專利名稱：重組α－L－艾杜糖苷酸酶,其生產(chǎn)和純化的方法以及治療其缺乏導(dǎo)致的疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、酶學(xué)、生物化學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體的，本發(fā)明提供了一種重組α-L-艾杜糖苷酸酶(α-L-iduronidase)、生產(chǎn)和純化該酶的方法以及治療包含α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏和粘多糖代謝病I(MPS I)的一些遺傳病的方法。
背景技術(shù)：
糖類在活有機(jī)體的活動(dòng)中起了許多重要作用。除了它們的新陳代謝作用，糖類是人體內(nèi)與其它許多成分，如蛋白質(zhì)和脂(稱為糖綴合物)共價(jià)結(jié)合的結(jié)構(gòu)組分。例如，人結(jié)締組織和細(xì)胞膜包含蛋白質(zhì)、糖類和蛋白聚糖基質(zhì)。該蛋白聚糖基質(zhì)的糖部分，對(duì)機(jī)體結(jié)構(gòu)提供了重要的性質(zhì)。
切開(kāi)糖的溶酶體酶α-L-艾杜糖苷酸酶的遺傳缺陷導(dǎo)致稱為粘多糖代謝病I(MPS I)的溶酶體積儲(chǔ)異常(Neufeld,E.F.,和Muenzer,J.(1989).“遺傳病代謝基礎(chǔ)”中的粘多糖代謝病(Scriver,C.R.,Beaudet,A.L.,Sly,W.S.和Valle,D.,編輯)，pp.1565-1587,McGraw-Hill,New York)。MPS I的嚴(yán)重形式常稱為Hurler綜合征，而且和多種問(wèn)題，如精神發(fā)育遲緩、角膜模糊、粗糙面部特征、心臟病、呼吸系統(tǒng)病、肝和脾腫大、疝和關(guān)節(jié)強(qiáng)直等相關(guān)?；糎urler綜合征的病人常在10歲前就死亡。中度形式稱為Hurler-Scheie綜合征，常不嚴(yán)重影響精神功能，但疾病可導(dǎo)致在10多歲和20多歲的死亡。Scheie綜合征是MPS I的最輕形式。它可以具有正常壽命，但關(guān)節(jié)強(qiáng)直、角膜模糊和心臟瓣膜病導(dǎo)致嚴(yán)重問(wèn)題。
根據(jù)British Columbia調(diào)查，估計(jì)MPS I的發(fā)病率是全部新生兒中1100，000(Lowry等，人類遺傳學(xué)85389-390(1990))，根據(jù)愛(ài)爾蘭的研究，為170,000(Nelson，人類遺傳學(xué)101355-358(1990))?？磥?lái)對(duì)該疾病沒(méi)有人種差異。似乎全世界該疾病都被過(guò)低診斷，不是因?yàn)椴∪嗽谠\斷作出之前就由于并發(fā)癥死亡，就是因?yàn)樵摼C合征的較輕形式可被誤診為關(guān)節(jié)炎完全忽略。有效的MPS I新生兒普查可以發(fā)現(xiàn)一些以前未發(fā)現(xiàn)的病人。
除了骨髓移植，沒(méi)有對(duì)MPS I的有意義治療。骨髓移植在治療一些該疾病的癥狀中可能有效，但對(duì)MPS I具有高度致病率和死亡率，而且由于缺少合適的捐贈(zèng)者，通常是不可行的。對(duì)所有病人可行的另一種治療將對(duì)治療和處理該疾病提供重要突破。
發(fā)現(xiàn)α-L-艾杜糖苷酸酶能糾正培養(yǎng)Hurler細(xì)胞的酶缺乏之后，已長(zhǎng)期考慮將酶替換治療作為MPS I的可能治療手段。在該糾正過(guò)程中，通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用，將含有甘露糖-6-磷酸殘基的酶吸收入細(xì)胞，并傳遞到溶酶體，在其中酶清除貯存的底物、硫酸乙酰肝素和硫酸皮膚素。由于組織中α-L-艾杜糖苷酸酶的來(lái)源不足，該治療對(duì)人的應(yīng)用以前并不可行。酶置換概念首次有效的以修飾的胎盤(pán)葡糖腦苷脂酶用于Gaucher病人。Gaucher病人中葡糖腦苷脂酶的傳遞和有效攝入證明了酶能以足量吸收入體內(nèi)，來(lái)提供有效治療。
對(duì)于MPS I的α-L-艾杜糖苷酸酶治療，需要一種酶的重組來(lái)源來(lái)獲得治療上充分?jǐn)?shù)量的酶供應(yīng)。該哺乳動(dòng)物酶在1990年被克隆(Stoltzfus等，生物化學(xué)雜志2676570-6575(1992))，而該人酶在1991年被克隆(Moskowitz等，F(xiàn)ASEB J6A77(1992))。
附圖簡(jiǎn)述

圖1代表了編碼α-L-艾杜糖苷酸酶的cDNA的核苷酸和推斷的氨基酸序列。提供了核苷酸1到6200。提供了從開(kāi)放閱讀框中的第一個(gè)甲硫氨酸開(kāi)始的氨基酸。
圖2代表根據(jù)實(shí)施例1中列出的程序獲得的洗脫液SDS-PAGE的結(jié)果。泳道1是空白。泳道2含有高分子量標(biāo)準(zhǔn)品。泳道3是空白。泳道4含有濃度為50微克的牛血清白蛋白。泳道5到10代表分別含有1微克、2微克、5微克、5微克、5微克和5微克量重組產(chǎn)生的人α-L-艾杜糖苷酸酶的洗脫液。
圖3揭示了16個(gè)MPS I病人中相對(duì)于正常排泄值的尿GAG水平。在未治療的MPS I病人中，尿GAG水平范圍很廣。用重組α-L-艾杜糖苷酸酶治療后，未降解GAG排泄減少了50％以上是衡量人體對(duì)治療有反應(yīng)的有效手段。
圖4顯示了MPS I病人酶治療前后的白細(xì)胞艾杜糖苷酸酶活性。
圖5顯示了酶治療前后口腔艾杜糖苷酸酶活性。
圖6顯示了僅用重組酶治療8周后，三個(gè)病人中肝臟和脾臟的充分縮小以及關(guān)節(jié)和軟組織積儲(chǔ)的顯著臨床改善與未降解GAG減少65％以上有關(guān)。
圖7顯示了僅治療12周后，在用重組酶治療的病人中，肝臟和脾臟基本正?；?br> 圖8顯示了6個(gè)病人用重組酶治療22周后，尿GAG排泄的急劇下降。
發(fā)明簡(jiǎn)述一方面，本發(fā)明的特征是產(chǎn)生其量能治療性使用的α-L-艾杜糖苷酸酶的方法。在一個(gè)主要實(shí)施例中，該方法包含將編碼全部或部分α-L-艾杜糖苷酸酶的cDNA轉(zhuǎn)染入適合表達(dá)它的細(xì)胞的步驟。在一些實(shí)施例中，使用了編碼完整α-L-艾杜糖苷酸酶，優(yōu)選人α-L-艾杜糖苷酸酶的cDNA。然而，在其它實(shí)施例中，可用編碼其生物活性片段或突變體的cDNA。特別是，可產(chǎn)生一或多種氨基酸取代，仍保持或增強(qiáng)酶的生物活性。在其它優(yōu)選例中，用表達(dá)載體來(lái)將cDNA轉(zhuǎn)移入用于其表達(dá)的合適細(xì)胞或細(xì)胞系。在一個(gè)具體優(yōu)選例中，將cDNA轉(zhuǎn)移入中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞來(lái)建立細(xì)胞系2.131。在其它優(yōu)選例中，該產(chǎn)生程序具有一或多個(gè)下列顯示特別高的產(chǎn)生水平的特征(a)產(chǎn)生過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基的pH可以低至約6.5到7.0，優(yōu)選約6.7-6.8，(b)約每12小時(shí)可換大約2/3到3/4培養(yǎng)基，(c)用間斷純氧噴霧，氧飽和量最適約80％，(d)最初可用含約10％血清的微載體來(lái)產(chǎn)生細(xì)胞塊，然后用快速?zèng)_洗轉(zhuǎn)移到用于生產(chǎn)的無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)液中，(e)含有補(bǔ)充量的一種或多種成分，選自谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、核糖核苷和脫氧核糖核苷的無(wú)蛋白質(zhì)或低蛋白質(zhì)培養(yǎng)基，如JRH Biosciences PF-CHO產(chǎn)品是最適的，(f)在多次分批加料過(guò)程，而不在標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)定灌流過(guò)程中，可用灌流棒如Bellco灌流棒，和(g)可用溫和的丁酸鈉誘導(dǎo)過(guò)程來(lái)誘導(dǎo)α-L-艾杜糖苷酸酶表達(dá)增加。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，其具有能產(chǎn)生其量能治療性使用的α-L-艾杜糖苷酸酶的特征。在優(yōu)選例中，本發(fā)明的特征是一種穩(wěn)定和可靠產(chǎn)生能治療性使用的α-L-艾杜糖苷酸酶量的重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系如2.131細(xì)胞系。在一些優(yōu)選例中，細(xì)胞系可含有表達(dá)構(gòu)建物的至少約10個(gè)拷貝。在更多優(yōu)選例中，細(xì)胞系表達(dá)其量為每107細(xì)胞每天至少約20-40微克的重組α-L-艾杜糖苷酸酶。
在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了適合產(chǎn)生其量能治療性使用的α-L-艾杜糖苷酸酶的新穎載體。在優(yōu)選例中，本發(fā)明的特征是包含巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件、由鼠Ca內(nèi)含子構(gòu)成的5′內(nèi)含子、編碼α-L-艾杜糖苷酸酶的全部或片段或突變體的cDNA、和3′牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化位點(diǎn)的表達(dá)載體。另外，優(yōu)選編碼α-L-艾杜糖苷酸酶的全部或片段或突變體的cDNA長(zhǎng)約2.2kb。該表達(dá)載體可與任何合適的常用選擇載體如pSV2NEO一起，以例如50比1的比率轉(zhuǎn)染，來(lái)增強(qiáng)多拷貝插入。另外，可用基因擴(kuò)增來(lái)誘導(dǎo)多拷貝插入。
在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的新穎α-L-艾杜糖苷酸酶，而且其量能治療性使用該酶。根據(jù)本發(fā)明，α-L-艾杜糖苷酸酶的比活力每毫克蛋白質(zhì)大于200,000單位。優(yōu)選的，超過(guò)每毫克蛋白質(zhì)約240,000單位。本發(fā)明的α-L-艾杜糖苷酸酶的分子量約為82,000道爾頓，約70,000道爾頓是氨基酸而約12,000道爾頓是糖類。
在第五個(gè)方面，本發(fā)明的特征是純化α-L-艾杜糖苷酸酶的新穎方法。根據(jù)第一個(gè)實(shí)施例，可以使細(xì)胞塊在含有約10％血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，然后轉(zhuǎn)到改良的無(wú)蛋白質(zhì)生產(chǎn)培養(yǎng)基上，不經(jīng)任何顯著適應(yīng)來(lái)產(chǎn)生用于純化的高比活力初始材料。優(yōu)選的，使用濃縮/滲濾流程，它能除去重組生產(chǎn)該酶所需的外源材料，例如，Pluronics F-68，一種常用的保護(hù)細(xì)胞不受噴霧損傷的表面活性劑。通常應(yīng)將這些外源材料從大量粗物質(zhì)中分離出來(lái)，來(lái)防止弄臟柱。在另一個(gè)優(yōu)選例中，酸化第一柱上樣液來(lái)使無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基配制物中發(fā)現(xiàn)的糖醛酸的競(jìng)爭(zhēng)性抑制效果變得最小。也是優(yōu)選的，用肝素、苯基和分子排阻柱純化流程，使用可自動(dòng)化步驟和可驗(yàn)證的培養(yǎng)基來(lái)生產(chǎn)純酶。在另一個(gè)優(yōu)選例中，用肝素和苯基柱步驟來(lái)除去較不希望有的帶切口的或降解的α-L-艾杜糖苷酸酶。在另一個(gè)優(yōu)選例中，用酸性pH處理步驟來(lái)滅活可能的病毒而不傷害酶。
在第六個(gè)方面，本發(fā)明的特征是一種治療完全或部分由α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏引起的疾病的新穎方法。在一個(gè)實(shí)施例中，本方法的特征是單用重組α-L-艾杜糖苷酸酶或其生物活性片段或突變體或聯(lián)用藥物學(xué)上可接受的載體。在其它實(shí)施例中，該方法的特征是將編碼全部或部分α-L-艾杜糖苷酸酶的核酸轉(zhuǎn)移到體內(nèi)一個(gè)或多個(gè)宿主細(xì)胞中。優(yōu)選例包括按要治療的生物體(優(yōu)選哺乳動(dòng)物或人)的需要優(yōu)化劑量，來(lái)改善疾病癥狀。在優(yōu)選例中，疾病是粘多糖代謝病I(MPS I),Hurler綜合征，Hurler-Scheie綜合征或Scheie綜合征。
在第七個(gè)方面，本發(fā)明的特征是用于治療全部或部分由α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏引起的疾病的包含α-L-艾杜糖苷酸酶的新穎藥物組合物。這些組合物可以是適合于多種途徑施用的，如胃腸外、外用、鼻內(nèi)、吸入或口服施用的。在該范圍內(nèi)，實(shí)施例的特征是編碼全部或部分α-L-艾杜糖苷酸酶的核酸序列，它可以在體內(nèi)施用進(jìn)入受α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏影響的細(xì)胞中。
發(fā)明詳述在一個(gè)方面，本發(fā)明的特征是產(chǎn)生其量能治療性使用該酶的α-L-艾杜糖苷酸酶的方法?？偟膩?lái)說(shuō)，本方法的特征是用編碼全部α-L-艾杜糖苷酸酶或其生物活性片段或突變體的cDNA轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞系。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員可制備除了本文明白描述的，用于在用其轉(zhuǎn)染的合適細(xì)胞系中最理想產(chǎn)生α-L-艾杜糖苷酸酶的那些以外的表達(dá)構(gòu)建物。另外，熟練技術(shù)人員可容易的設(shè)計(jì)編碼天然存在的α-L-艾杜糖苷酸酶的生物活性片段和突變體(它們具有和天然存在的全長(zhǎng)酶相同或相似的生物活性)的cDNA片段。
要建立α-L-艾杜糖苷酸酶的重組來(lái)源，可構(gòu)建一大系列的表達(dá)載體，并試驗(yàn)其α-L-艾杜糖苷酸酶cDNA的表達(dá)。根據(jù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可識(shí)別提供特別高水平表達(dá)的表達(dá)構(gòu)建物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)轉(zhuǎn)染α-L-艾杜糖苷酸酶表達(dá)構(gòu)建物并選擇提供特別高水平表達(dá)的高表達(dá)克隆，開(kāi)發(fā)了一種中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞系2.131。根據(jù)本發(fā)明的該實(shí)施例，這樣的中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞系可比正常細(xì)胞系分泌多大約5,000到7,000倍的α-L-艾杜糖苷酸酶。因此，可正確加工如此產(chǎn)生的α-L-艾杜糖苷酸酶，將其吸收入具有高親和力的細(xì)胞并糾正患Hurler綜合征病人的α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏細(xì)胞。
用于產(chǎn)生其量能治療性使用的α-L-艾杜糖苷酸酶的方法的特征是為大量產(chǎn)生該酶特別設(shè)計(jì)的產(chǎn)生過(guò)程。根據(jù)該過(guò)程的優(yōu)選例，用微載體作為生長(zhǎng)貼壁細(xì)胞的花費(fèi)低廉的規(guī)模可放大的表面。
根據(jù)本發(fā)明，用于產(chǎn)生α-L-艾杜糖苷酸酶的方法的其它優(yōu)選例，優(yōu)化了一種培養(yǎng)系統(tǒng)。在第一個(gè)實(shí)施例中，在產(chǎn)生過(guò)程中降低培養(yǎng)基pH到大約6.5到7.0，優(yōu)選約6.7-6.8。這樣的pH的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能增強(qiáng)在酸性pH下更穩(wěn)定的溶酶體酶的聚集。在第二個(gè)實(shí)施例中，每12個(gè)小時(shí)換大約2/3到3/4的培養(yǎng)液。該程序的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是增強(qiáng)重組α-L-艾杜糖苷酸酶的分泌率并收獲更多的活性酶。在第三個(gè)實(shí)施例中，用間歇純氧噴霧代替連續(xù)噴霧，將氧飽和度優(yōu)化到大約80％。在第四個(gè)實(shí)施例中，用最初含大約10％血清的cytodex 2微載體來(lái)產(chǎn)生大量細(xì)胞，然后用快速?zèng)_洗轉(zhuǎn)移到用于生產(chǎn)的無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基上。在第五個(gè)實(shí)施例中，可將如JRH Biosciences PF-CHO產(chǎn)品的生長(zhǎng)培養(yǎng)基優(yōu)化成包括補(bǔ)充量的一種或多種選自谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、核糖核苷和脫氧核糖核苷的成分。在第六個(gè)實(shí)施例中，在多次分批加料過(guò)程，而不在標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)定灌流過(guò)程中，可用灌流棒如Bellco灌流棒。在第七個(gè)實(shí)施例中，可用溫和的丁酸鈉誘導(dǎo)過(guò)程來(lái)誘導(dǎo)α-L-艾杜糖苷酸酶表達(dá)增加，而基本不影響糖類加工和酶的細(xì)胞攝入。這種誘導(dǎo)過(guò)程可在生產(chǎn)中提供兩倍的增加，而不顯著改變翻譯后加工。
根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生α-L-艾杜糖苷酸酶的方法的具體優(yōu)選例的特征是，本文描述的一種或多種或全部最佳化條件。因此本發(fā)明的生產(chǎn)方法提供了具有下列特征的生產(chǎn)培養(yǎng)過(guò)程1．優(yōu)選在大量培養(yǎng)瓶中用頂部棒(Bellco灌流棒或其等價(jià)物)攪拌，用基于微載體的培養(yǎng)(用Cytodex 2珠或其等價(jià)物)?？赏ㄟ^(guò)在DME/F12 1:1培養(yǎng)基(用包括核糖核苷、脫氧核糖核苷、丙酮酸、非必需氨基酸和HEPES的成分改良)中的10％胎牛血清在大約6.7-6.9的pH中培養(yǎng)達(dá)到這些珠的貼壁。在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)3日后，開(kāi)始沖洗過(guò)程，其中約每12小時(shí)用無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基替換大約2/3培養(yǎng)基，總共進(jìn)行大約3-4次沖洗。然后在整個(gè)剩余培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，將細(xì)胞在無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
2．優(yōu)選將培養(yǎng)條件保持在80％空氣飽和度的溶解氧，pH大約6.7，溫度大約37℃。這可用控制塔、運(yùn)轉(zhuǎn)單元和如Wheaton生產(chǎn)的合適探針來(lái)達(dá)到。然而，熟練技術(shù)人員可輕易理解這能方便的由其它廠商的相當(dāng)?shù)目刂葡到y(tǒng)來(lái)達(dá)到。與40％和60％空氣飽和度相比，大約80％的空氣飽和度導(dǎo)致α-L-艾杜糖苷酸酶分泌的提高。然而，90％空氣飽和度與80％空氣飽和度相比不提供分泌的顯著增加?？赏ㄟ^(guò)間歇純氧噴霧，用5微米不銹鋼噴霧器或其等價(jià)物提供溶解氧。大約6.7的pH對(duì)α-L-艾杜糖苷酸酶的積聚是最佳的。酶在大約7.0以上的pH特別不穩(wěn)定。在大約6.7的pH以下，分泌率會(huì)降低，特別是低于大約6.5的pH。因此在大約6.6到6.8的pH之間保持了最佳培養(yǎng)。
3．生產(chǎn)培養(yǎng)基可以是JRH Biosciences稱為Excell PF CHO的商業(yè)可購(gòu)得的專利培養(yǎng)基的改良形式。用2.131細(xì)胞系等細(xì)胞系時(shí)，該培養(yǎng)基支持與血清培養(yǎng)基相當(dāng)?shù)姆置谒?。?yōu)選將其改進(jìn)，包括大約6.7(+/-0.1)的酸性pH，而且它可用7.5mM的HEPES緩沖。培養(yǎng)基可含有0.05到0.1％的Pluronics F-68(BASF)，它是非離子表面活性劑，或其等價(jià)物(特征是具有保護(hù)細(xì)胞免受和噴霧有關(guān)的剪切力的優(yōu)點(diǎn))。培養(yǎng)基還可含有證實(shí)對(duì)提高培養(yǎng)基高于現(xiàn)有無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基生產(chǎn)率重要的專利補(bǔ)充物。那些本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易理解，可根據(jù)在特定時(shí)間點(diǎn)可行的具體商業(yè)實(shí)施例連續(xù)優(yōu)化培養(yǎng)基的選擇。這種變化包含常規(guī)實(shí)驗(yàn)，并將包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
4．可用氨基酸分析儀將廢培養(yǎng)基和起始培養(yǎng)基比較來(lái)分析生產(chǎn)培養(yǎng)基。這種分析已證明2.131細(xì)胞系將標(biāo)準(zhǔn)PF CHO培養(yǎng)基中的甘氨酸、谷氨酸和天冬氨酸消耗到起始濃度的10％左右的水平。將這些氨基酸補(bǔ)充到高水平可導(dǎo)致增強(qiáng)能比基線的產(chǎn)生量提高2-3倍的培養(yǎng)物密度和生產(chǎn)率。熟練技術(shù)人員將理解本發(fā)明范圍中的其它細(xì)胞系可同等的用于根據(jù)本方法產(chǎn)生α-L-艾杜糖苷酸酶。因此，可能需要或多或少補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物來(lái)優(yōu)化培養(yǎng)基。這些優(yōu)化將包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，并不需過(guò)度的實(shí)驗(yàn)來(lái)實(shí)施。
5．可用核糖核苷和脫氧核糖核苷補(bǔ)充培養(yǎng)基，來(lái)支持缺乏二氫葉酸還原酶的細(xì)胞系2.131。熟練技術(shù)人員可理解本發(fā)明范圍內(nèi)的其它細(xì)胞系也可同等的用于根據(jù)本方法產(chǎn)生α-L-艾杜糖苷酸酶。同時(shí)可能或多或少需要核糖核苷和脫氧核糖核苷來(lái)優(yōu)化培養(yǎng)基。這些優(yōu)化將包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，并不需過(guò)度的實(shí)驗(yàn)來(lái)實(shí)施。
6．培養(yǎng)3-4日達(dá)到鋪滿后，可大約每12小時(shí)換大約2/3培養(yǎng)液?？墒褂萌鏐ellco灌流棒(它是一種攪拌裝置，中空，尖端有篩濾板)來(lái)完成培養(yǎng)基的更換。通過(guò)棒上的40微米篩板，經(jīng)過(guò)中空內(nèi)部來(lái)泵出培養(yǎng)液。從含有酶的上清液中分離出帶有2.131細(xì)胞塊的微載體。
7．已通過(guò)生產(chǎn)率研究顯示培養(yǎng)基的迅速和頻繁周轉(zhuǎn)可導(dǎo)致從細(xì)胞培養(yǎng)物中酶總收集量的提高。較低的頻率導(dǎo)致酶較低的總的堆聚。在12小時(shí)培養(yǎng)循環(huán)中對(duì)酶分泌率的研究證明在培養(yǎng)期的大部分時(shí)間中，細(xì)胞在活躍的分泌酶。更頻繁的周轉(zhuǎn)未必會(huì)得到更多的酶。該實(shí)施例的方法已證明優(yōu)于灌流培養(yǎng)，也遠(yuǎn)優(yōu)于嚴(yán)格的分批培養(yǎng)或每天或隔天分批/加料策略。使用大約每12小時(shí)更換，可將細(xì)胞保持在具有高度活力和高水平生產(chǎn)率的極好狀態(tài)。
8．可通過(guò)使用基因表達(dá)的丁酸鈉誘導(dǎo)來(lái)增強(qiáng)α-L-艾杜糖苷酸酶的產(chǎn)生。2.131細(xì)胞系的系統(tǒng)研究證明能使用大約2mM丁酸，并導(dǎo)致酶產(chǎn)生有2倍或更大的誘導(dǎo)，而對(duì)糖的加工影響最小。還未證明更低的丁酸水平也能誘導(dǎo)，而更高水平可導(dǎo)致更高的誘導(dǎo)，但會(huì)降低產(chǎn)生的酶對(duì)患α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏的病人的細(xì)胞的親和力。結(jié)果提示兩倍或更高的誘導(dǎo)導(dǎo)致糖較少加工和較少的酶被磷酸加成，和毒性增加。一個(gè)具體優(yōu)選方法采用每48小時(shí)在培養(yǎng)系統(tǒng)中加入2mM丁酸。該實(shí)施例導(dǎo)致使用該方法產(chǎn)生的酶有約兩倍的誘導(dǎo)，而對(duì)酶攝入親和力無(wú)顯著作用(K-攝入小于30U/ml或2.0mM)。使用具有上述所有改良和誘導(dǎo)的特征的本方法實(shí)施例，15升培養(yǎng)系統(tǒng)在峰培養(yǎng)密度時(shí)可產(chǎn)生大約每天每升培養(yǎng)液25毫克，或更多。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有產(chǎn)生其量能治療性使用的α-L-艾杜糖苷酸酶的獨(dú)特能力的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。在優(yōu)選例中，本發(fā)明的特征是2.131細(xì)胞系等重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系，它們能穩(wěn)定而可靠的產(chǎn)生大量α-L-艾杜糖苷酸酶。在優(yōu)選例中細(xì)胞系可能含有包含CMV啟動(dòng)子、Cα內(nèi)含子、人α-L-艾杜糖苷酸酶cDNA和牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化序列的表達(dá)構(gòu)建物的至少約10個(gè)拷貝。在更優(yōu)選例中，細(xì)胞系以每天每107細(xì)胞至少約20-40微克的量表達(dá)被正確加工、高攝入形式、適合于酶替換治療的α-L-艾杜糖苷酸酶。因此，對(duì)于本發(fā)明該方面的優(yōu)選例，適應(yīng)于產(chǎn)生其量能治療性使用的α-L-艾杜糖苷酸酶的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系擁有一個(gè)或多個(gè)下列特征1．優(yōu)選例的細(xì)胞系衍生自一種親本細(xì)胞系，其中細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)傳代，直到獲得更小的尺寸和更快的生長(zhǎng)速率，和直到它們易于附著于底物。
2．用含有2和3、大約2.2kb長(zhǎng)的人cDNA和3′牛生長(zhǎng)激素巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件、含有鼠外顯子聚腺苷酸化位點(diǎn)之間的Ca內(nèi)含子的5′內(nèi)含子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染優(yōu)選例細(xì)胞系?？捎萌?0比1的比率，用任何合適的常用選擇載體如pSV2NEO轉(zhuǎn)染表達(dá)載體。選擇載體pSV2NEO反過(guò)來(lái)賦予成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以G418抗性。在具體優(yōu)選例中，用大約50比1的比率，因?yàn)樵摫嚷试鰪?qiáng)了多拷貝數(shù)插入片段的獲得。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例(其中提供了中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系2.131)，有α-L-艾杜糖苷酸酶的表達(dá)載體大約10個(gè)拷貝。這樣的細(xì)胞系已顯示能生產(chǎn)大量人α-L-艾杜糖苷酸酶(最少每天每107細(xì)胞20微克)的活性。特別優(yōu)選例如2.131細(xì)胞系擁有產(chǎn)生正確加工，含有與N連接的寡糖(含用磷酸在6位修飾的高甘露糖鏈，其量足以產(chǎn)生具有高親和力的酶(K-攝入小于3nM))的酶的能力。
3．本發(fā)明的細(xì)胞系如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系2.131產(chǎn)生的酶被迅速同化入細(xì)胞，消除粘多糖積儲(chǔ)并在患α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏的病人細(xì)胞中具有大約5天的半衰期。
4．優(yōu)選例的細(xì)胞系如2.131細(xì)胞系適應(yīng)大量培養(yǎng)并在這些條件下穩(wěn)定產(chǎn)生人α-L-艾杜糖苷酸酶。優(yōu)選例的細(xì)胞能在大約6.6到6.8的酸性pH下生長(zhǎng)并分泌α-L-艾杜糖苷酸酶，在該pH下α-L-艾杜糖苷酸酶的積累會(huì)提高。
5．根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞系的具體優(yōu)選例，如2.131細(xì)胞系，使用特別配制的無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基能每天兩次分泌超過(guò)每毫升2,000單位(每毫升8微克)水平的人α-L-艾杜糖苷酸酶。
在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了適合產(chǎn)生其量能治療性使用的α-L-艾杜糖苷酸酶的新穎載體。足量重組α-L-艾杜糖苷酸酶的產(chǎn)生是對(duì)酶結(jié)構(gòu)研究和酶置換治療的關(guān)鍵必備條件。根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系允許產(chǎn)生相當(dāng)量的正確加工以備攝入的重組α-L-艾杜糖苷酸酶。已描述了其它三種溶酶體酶，α-半乳糖苷酶(Ioannou等，細(xì)胞生物學(xué)雜志，1191137-1150(1992))、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(Bielicki等，生物化學(xué)雜志，289241-246(1993))，和N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶(Anson等，生物化學(xué)雜志，284789-794(1992))在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中，使用不同啟動(dòng)子并在一種場(chǎng)合通過(guò)擴(kuò)增來(lái)超量表達(dá)。本發(fā)明的特征是缺乏二氫葉酸還原酶的CHO細(xì)胞系，但根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選例，擴(kuò)增是不需要的。另外，本發(fā)明提供了用CMV立即早期基因啟動(dòng)子/增強(qiáng)子高水平表達(dá)人α-L-艾杜糖苷酸酶。
本發(fā)明優(yōu)選例的特征是表達(dá)載體包含巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件、由衍生自外顯子2和3之間的鼠長(zhǎng)鏈免疫球蛋白Cα基因的小鼠Ca內(nèi)含子構(gòu)成的5’內(nèi)含子、人長(zhǎng)約2.2kb的cDNA，和3’牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化位點(diǎn)?？捎?0比1的比率和任何合適的常用選擇載體如pSV2NEO一起轉(zhuǎn)染該表達(dá)載體。而選擇載體如pSV2NEO賦予成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞G418抗性。在具體實(shí)施例中，用大約50比1的表達(dá)載體比選擇載體，因?yàn)樵摫嚷誓茉鰪?qiáng)多拷貝數(shù)插入片段的獲得。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例(其中提供了中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系2.131)，有大約10個(gè)α-L-艾杜糖苷酸酶表達(dá)載體的拷貝。這樣的表達(dá)構(gòu)建物已顯示能在合適細(xì)胞系如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系2.131中產(chǎn)生大量人α-L-艾杜糖苷酸酶(最少每天每107個(gè)細(xì)胞20微克)的活力。
在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的新穎α-L-艾杜糖苷酸酶并因此存在能治療性使用該酶的量。本發(fā)明的方法產(chǎn)生正確加工并為高攝入形式的，適合于酶替換治療和對(duì)體內(nèi)治療有效的基本純的α-L-艾杜糖苷酸酶。
根據(jù)本發(fā)明，α-L-艾杜糖苷酸酶的比活力超過(guò)每毫克蛋白質(zhì)約200,000單位。優(yōu)選的，每毫克蛋白質(zhì)超過(guò)約240,000單位。本發(fā)明全長(zhǎng)α-L-艾杜糖苷酸酶的分子量是大約82,000道爾頓，包含約70,000道爾頓的氨基酸和12,000道爾頓的糖類。本發(fā)明的重組酶比之前報(bào)道的尿酶的部分純化制備物能更有效被細(xì)胞胞吞。根據(jù)本發(fā)明的重組酶有效降低放射性S-標(biāo)記的GAG在α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏成纖維細(xì)胞中的積聚，表明它被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w(GAG儲(chǔ)存的位點(diǎn))。這種糾正所需的極低濃度的α-L-艾杜糖苷酸酶(半最大糾正濃度為0.7pM)，對(duì)酶替換治療的成功是非常重要的。
人α-L-艾杜糖苷酸酶cDNA預(yù)期在信號(hào)肽切開(kāi)后有一個(gè)653個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，有70,000道爾頓的預(yù)計(jì)分子量。氨基酸測(cè)序揭示了N-末端的丙氨酸26給出了一個(gè)預(yù)計(jì)的629個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。人重組α-L-艾杜糖苷酸酶在成熟蛋白質(zhì)位置8具有一個(gè)組氨酸。預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)序列包含6個(gè)可能的N-連接寡糖的修飾位點(diǎn)。所有這些可在重組蛋白質(zhì)中被修飾。已證明第三和第六個(gè)位點(diǎn)含有一個(gè)或多個(gè)甘露糖6-磷酸殘基，引起攝入細(xì)胞的高親和力。下列肽相當(dāng)于具有N-末端丙氨酸和下列序列的人重組α-L-艾杜糖苷酸酶的氨基酸26-45ala-glu-ala-pro-his-leu-val-his-val-asp-ala-ala-arg-ala-leu-trp-pro-leu-arg-arg本發(fā)明α-L-艾杜糖苷酸酶的過(guò)度表達(dá)不導(dǎo)致其它依賴甘露糖-6-P導(dǎo)向的溶酶體酶的普遍分泌。分泌的重組α-L-艾杜糖苷酸酶和正常分泌的酶在許多方面相似。在各種測(cè)定中發(fā)現(xiàn)其分子量是77,82,84和89kDa，與尿糾正因子發(fā)現(xiàn)的87kDa(Barton等，生物化學(xué)雜志，2467773-7779(1971))，和培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞分泌的酶76kDa和82kDa(Myerowitz等，生物化學(xué)雜志，2563044-3048(1991)；Taylor等，生物化學(xué)雜志274263-268(1991))一致。研究中和研究間的差異是由于測(cè)量的不精確。重組酶的胞內(nèi)加工的圖式-分子大小的緩慢減小和最后額外的小于9kDa條帶的出現(xiàn)和人成纖維細(xì)胞酶是相同的。最快的條帶是80N-末端氨基酸蛋白水解切開(kāi)造成的。
在第五個(gè)方面，本發(fā)明的特征是一種純化α-L-艾杜糖苷酸酶的新穎方法。在優(yōu)選例中，本發(fā)明的特征是一種純化重組α-L-艾杜糖苷酸酶的方法，其已被優(yōu)化成提供用可驗(yàn)證的層析樹(shù)脂和方便的加樣、洗滌和洗脫操作快速而有效的純化。純化本發(fā)明的α-L-艾杜糖苷酸酶的方法涉及一系列能使酶從無(wú)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)培養(yǎng)基中高產(chǎn)率的純化的柱層析步驟。
根據(jù)第一個(gè)實(shí)施例，可以使大量細(xì)胞在含有約10％血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，然后轉(zhuǎn)到改良的無(wú)蛋白質(zhì)生產(chǎn)培養(yǎng)基上，不經(jīng)任何顯著適應(yīng)來(lái)產(chǎn)生用于純化的高比活力的初始材料。在第二個(gè)實(shí)施例中，使用濃縮/滲濾流程，它能從粗物質(zhì)除去外源材料如Pluronics F-68來(lái)防止其污染柱。在第三個(gè)實(shí)施例中，酸化第一柱上樣液，來(lái)使無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基配制物中發(fā)現(xiàn)的糖醛酸等的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用變得最小。在第四個(gè)實(shí)施例中，用肝素、苯基和分子排阻柱純化流程，使用可自動(dòng)化步驟來(lái)生產(chǎn)純酶。在第五個(gè)實(shí)施例中，用肝素和苯基柱步驟來(lái)除去不需要的代切口的或降解的α-L-艾杜糖苷酸酶。在第六個(gè)實(shí)施例中，用酸性pH處理步驟來(lái)滅活可能的病毒而不傷害酶。
根據(jù)本發(fā)明純化α-L-艾杜糖苷酸酶的方法的具體優(yōu)選例的特征是根據(jù)下列具體實(shí)施例的一種以上或所有優(yōu)化。本發(fā)明的純化方法因此可提供具有本文描述的特征的純化α-L-艾杜糖苷酸酶。
1．濃縮/滲濾用空心纖維濃縮器(A/G Technologies,30K截留值)處理粗上清液，來(lái)大約減少75％的液體體積，然后用肝素加樣緩沖液(10mM NaPO4,pH5.3,NaCl200mM)滲濾。滲濾是從上清液除去不需要的化合物如Pluronics F-68(一種在本發(fā)明的許多細(xì)胞培養(yǎng)物中需要的表面活性劑，會(huì)弄臟柱)的重要步驟。滲濾也可以部分除去能妨礙結(jié)合于肝素柱的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。這些抑制劑可在PF-CHO培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)，而且相信它們是衍生自存在于該具體培養(yǎng)基中的大豆水解物的糖醛酸。
2．肝素柱可在加到肝素-SepharoseCL-6B上之前將加樣液調(diào)整到大約5.0的pH。肝素柱的其它類型如肝素FF(Pharmacia)具有不同的鍵，不和α-L-艾杜糖苷酸酶有效結(jié)合。較低的pH會(huì)在某種程度上中和糖醛酸，減少了它們的競(jìng)爭(zhēng)性作用。沒(méi)有滲濾和pH調(diào)節(jié)，PF-CHO培養(yǎng)液運(yùn)行肝素柱(基本上沒(méi)有酶流穿)?？捎胮H大約為5.3的緩沖液洗滌柱，然后用0.6M NaCl洗脫。結(jié)合和洗脫鹽濃度的狹窄范圍能得出有效的純化步驟和常在一步后得到純度大于90％的酶。
3．苯基柱可在下一步中使用苯基-Sepharose BP(Pharmacia)?？蓪⒏嗡叵疵撘赫{(diào)整到大約1.5M NaCl，并加到該柱上。樹(shù)脂的選擇和鹽濃度一樣重要，可確保酶完全結(jié)合(不流穿)，而且用大約0.15M NaCl可方便并完全的洗脫。獲得的洗脫液是接近純的α-L-艾杜糖苷酸酶。
4．可進(jìn)行pH滅活來(lái)提供除去可能的病毒的強(qiáng)有力的步驟。將苯基合并液用檸檬酸pH3.0調(diào)節(jié)到大約3.3，在室溫下保持大約4小時(shí)。然后可以中和酶。具有該步驟的實(shí)施例已證明能最少除去大約5log單位病毒。該步驟基本不滅活或影響酶活性。
5．然后可將酶濃縮并注射到Sephacryl S-200柱上，收集酶峰。
已證明以這種方式純化的酶在N-連接的糖的位置3和6含有足量甘露糖-6-磷酸殘基，來(lái)給出低于每毫升30單位(低于2nM)的酶攝入親和力。該酶能充分糾正粘多糖積儲(chǔ)疾病并具有大約5天的胞內(nèi)半衰期。
在第六個(gè)方面，本發(fā)明的特征是治療完全或部分由α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏引起的疾病的新穎方法。重組α-L-艾杜糖苷酸酶提供了犬MPSI模型酶替換療法。該犬模型由于基因突變?chǔ)?L-艾杜糖苷酸酶缺乏，和人MPS I相似。將純化、正確加工的α-L-艾杜糖苷酸酶靜脈施給11只犬。在用每公斤25,000到125,000單位每周劑量治療3、6或13個(gè)月的犬中，酶在不同的組織中被攝入，并減少許多組織中的溶酶體積儲(chǔ)。該疾病的長(zhǎng)期治療和行為、關(guān)節(jié)強(qiáng)直、表皮和生長(zhǎng)的臨床改善有關(guān)。更高劑量的治療(每周每公斤125,000單位)得到更好的效果，而且除了行為、關(guān)節(jié)強(qiáng)直、表皮的更快速臨床改善外，還包括尿GAG排泄的正?；?。
即使25,000單位的小劑量(0.1mg/kg/wk)酶治療也導(dǎo)致顯著的酶在一些組織中分布和減少GAG積儲(chǔ)。如果持續(xù)1年以上，對(duì)行動(dòng)、活力、生長(zhǎng)和整體健康情況具有顯著的臨床效果。該劑量的治療并不改善其它作為該成分所致疾病的重要部位的組織如軟骨和腦。每?jī)芍苁┯?次的125,000單位(0.5mg/kg)的更高劑量證明可達(dá)到改善的組織通透性，而且組織水平的治療性作用在2周中就會(huì)完成。對(duì)該增加劑量的研究已在兩只犬上進(jìn)行。這些MPSI犬顯示顯著的臨床改善，而且尿GAG的排泄基本降到正常范圍內(nèi)。除了改變給藥技術(shù)控制的免疫反應(yīng)，酶治療還未顯示顯著的臨床或生物化學(xué)毒性。該更高的每周劑量酶治療對(duì)改善MPSI的一些臨床特征和降低積儲(chǔ)是有效的，沒(méi)有顯著的毒性。
在第七個(gè)方面，本發(fā)明的特征是含有人α-L-艾杜糖苷酸酶用于治療α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏的新穎藥物組合物。該重組酶可用許多途徑，如胃腸外、外用、鼻內(nèi)、吸入或口服給藥來(lái)施用。本發(fā)明的其它方面提供了通過(guò)將其和可以是固體、半固體或液體或可吸收的膠囊的藥物學(xué)上可接受的載體一起配制來(lái)施用酶。藥物組合物的例子包括片劑，滴劑如鼻用滴劑，皮膚涂用的組合物如軟膏、凝膠、霜和懸浮液，吸入用噴霧劑，鼻噴霧劑和脂質(zhì)體。按組合物重量，通常重組酶包含0.05％至99％或0.5％至99％，如將用于注射的含0.5和20％之間的組合物，和將用于口服的含0.1至50％的組合物。
要產(chǎn)生用于口服給藥的含治療性酶的劑量單位形式的藥物組合物，可以用酶和固體、粉末載體，如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、土豆淀粉、玉米淀粉、支鏈淀粉等淀粉、昆布粉或柑橘類果肉粉、纖維素衍生物或明膠，也可包括潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂或鈣，或Carbowax或其它聚乙二醇蠟，并壓成片劑或糖衣丸的核心。如果需要糖衣丸，可用例如含有阿拉伯膠、滑石和/或二氧化鈦的濃縮糖溶液，或可用溶于易揮發(fā)有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑混合物的膜形成劑包裹核心?？稍谶@些包衣中加入染料，以區(qū)分不同活性物質(zhì)內(nèi)容。對(duì)于由明膠和例如作為增塑劑的甘油構(gòu)成的軟明膠膠囊組合物，或相近的封閉膠囊，可將活性物質(zhì)和Carbowax或合適的油，如芝麻油、橄欖油或花生油混合。硬明膠膠囊可含有活性物質(zhì)顆粒和固態(tài)粉狀載體如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、土豆淀粉、玉米淀粉或支鏈淀粉等淀粉，纖維素衍生物或明膠，而且還可以包含硬脂酸鎂或硬脂酸作為潤(rùn)滑劑。
本發(fā)明的治療性酶還可通過(guò)胃腸外施藥，如通過(guò)皮下、肌肉內(nèi)或靜脈注射或通過(guò)緩釋皮下植入物。在皮下、肌肉內(nèi)或靜脈注射中，可將治療性酶(活性成分)溶解或分散在液相載體中。為了胃腸外施藥，可以將活性材料與可接受的載體，優(yōu)選花生油、棉籽油等各種植物油適當(dāng)混合。還可使用其它胃腸外載體如使用solketol，甘油、縮甲醛和水性胃腸外配制物的有機(jī)組合物。
對(duì)于經(jīng)注射胃腸外使用，組合物可以包含根據(jù)本發(fā)明的活性酸的水溶性藥物學(xué)上可接受的鹽的水溶液，理想的是濃度為0.5-10％，可任選包含水溶液中的穩(wěn)定劑和/或緩沖物質(zhì)?？蓪⑷芤旱膭┝繂卧欣墓喾庠诎碴持小?br> 當(dāng)用皮下植入物的形式施用治療性酶時(shí)，將化合物懸浮或溶解在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的緩慢分散的材料中，或通過(guò)使用滲透泵等的恒定驅(qū)動(dòng)力以緩慢釋放活性材料的裝置施用。在這些情況下，可以在一段延續(xù)期間內(nèi)施藥。
對(duì)于外用，適合用軟膏、凝膠、懸液、霜或類似物形式的藥物組合物?；钚晕镔|(zhì)的量可以變化，例如，活性物質(zhì)重量在0.05％-20％之間。這種外用的藥物組合物可用已知方法制備，如將活性物質(zhì)和已知載體材料如異丙醇、甘油、石蠟、十八烷醇、聚乙二醇等混合。藥物學(xué)上可接受的載體還可包含已知化學(xué)吸收促進(jìn)劑。吸收促進(jìn)劑的例子是二甲基乙酰胺(美國(guó)專利號(hào)3,472,931)、三氯乙醇或三氟乙醇(美國(guó)專利號(hào)3,891,757)，某些醇及其混合物(英國(guó)專利號(hào)1,001,949)。也在英國(guó)專利說(shuō)明書(shū)1,464,975中描述了對(duì)未破損皮膚的外用施藥的載體材料，其公開(kāi)了由包含40-70％(v/v)異丙醇和0-60％(v/v)甘油(如存在任何平衡成分，是不超過(guò)溶劑總體積40％的稀釋劑的惰性組分)的溶劑構(gòu)成的載體材料。
含有治療性酶的藥物組合物施用的劑量可以在大范圍內(nèi)變化，可以由各種因子，如疾病的嚴(yán)重程度、病人年齡決定，而且可能須個(gè)別調(diào)整。提到作為每日施藥的治療性酶量的可能范圍是從大約0.1毫克到大約2000毫克或從1毫克到大約2000毫克。
可能適當(dāng)?shù)呐渲坪兄委熜悦傅乃幬锝M合物，從而使其以單劑量單位或多劑量單位提供在這些范圍內(nèi)的劑量。除了含有一種治療性酶(或多種治療性酶)，本配方還可含有一種或多種用于組合物中治療性酶催化的反應(yīng)的底物或輔因子。含有治療性酶的組合物也可含有一種以上治療性酶。
本方法和組合物中使用的重組酶也可通過(guò)用編碼重組α-L-艾杜糖苷酸酶的核酸轉(zhuǎn)化病人細(xì)胞來(lái)施用?？蓪⑷绱司幋a的核酸序列引摻入用于轉(zhuǎn)化入要治療的個(gè)體的細(xì)胞中的載體中。本文描述了這些載體的優(yōu)選例?？蓪⑤d體設(shè)計(jì)成整合入該個(gè)體的染色體，如反轉(zhuǎn)錄病毒載體，或在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制?？梢詫幋aα-L-艾杜糖苷酸酶的核苷酸序列的載體設(shè)計(jì)成能提供酶的連續(xù)或可調(diào)節(jié)的表達(dá)。另外，可將編碼酶的基因載體設(shè)計(jì)成穩(wěn)定的整合入細(xì)胞基因組或僅瞬時(shí)存在?？蓪⒊Ｒ?guī)基因治療的一般方法學(xué)應(yīng)用于編碼α-L-艾杜糖苷酸酶的多核苷酸序列?？稍贔riedman，科學(xué)，2441275-1281(1989)；Ledley,J.Inherit.Metab.Dis13587-616(1990)；和Tolstoshev等,Curr Opinions Biotech155-61(1990)中找到常規(guī)基因治療技術(shù)的綜述。
施用重組酶的具體優(yōu)選方法是靜脈內(nèi)給藥。具體的優(yōu)選組合物包含重組α-L-艾杜糖苷酸酶、生理鹽水、將pH維持在大約5.8的磷酸鹽緩沖液和人白蛋白。也可以下列量提供這些成分α-L-艾杜糖苷酸酶 0.05-0.2mg/ml或12,500-50,000單位/ml氯化鈉溶液 Ⅳ袋中150mM，總體積50-250cc磷酸鈉緩沖液10-50mM,pH5.8人白蛋白1mg/ml已描述了本發(fā)明。提供下列實(shí)施例說(shuō)明發(fā)明主題，但僅用于說(shuō)明而不用于限制。
實(shí)施例1產(chǎn)生重組艾杜糖苷酸酶標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如Sambrook等(1987)“分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”2nded,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.可用來(lái)克隆編碼人α-L-艾杜糖苷酸酶的cDNA。將之前克隆的人α-L-艾杜糖苷酸酶cDNA從bluescript KS亞克隆作為HindIII-ⅩbaI片段，亞克隆入PRCCMV(InVitrogen)。用克隆pRIR14.5(Kakkis等，核酸研究，167796(1988))的堿基788-1372(Tucker等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,787684-7688(1991)的PCR擴(kuò)增構(gòu)建了衍生自鼠免疫球蛋白的外顯子2和3之間的Cot內(nèi)含子的內(nèi)含子盒。該盒包括外顯子2的3′末端的136bp和外顯子3的5′末端的242bp，其將留在正確剪接的cDNA中。在內(nèi)含子盒的編碼區(qū)中不存在ATG序列。將內(nèi)含子盒克隆到α-L-艾杜糖苷酸酶cDNA的5′HindIII位點(diǎn)。通過(guò)XhoI消化除去neo基因，然后重新環(huán)化載體來(lái)產(chǎn)生pCMVhldu。
融化一小管主細(xì)胞庫(kù)，并將其放置在三個(gè)T150瓶中，其中加有DME/F12加補(bǔ)充物加10％FBS和50011g/mlG418。3-4天后，用胰蛋白酶-EDTA將細(xì)胞傳代到6個(gè)含有相同培養(yǎng)基的高容量滾瓶中。將2×109細(xì)胞的接種物加到含有60克Cytodex2微載體和DME/F12加補(bǔ)充物，10％FBS和50011g/ml G418的，最終體積為13升的Wheaton微載體瓶中。用灌流棒攪拌器通過(guò)Bellco頂部驅(qū)動(dòng)攪拌瓶。通過(guò)溫度，DO和pH監(jiān)控培養(yǎng)，并用具有PC界面(BioPro軟件)的Wheaton小型中試工廠控制系統(tǒng)控制。將參數(shù)用加熱套，氧氣噴霧器和堿泵控制在設(shè)定點(diǎn)37℃,80％空氣飽和度和pH6.7。將培養(yǎng)物培養(yǎng)3-4日，在此時(shí)培養(yǎng)物由1-3×106細(xì)胞/ml的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)產(chǎn)生。此后，每隔12小時(shí)，用PF-CHO培養(yǎng)基(依顧客要求改良，JRHBiosciences)替換培養(yǎng)基一次。將頭2份收集物放置在一邊作為“洗出物”，第三份收集物是產(chǎn)物流出的開(kāi)始。每48小時(shí)加入決定性的2mM丁酸鈉來(lái)誘導(dǎo)艾杜糖苷酸酶表達(dá)的增加。每12小時(shí)替換10升培養(yǎng)基繼續(xù)生產(chǎn)，并將收集物濾過(guò)1微米濾膜來(lái)除去游離細(xì)胞和碎片。連續(xù)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物的溫度、pH和DO。每日兩次在培養(yǎng)基替換之前對(duì)培養(yǎng)物取樣，并用相差顯微鏡檢查細(xì)胞狀態(tài)和微生物，用便攜葡糖計(jì)試驗(yàn)葡萄糖含量，用熒光底物試驗(yàn)檢查艾杜糖苷酸酶活性。用總細(xì)胞蛋白質(zhì)試驗(yàn)在運(yùn)動(dòng)中檢查數(shù)次細(xì)胞量。在運(yùn)行中途，細(xì)胞量達(dá)到107細(xì)胞/ml。然后將收集的含有艾杜糖苷酸酶的生產(chǎn)培養(yǎng)物用A/GTechnology空心纖維分子濾膜截留值分子量30,000濃縮5倍。然后將濃縮液用至少3倍體積的10mMNaPO4,pH5.8中的0.2M NaCl滲濾8小時(shí)。該步驟從濃縮液中除去Pluronics F68和糖醛酸。這些分子會(huì)抑制肝素柱的功能。將濃縮液調(diào)節(jié)到pH5.0，濾過(guò)1.0和0.2微米濾膜，然后加到肝素-Sepharose CL-6B柱上。用10倍柱體積的0.2M NaCl,10mM NaPO4,pH5.3洗滌柱，用0.6MI,10mM NaPO4,pH5.8洗脫酶。將洗脫液調(diào)節(jié)到1.5M NaCl，濾過(guò)1微米濾膜，并加到苯基-Sepharose HP柱上。用10倍柱體積的1.5M NaCl,10mM NaPO4,pH5.8洗滌柱，并用0.15M NaCl,10mMNaPO4,pH5.8洗脫酶。
用1M檸檬酸pH2.9酸化酶部分到pH3.3來(lái)進(jìn)行病毒滅活，并在室溫，pH3.3下保溫酶4小時(shí)，用1M磷酸鹽緩沖液將酶再調(diào)節(jié)到pH5.8。在摻加示蹤劑的實(shí)驗(yàn)中證明該步驟能除去5log或更多的反轉(zhuǎn)錄病毒。將滅活酶濾過(guò)0.2μ濾膜，在A/G Technologies空心纖維濃縮儀(截留值分子量30,000)上濃縮，注射到SephacrylS200凝膠過(guò)濾柱的循環(huán)中，并收集峰。將合并的峰濾過(guò)0.2μ濾膜，配成0.1MNaPO4,pH5.8并裝入試管。
可進(jìn)行一系列的研究來(lái)測(cè)試酶的質(zhì)量、純度和效價(jià)。洗脫物的SDS-PAGE結(jié)果提供于圖2。
從該程序獲得的一種重組人α-L-艾杜糖苷酸酶顯示了每毫升100,000單位的效價(jià)，并具有總蛋白濃度0.313mg/ml。
實(shí)施例2重組α-L-艾杜糖苷酸酶治療是有效的對(duì)9只MPSI犬和6只MPSI貓以純化的重組α-L-艾杜糖苷酸酶短期靜脈給藥，已顯示酶在各種組織中被顯著攝入，以及在一次給藥后24小時(shí)組織中估計(jì)有50％或更多被吸收。雖然肝和脾吸收了最多量的酶，并有最好的病理學(xué)改善，已在許多但不是全部組織中觀察到了病理學(xué)和粘多糖含量的改善。具體的說(shuō)，軟骨、腦和心臟瓣膜沒(méi)有顯著改善。觀察到一只犬在13個(gè)月的長(zhǎng)期治療中的臨床改善，但其它研究被限制在6個(gè)月或以下。接受重組人酶的所有犬和大多數(shù)貓出現(xiàn)了對(duì)人產(chǎn)物的抗體。IgG抗體是補(bǔ)體激活型(可能是犬IgG等價(jià)物)。也在至少13％用糖腦苷酶治療的Gaucher病病人中觀察到了該現(xiàn)象。也在一只犬中觀察到了可能和免疫復(fù)合物疾病相關(guān)的蛋白尿癥。在其它治療動(dòng)物中未觀察到其它抗體作用。未觀察到特異毒性，另外臨床實(shí)驗(yàn)室研究(全血細(xì)胞計(jì)數(shù)、電解質(zhì)、BLJN/肌酸酐、肝酶、尿分析)也正常。
即使用小劑量25,000單位(0.1mg/kg/wk)的酶治療也導(dǎo)致一些組織中有顯著的酶分布，并降低GAG積儲(chǔ)。如果持續(xù)1年以上，治療的關(guān)于行為、活力、生長(zhǎng)和整體健康的顯著臨床效果是明顯的。該劑量的治療不改善該成分重要致病部位的其它組織如軟骨和腦。每?jī)芍苁┯?次的125,000單位(0.5mg/kg)的更高劑量證明可達(dá)到改善的組織通透性，而且組織水平的治療性作用在2周中就可完成。對(duì)該增加劑量為期6個(gè)月的研究正在兩只犬上進(jìn)行。這些MPSI犬顯示顯著的臨床改善，而且尿GAG的排泄基本降到正常范圍內(nèi)。除了改變施用技術(shù)控制的免疫反應(yīng)之外，酶治療還未顯示顯著的臨床或生物化學(xué)毒性。每周一次更高劑量的酶治療對(duì)改善MPSI的一些臨床特征并降低積儲(chǔ)是有效的，而沒(méi)有顯著的毒性。
這些對(duì)MPSI犬的各個(gè)研究和對(duì)MPSI貓的一個(gè)研究，結(jié)果顯示了重組人α-L-艾杜糖苷酸酶是安全的。這些相同結(jié)果也提供了重要的依據(jù)該重組酶對(duì)治療α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏是有效的。
實(shí)施例3對(duì)人有效的重組α-L-艾杜糖苷酸酶治療α-L-艾杜糖苷酸酶的人cDNA預(yù)測(cè)了信號(hào)肽切割后有653個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)和有70,000道爾頓的預(yù)計(jì)分子量。氨基酸測(cè)序揭示了N-末端的丙氨酸26給出了629個(gè)氨基酸的預(yù)計(jì)蛋白質(zhì)。人重組α-L-艾杜糖苷酸酶具有成熟蛋白質(zhì)位置8的組氨酸。該預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)序列包含6個(gè)可能的N-連接的寡糖修飾位點(diǎn)。所有這些位點(diǎn)在重組蛋白質(zhì)中被修飾。已顯示第三和第六位點(diǎn)含有一個(gè)或多個(gè)甘露糖6-磷酸殘基，它們能引起高親和性攝入細(xì)胞。
該肽相當(dāng)于人重組α-L-艾杜糖苷酸酶的氨基酸26-45，具有N-末端丙氨酸和下列序列ala-glu-ala-pro-his-leu-val-his-val-asp-ala-ala-arg-ala-leu-trp-pro-leu-arg-arg重組酶由于糖類修飾，在SDS-PAGE上具有82,000道爾頓的表觀分子量。已通過(guò)UCLA蛋白測(cè)序設(shè)備對(duì)純化人重組α-L-艾杜糖苷酸酶進(jìn)行了測(cè)序。優(yōu)選靜脈施用重組酶。人重組α-L-艾杜糖苷酸酶以0.05-0.2mg/ml(12,500-50,000單位/mL)的濃度用10mL聚丙烯小瓶供應(yīng)。酶的最終劑量形式包括人重組α-L-艾杜糖苷酸酶，生理鹽水，pH5.8的磷酸鹽緩沖液和1mg/ml的人白蛋白。這些可制備在生理鹽水袋中。
組分組合物α-L-艾杜糖苷酸酶0.05-0.2mg/mL或12,500-50,000單位/mL氯化鈉溶液 Ⅳ袋中150mM，總體積50-250cc磷酸鈉緩沖液 10-50mM,pH5.8人白蛋白 1mg/mL在研究中包括了顯示MPSI疾病的臨床表型，并且白細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中α-L-艾杜糖苷酸酶水平低于正常的1％的病人。所有病人顯示粘多糖在內(nèi)臟和軟組織中積聚和不同程度功能損傷的一些臨床證據(jù)。通過(guò)測(cè)量尿GAG排泄隨時(shí)間減少的百分比可確定效果。圖3揭示了16個(gè)MPSI病人與正常排泄值相比的尿GAG水平。在未治療的MPSI病人中，尿GAG值范圍很廣。用重組α-L-艾杜糖苷酸酶治療后，未降解GAG排泄下降50％以上，是一種測(cè)量個(gè)體對(duì)治療的反應(yīng)的有效手段。圖4顯示了MPSI病人中酶治療前后白細(xì)胞艾杜糖苷酸酶的活性。在圖5中描述了酶治療前后的口腔艾杜糖苷酸酶活性。圖6顯示了三個(gè)病人中肝和脾臟的大大收縮，以及關(guān)節(jié)和軟組織積儲(chǔ)的顯著臨床改善，與重組酶治療僅8周后未降解GAG大于65％的減少相關(guān)。圖7顯示了用重組酶治療僅12周后，用重組酶治療的病人中肝和脾的基本正?；D8顯示了11個(gè)病人中用重組酶治療22周尿GAG排泄的急劇下降。肝和脾大小的臨床評(píng)估是評(píng)估MPSI病人中成功的骨髓移植治療的最為廣泛接受的方法(Hoogerbrugge等，Lancet3451398(1995))。這些測(cè)量在MPSI病人中和降低內(nèi)臟GAG積儲(chǔ)高度相關(guān)。
雖然本發(fā)明已根據(jù)現(xiàn)存優(yōu)選例進(jìn)行了描述，必須理解的是，可產(chǎn)生各種改變，而不超越本發(fā)明精神的范圍。因此本發(fā)明僅受權(quán)利要求限制。
權(quán)利要求
1．一種產(chǎn)生α-L-艾杜糖苷酸酶的方法，其特征在于，該方法包含用編碼全長(zhǎng)α-L-艾杜糖苷酸酶或其生物活性片段或突變體的cDNA轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞系。
2．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，合適的細(xì)胞系是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系2.131。
3．如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，該方法中的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞分泌比引入編碼全長(zhǎng)α-L-艾杜糖苷酸酶、或其生物活性片段的cDNA之前分泌的α-L-艾杜糖苷酸酶大約多5,000到7,000倍的α-L-艾杜糖苷酸酶。
4．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)在微載體上。
5．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)化成使產(chǎn)生過(guò)程中的培養(yǎng)pH降低到大約6.7-6.8。
6．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)系統(tǒng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的大約2/3到3/4約每12小時(shí)更換一次。
7．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將培養(yǎng)系統(tǒng)氧飽和度優(yōu)化到大約80％。
8．如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，用間歇純氧噴霧法將培養(yǎng)系統(tǒng)氧飽和度優(yōu)化到大約80％。
9．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用最初含大約10％血清的微載體來(lái)產(chǎn)生用于培養(yǎng)系統(tǒng)的大量細(xì)胞。
10．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包含沖洗轉(zhuǎn)移到用于生產(chǎn)的無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基上。
11．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，使用了包含JRH BiosciencesPF-CHO生長(zhǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)系統(tǒng)。
12．如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，優(yōu)化所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基為包括補(bǔ)充量的一種或多種選自谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、核糖核苷和脫氧核糖核苷的成分。
13．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用灌流棒進(jìn)行分批加料過(guò)程。
14．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將丁酸鈉加到培養(yǎng)系統(tǒng)中。
15．有產(chǎn)生α-L-艾杜糖苷酸酶能力的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。
16．如權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，其特征在于，轉(zhuǎn)染細(xì)胞系是一種重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系。
17．如權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，其特征在于，該轉(zhuǎn)染細(xì)胞系是重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢2.131細(xì)胞系。
18．如權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，其特征在于，該轉(zhuǎn)染細(xì)胞系含有至少10個(gè)包含CMV啟動(dòng)子、Cα內(nèi)含子、α-L-艾杜糖苷酸酶cDNA，和牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化序列的表達(dá)構(gòu)建物拷貝。
19．如權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，其特征在于，該轉(zhuǎn)染細(xì)胞系表達(dá)量至少每天每107細(xì)胞表達(dá)大約20-40微克的α-L-艾杜糖苷酸酶。
20．一種適應(yīng)在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中產(chǎn)生人α-L-艾杜糖苷酸酶的載體。
21．如權(quán)利要求20所述的載體，其特征在于，該載體適應(yīng)在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO中產(chǎn)生人α-L-艾杜糖苷酸酶。
22．如權(quán)利要求20所述的載體，其特征在于，該載體包含一個(gè)CMV立即早期基因啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。
23．如權(quán)利要求20所述的載體，其特征在于，該載體包含巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件，由外顯子2和3之間的鼠Ca內(nèi)含子構(gòu)成的5′內(nèi)含子，編碼全長(zhǎng)α-L-艾杜糖苷酸酶或其生物活性片段的cDNA和3′牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化位點(diǎn)。
24．一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法產(chǎn)生的重組α-L-艾杜糖苷酸酶。
25．一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法產(chǎn)生的α-L-艾杜糖苷酸酶，其特征在于，該酶具有至少大約每毫克200,000單位比活力。
26．如權(quán)利要求25所述的α-L-半乳糖苷酶，其特征在于，該酶具有至少大約每毫克240,000單位的比活力。
27．一種純化α-L-艾杜糖苷酸酶的方法，其特征在于，該方法包括下列步驟(a)進(jìn)行濃縮/滲濾程序來(lái)從樣品中除去一種或多種不要的化合物；(b)酸化步驟(a)的樣品；(c)使步驟(b)的樣品從肝素柱上流過(guò)；(d)使步驟(c)的樣品從苯基柱上流過(guò)；(e)使步驟(d)的樣品從Sephacryl柱上流過(guò)；和(f)使基本純化的α-L-艾杜糖苷酸酶流過(guò)。
28．一種治療全部或部分由α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏引起的疾病的方法，其特征在于，該方法包含施用重組α-L-艾杜糖苷酸酶的步驟。
29．一種治療全部或部分由α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏引起的人疾病的方法，其特征在于，該方法包含施用重組人α-L-艾杜糖苷酸酶的步驟。
30．如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，該疾病是粘多糖代謝病。
31．如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，該疾病是MPSI。
32．如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，該疾病選自Hurler病、Scheie綜合征和Hurler-Scheie綜合征。
33．如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，患該疾病的病人的α-L-艾杜糖苷酸酶活性為正常活性的大約1％或更低。
34．如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，至少約25,000單位或0.1mg/kg重組α-L-艾杜糖苷酸酶每周一次被施用給患其缺乏癥的病人。
35．如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，至少約125,000單位或0.5mg/kg重組α-L一艾杜糖苷酸酶每周一次被施用給患其缺乏癥的病人。
36．一種藥物組合物，其特征在于，該組合物包含重組α-L-艾杜糖苷 酸酶和藥物學(xué)上可接受的載體。
37．如權(quán)利要求36所述的藥物組合物，其特征在于，該組合物還包含氯化鈉溶液、緩沖液和人白蛋白。
38．如權(quán)利要求36所述的藥物組合物，其特征在于，該重組α-L-艾杜糖苷酸酶以濃度大約為0.05到0.20mg/mL或每毫升大約12,500到大約50,000單位存在。
39．如權(quán)利要求36所述的藥物組合物，其特征在于，所述人白蛋白以至少大約1mg/mL的濃度存在。
40．如權(quán)利要求36所述的藥物組合物，其特征在于，所述緩沖液是濃度為大約10-50mM的磷酸鈉緩沖液。
41．如權(quán)利要求36所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物的pH維持在大約5.8。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組α－L－艾杜糖苷酸酶及其生物活性片段和突變體,產(chǎn)生和純化該酶的方法以及治療包含α－L－艾杜糖苷酸酶缺乏和粘多糖代謝病Ⅰ(MPSⅠ)等一些遺傳病的方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1300323SQ9980606
公開(kāi)日2001年6月20日 申請(qǐng)日期1999年5月7日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月13日
發(fā)明者E·D·卡基斯, B·塔納馬奇 申請(qǐng)人:加州大學(xué)洛杉磯分校港口研究和教育院