thr Leu Leu Val Asn Arg Lys Asp Ala Met Trp Val Pro Cys Leu Val145 150 155 160Ser Ile Pro Gly Leu Asn Val Thr Leu Arg Ser Gln Ser Ser Val Leu165 170 175Trp Pro Asp Gly Gln Glu Val Val Trp Asp Asp Arg Arg Gly Met Leu180 185 190Val Ser Thr Pro Leu Leu His Asp Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr195 200 205Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu Ser Asn Pro Phe Leu Val His Ile210 215 220Thr Gly Asn Glu Leu Tyr Asp Ile Gln Leu Leu Pro Arg Lys Ser Leu225 230 235 240Glu Leu Leu Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Val Trp Ala245 250 255Glu Phe Asn Ser Gly Val Thr Phe Asp Trp Asp Tyr Pro Gly Lys Gln260 265 270Ala Glu Arg Gly Lys Trp Val Pro Glu Arg Arg Ser Gln Gln Thr His275 280 285Thr Glu Leu Ser Ser Ile Leu Thr Ile His Asn Val Ser Gln His Asp290 295 300Leu Gly Ser Tyr Val Cys Lys Ala Asn Asn Gly Ile Gln Arg Phe Arg305 310 315 320Glu Ser Thr Glu Val Ile Val His Glu Asn Pro Phe Ile Ser Val Glu325 330 335Trp Leu Lys Gly Pro Ile Leu Glu Ala Thr Ala Gly Asp Glu Leu Val340 345 350Lys Leu Pro Val Lys Leu Ala Ala Tyr Pro Pro Pro Glu Phe Gln Trp355 360 365Tyr Lys Asp Gly Lys Ala Leu Ser Gly Arg His Ser Pro His Ala Leu370 375 380Val Leu Lys Glu Val Thr Glu Ala Ser Thr Gly Thr Tyr Thr Leu Ala385 390 395 400Leu Trp Asn Ser Ala Ala Gly Leu Arg Arg Asn Ile Ser Leu Glu Leu405 410 415Val Val Asn Val Pro Pro Gln Ile His Glu Lys Glu Ala Ser Ser Pro420 425 430Ser Ile Tyr Ser Arg His Ser Arg Gln Ala Leu Thr Cys Thr Ala Tyr435 440 445Gly Val Pro Leu Pro Leu Ser Ile Gln Trp His Trp Arg Pro Trp Thr450 455 460Pro Cys Lys Met Phe Ala Gln Arg Ser Leu Arg Arg Arg Gln Gln Gln465 470 475 480Asp Leu Met Pro Gln Cys Arg Asp Trp Arg Ala Val 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Lys Asp Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly106010651070Ser Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp1075 10801085Lys Val Tyr Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu10901095 1100Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro Tyr Pro Gly Val Gln Ile1105111011151120Asn Glu Glu Phe Cys Gln Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Met Arg Ala112511301135Pro Glu Leu Ala Thr Pro Ala Ile Arg Arg Ile Met Leu Asn Cys Trp114011451150Ser Gly Asp Pro Lys Ala Arg Pro Ala Phe Ser Glu Leu Val Glu Ile1155 11601165Leu Gly Asp Leu Leu Gln Gly Arg Gly Leu Gln Glu Glu Glu Glu Val117011751180Cys Met Ala Pro Arg Ser Ser Gln Ser Ser Glu Glu Gly Ser Phe Ser1185119011951200Gln Val Ser Thr Met Ala Leu His Ile Ala Gln Ala Asp Ala Glu Asp120512101215Ser Pro Pro Ser Leu Gln Arg His Ser Leu Ala Ala Arg Tyr Tyr Asn122012251230Trp Val Ser Phe Pro Gly Cys Leu Ala Arg Gly Ala Glu Thr Arg Gly123512401245Ser Ser Arg Met Lys Thr Phe Glu Glu Phe Pro Met Thr Pro Thr Thr12501255 1260Tyr Lys Gly Ser Val Asp Asn Gln Thr Asp Ser Gly Met Val Leu Ala12651270 12751280Ser Glu Glu Phe Glu Gln Ile Glu Ser Arg His Arg Gln Glu Ser Gly128512901295Phe Ser Cys Lys Gly Pro Gly Gln Asn Val Ala Val Thr Arg Ala His130013051310Pro Asp Ser Gln Gly Arg Arg Arg Arg Pro Glu Arg Gly Ala Arg Gly131513201325Gly Gln Val Phe Tyr ASn Ser Glu Tyr Gly Glu Leu Ser Glu Pro Ser133013351340Glu Glu Asp His Cys Ser Pro Ser Ala Arg Val Thr Phe Phe Thr Asp1345 135013551360Asn Ser Tyr<210>5<211>1311<212>PRT<213>人(FLT1)<400>5Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser1 5 10 15Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro20 25 30Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr35 40 45Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro50 55 60Glu Asn Asn Asn Asn Asn Asn Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu65 70 75 80Ser Ile Thr Lys Ser Ala Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser85 90 95Thr Leu Thr Leu Asn Thr Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser100 105 110Cys Lys Tyr Leu Ala Val 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Glu Glu Asp Glu Gly Val Tyr His Cys755 760 765Lys Ala Thr Asn Gln Lys Gly Ser Val Glu Ser Ser Ala Tyr Leu Thr770 775 780Val Gln Gly Thr Ser Asp Lys Ser Asn Leu Glu Leu Ile Thr Leu Thr785 790 795 800Cys Thr Cys Val Ala Ala Thr Leu Phe Trp Leu Leu Leu Thr Leu Leu805 810 815Ile Arg Lys Met Lys Arg Ser Ser Asn Ser Glu Ile Lys Thr Asp Tyr820 825 830Leu Set Ile Ile Met Asp Pro Asp Glu Val Pro Leu Asp Glu Gln Cys835 840 845Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Ala Arg Glu Arg850 855 860Leu Lys Leu Gly Lys Ser Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Lys Val Val865 870 875 880Gln Ala Ser Ala Phe Gly Ile Lys Lys Ser Pro Thr Cys Arg Thr Val885 890 895Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu Tyr Lys Ala900 905 910Leu Met Thr Glu Leu Lys Ile Leu Thr His Ile Gly His His Leu Asn915 920 925Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Gln Gly Gly Pro Leu Met930 935 940Val Ile Val Glu Tyr Cys Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Tyr Leu Lys945 950 955 960Ser Lys Arg Asp Leu Phe Phe Leu Asn Lys Asp Ala Ala 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60gactcctgga70<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>8acatgcatgc cccgccggtc atcc24<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>9cggaattccc catgacccca ac22<210>10<211>33<212>DNA<213>2人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>10ccatcgatgg atcctacctg aagccgcttt ctt33<210>11<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>11cccaagcttg gatccaagtg gctactccat gacc 34<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>12gttgcctgtg atgtgcacca 20<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>13ctggagtcga cttggcggac t 21<210>14<21l>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>14cgcggatccc tagtgatggt gatggtgatg tctaccttcg atcatgctgc ccttatcctc 60<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>15ctggagtcga cttggcggac t 21<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>16cgggatccct ccatgctgcc cttatcct28<210>17<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>17ggcaagcttg aattcgccac catgcagcgg ggcgcc 36<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>18gttgcctgtg atgtgcacca 20<210>19<211>2l<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>19ctggagtcga cttggcggac t 21<210>20<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>20cgcggatcca agcttactta ccttccatgc tgcccttatc ctcg 44<210>21<211>419<212>PRT<213>人<400>21Met His Leu Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala1 5 10 15Ala Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe20 25 30Glu Ser Gly Leu Asp Leu Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala Gly Glu Ala35 40 45Thr Ala Tyr Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ser Val Ser50 55 60Ser Val Asp Glu Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met65 70 75 80Tyr Lys Cys Gln Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln85 90 95Ala Asn Leu Asn Ser Arg Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala100 105 110His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys
115 120 125Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe130 135 140Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr145 150 155 160Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr165 170 175Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu180 185 190Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser195 200 205Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile210 215 220Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn225 230 235 240Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His lie Cys Arg Cys245 250 255Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser260 265 270Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu275 280 285Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys290 295 300Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys305 310 315 320Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu325 330 335Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro340 345 350Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys355 360 365Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr370 375 380Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro G1y Phe Ser385 390 395 400Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro
405 410415Gln Met Ser<210>22<211>354<212>PRT<213>人<400>22Met Tyr Arg Glu Trp Val Val Val Asn Val Phe Met Met Leu Tyr Val1 5 10 15Gln Leu Val Gln Gly Ser Ser Asn Glu His Gly Pro Val Lys Arg Ser20 25 30Ser Gln Ser Thr Leu Glu Arg Ser Glu Gln Gln Ile Arg Ala Ala Ser35 40 45Ser Leu Glu Glu Leu Leu Arg Ile Thr His Ser Glu Asp Trp Lys Leu50 55 60Trp Arg Cys Arg Leu Arg Leu Lys Ser Phe Thr Ser Met Asp Ser Arg65 70 75 80Ser Ala Ser His Arg Ser Thr Arg Phe Ala Ala Thr Phe Tyr Asp Ile85 90 95Glu Thr Leu Lys Val Ile Asp Glu Glu Trp Gln Arg Thr Gln Cys Ser100 105 110Pro Arg Glu Thr Cys Val Glu Val Ala Ser Glu Leu Gly Lys Ser Thr115 120 125Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Asn Val Phe Arg Cys Gly Gly130 135 140Cys Cys Asn Glu Glu Ser Leu Ile Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr145 150 155 160Ile Ser Lys Gln Leu Phe Glu Ile Ser Val Pro Leu Thr Ser Val Pro165 170 175Glu Leu Val Pro Val Lys Val Ala Asn His Thr Gly Cys Lys Cys Leu180 185 190Pro Thr Ala Pro Arg His Pro Tyr Ser Ile Ile Arg Arg Ser Ile Gln195 200 205Ile Pro Glu Glu Asp Arg Cys Ser His Ser Lys Lys Leu Cys Pro Ile210 215 220Asp Met Leu Trp Asp Ser Asn Lys Cys Lys Cys Val Leu Gln Glu Glu225 230 235 240Asn Pro Leu Ala Gly Thr Glu Asp His Ser His Leu Gln Glu Pro Ala245 250 255Leu Cys Gly Pro His Met Met Phe Asp Glu Asp Arg Cys Glu Cys Val260 265 270Cys Lys Thr Pro Cys Pro Lys Asp Leu Ile Gln His Pro Lys Asn Cys275 280 285Ser Cys Phe Glu Cys Lys Glu Ser Leu Glu Thr Cys Cys Gln Lys His290 295 300Lys Leu Phe His Pro Asp Thr Cys Ser Cys Glu Asp Arg Cys Pro Phe305 310 315 320His Thr Arg Pro Cys Ala Ser Gly Lys Thr Ala Cys Ala Lys His Cys325 330 335Arg Phe Pro Lys Glu Lys Arg Ala Ala Gln Gly Pro His Ser Arg Lys340 345 350Asn Pro
權(quán)利要求
1.一種治療哺乳動(dòng)物惡性腫瘤患者的方法，所述惡性腫瘤特征為，其鄰近區(qū)血管的內(nèi)皮細(xì)胞中有Flt4受體酪氨酸激酶(Flt4)的表達(dá)，所述方法包括如下步驟給需要此治療的哺乳動(dòng)物施用一種組合物，該組合物包括一種化合物，該化合物可有效抑制Flt4配體蛋白與所述生物之內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的Flt4結(jié)合，從而抑制Flt4介導(dǎo)的所述血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的治療哺乳動(dòng)物惡性腫瘤患者的方法，所述惡性腫瘤特征為，其鄰近區(qū)血管的內(nèi)皮細(xì)胞中有Flt4受體酪氨酸激酶(Flt4)的表達(dá)，所述方法包括如下步驟(a)檢查哺乳動(dòng)物，確定該生物的惡性腫瘤附近血管中是否存在表達(dá)Flt4的內(nèi)皮細(xì)胞；(b)選擇經(jīng)上述檢查步驟被確定為患有惡性腫瘤的生物，所述惡性腫瘤特征為，其鄰近區(qū)血管的內(nèi)皮細(xì)胞中存在表達(dá)Flt4的內(nèi)皮細(xì)胞；和(c)給所選生物施用一種組合物，該組合物包括一種化合物，該化合物可有效抑制Flt4配體蛋白與所述生物之內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的Flt4結(jié)合，從而抑制Flt4介導(dǎo)的所述血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述惡性腫瘤選自癌、鱗狀細(xì)胞癌、淋巴瘤、黑色素瘤和肉瘤。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述惡性腫瘤是以在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)Flt4為特點(diǎn)的乳腺癌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物是人。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物包含選自下組的多肽(a)含抗Flt4抗體之抗原結(jié)合片段的多肽；(b)含可溶性Flt4片段的多肽，其中所述片段和所述多肽能夠與Flt4配體結(jié)合；(c)一種多肽，其含有脊椎動(dòng)物血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)前體多肽的片段或類似物，其中所述多肽和所述片段或類似物能結(jié)合但不能激活宿主固有細(xì)胞上表達(dá)的Flt4；和(d)一種多肽，其含有脊椎動(dòng)物血管內(nèi)皮生長因子D(VEGF-D)前體多肽的片段或類似物，其中所述多肽和所述片段或類似物能結(jié)合但不能激活宿主固有細(xì)胞上表達(dá)的Flt4。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述化合物包括含抗Flt4抗體之抗原結(jié)合片段的多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物包括雙特異性抗體或其片段，其中所述抗體或片段包含特異性結(jié)合Flt4的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和特異性結(jié)合血管內(nèi)皮標(biāo)記抗原的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述血管內(nèi)皮標(biāo)記抗原實(shí)質(zhì)上不出現(xiàn)在淋巴管內(nèi)皮中。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述血管內(nèi)皮標(biāo)記抗原選自PAL-E、VEGFR-1和VEGFR-2。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物包含抗Flt4抗體或其抗原結(jié)合片段。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗Flt4抗體為人源化抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求6-11中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物還包括與所述雙特異性抗體偶聯(lián)的抗腫瘤藥物。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物還包括一種可檢測標(biāo)記。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物還包括可藥用的稀釋劑、佐劑或載體介質(zhì)。
15.一種使脊椎動(dòng)物組織中腫瘤顯像的方法，包括如下步驟(a)使疑有腫瘤的脊椎動(dòng)物組織與包含F(xiàn)lt4結(jié)合化合物的組合物接觸；(b)檢測與所述組織中細(xì)胞結(jié)合的Flt4結(jié)合化合物；并且(c)通過鑒定與所述Flt4結(jié)合化合物結(jié)合的血管內(nèi)皮細(xì)胞使實(shí)體瘤顯像，其中表達(dá)Flt4的血管與該組織中腫瘤的存在和部位相關(guān)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述組織包括人的組織。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的方法，在所述接觸步驟之后及所述顯像步驟之前還包括洗滌所述組織的步驟，其中洗滌條件應(yīng)使未與所述組織中Flt4結(jié)合的Flt4結(jié)合化合物從所述組織中除去。
18.根據(jù)權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)的方法，其中所述Flt4結(jié)合化合物包括選自下組的多肽(a)含抗Flt4抗體之抗原結(jié)合片段的多肽；(b)一種多肽，其含有脊椎動(dòng)物血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)前體多肽的片段或類似物，其中所述多肽和所述片段或類似物能結(jié)合細(xì)胞上表達(dá)的Flt4；(c)一種多肽，其含有脊椎動(dòng)物血管內(nèi)皮生長因子G(VEGF-G)前體多肽的片段或類似物，其中所述多肽和所述片段或類似物能結(jié)合細(xì)胞上表達(dá)的Flt4；
19.根據(jù)權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物包括含抗Flt4抗體之抗原結(jié)合片段的多肽。
20.根據(jù)權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)的方法，其中所述Flt4結(jié)合化合物包括抗Flt4抗體或其抗原結(jié)合片段。
21.根據(jù)權(quán)利要求15-21中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗Flt4抗體是人源化抗體。
22.根據(jù)權(quán)利要求15-21中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物還包括與其共價(jià)結(jié)合的可檢測標(biāo)記。
23.根據(jù)權(quán)利要求15-22中任一項(xiàng)的方法，還包括下述步驟使所述組織與第二種特異性結(jié)合血管內(nèi)皮標(biāo)記物的化合物接觸，所述標(biāo)記物在淋巴管內(nèi)皮中實(shí)質(zhì)上不存在；檢測與所述組織中的細(xì)胞結(jié)合的所述第二種化合物；其中所述顯像步驟包括鑒定用所述Flt4結(jié)合化合物和所述第二種化合物標(biāo)記的血管，其中用所述Flt4結(jié)合化合物和所述第二種化合物標(biāo)記的血管與組織中腫瘤的存在和位置相關(guān)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述血管內(nèi)皮標(biāo)記物選自PAL-E、VEGFR-1和VEGFR-2。
25.根據(jù)權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)的方法，其中所述Flt4結(jié)合化合物包括雙特異性抗體或其片段，其中所述抗體或片段包括特異性結(jié)合Flt4的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和特異性結(jié)合淋巴管內(nèi)皮中實(shí)質(zhì)上不存在的血管內(nèi)皮標(biāo)記物的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
26.一種疾病檢查方法，所述疾病以新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的變化為特點(diǎn)，所述方法包括如下步驟(a)獲得脊椎動(dòng)物可疑患者的組織樣品，所述可疑患者被懷疑患有以新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的變化為特點(diǎn)的疾?。?b)將所述組織樣品暴露于一種組合物，該組合物包括特異性結(jié)合所述生物細(xì)胞表達(dá)的Flt4受體酪氨酸激酶(Flt4)的化合物；(c)洗滌所述組織樣品；和(d)通過檢測所述化合物在所述組織樣品中的存在、量或分布來檢查所述疾病，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞中的Flt4表達(dá)被鑒定為以新生血管內(nèi)皮細(xì)胞之變化為特點(diǎn)的疾病的標(biāo)記物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其還包括使所述組織樣品暴露于第二種化合物，該化合物可特異性結(jié)合一種血管內(nèi)皮標(biāo)記物，其中所述檢查步驟包括對結(jié)合Flt4的化合物和結(jié)合新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的第二種化合物進(jìn)行檢測，以測定能同時(shí)表達(dá)Flt4和血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的內(nèi)皮細(xì)胞的存在、量或分布。
28.一種檢測哺乳動(dòng)物中新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法，包括如下步驟(a)給所述哺乳動(dòng)物施用一種組合物，該組合物包括特異性結(jié)合哺乳動(dòng)物Flt4受體酪氨酸激酶(Flt4)的第一種化合物，和(b)檢測結(jié)合于新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的所述第一種化合物，從而檢測所述生物中新生血管內(nèi)皮細(xì)胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，還包括給所述哺乳動(dòng)物施用第二種化合物，該化合物可與一種血管內(nèi)皮標(biāo)記物特異性結(jié)合；且其中所述檢測步驟包括檢測結(jié)合于新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的所述第一和第二種化合物。
30.結(jié)合Flt4受體酪氨酸激酶之化合物在藥物制備中的應(yīng)用，所述藥物用于診斷性檢查、顯像或治療以鄰近區(qū)血管表達(dá)Flt4為特點(diǎn)的惡性腫瘤。
31.權(quán)利要求30的應(yīng)用，其中所述化合物選自(a)含抗Flt4抗體之抗原結(jié)合片段的多肽；(b)含可溶性Flt4片段的多肽，其中所述片段和所述多肽能夠與Flt4配體結(jié)合(c)一種多肽，其含有脊椎動(dòng)物血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)前體多肽的片段或類似物，其中所述多肽和所述片段或類似物能結(jié)合但不能激活宿主固有細(xì)胞上表達(dá)的Flt4；和(d)一種多肽，其含有脊椎動(dòng)物血管內(nèi)皮生長因子D(VEGF-D)前體多肽的片段或類似物，其中所述多肽和所述片段或類似物能結(jié)合但不能激活宿主固有細(xì)胞上表達(dá)的Flt4。
32.權(quán)利要求30的應(yīng)用，其中所述化合物包括抗Flt4抗體或其抗原結(jié)合片段。
33.權(quán)利要求30的應(yīng)用，其中所述化合物包括雙特異性抗體或其片段，其中所述抗體或片段包括特異性結(jié)合Flt4的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，還包括特異性結(jié)合在淋巴管中實(shí)質(zhì)上不存在的血管內(nèi)皮標(biāo)記抗原的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
34.根據(jù)權(quán)利要求32和33的應(yīng)用，其中所述抗體為人源化抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供純化的Flt4受體酪氨酸激酶多肽及其片段,編碼這類多肽的多核苷酸,與這類多肽特異性結(jié)合的抗體,以及它們的用途。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1329504SQ99814285
公開日2002年1月2日 申請日期1999年10月8日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月9日
發(fā)明者卡里·阿利塔洛, 阿加·凱佩南, 雷加·瓦爾托拉, 洛塔·賈西拉 申請人:路德維格癌癥研究院, 利森蒂亞有限公司