專利名稱：治療腫瘤的聯(lián)合療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制(腫瘤)生長的腫瘤治療方法，系通過免疫中和生長刺激肽類激素，并聯(lián)合應(yīng)用5-氟尿嘧啶衍生物和甲酰四氫葉酸的化療。
背景技術(shù)：
胃泌素是一種肽類激素，以兩種成熟形式存在三十四胃泌素(G34)和十七胃泌素(G17)，由位于胃竇(stomach antrum)部的特異性細胞，G細胞合成和分泌。在產(chǎn)胃泌素的細胞中，這些胃泌素激素是從含有信號肽的稱為“前胃泌素(preprogastrin)”的正常前體分子翻譯后加工形成的。信號肽(“前”序列)在細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被除去，產(chǎn)生“前胃泌素”肽，在分泌進入血流前，該肽在細胞中被進一步加工，產(chǎn)生成熟的胃泌素G34和G17(Dickinson 1991)。(用于參考的本文引用的全部文獻在權(quán)利要求書前的參考文獻欄中列出)。兩種成熟形式G34和G17，在它們的羧基端被酰胺化(-NH2)。在人體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)了由該前體分子經(jīng)不同加工產(chǎn)生的G17的多種形式，每種形式具有不同的生物活性(Dickinson，1995和Ciccotosto等人，1995)。在胃泌素的翻譯后加工中，它是“成熟”的羧基酰胺化形式，可通過該肽的羧基端結(jié)合于特異性細胞受體(稱為CCK-B/胃泌素受體)(Kopin等人，1992)。
胃泌素激素被分泌到循環(huán)血液中，并結(jié)合于胃里的特異性細胞，稱為腸嗜鉻樣(ELC)(enterochromaffin-like)細胞和壁細胞，這些細胞間接或直接影響胃的酸分泌。過去，一直認為這兩種胃泌素激素與刺激胃酸的分泌相關(guān)。近年，累積的證據(jù)顯示，胃泌素還作為腸胃道的營養(yǎng)因素起作用(Johnson，L.1997)，并且促進腸胃癌的生長(Watson等人，1989,Dickinson,C.J,1995)，以及非腸胃癌，包括小細胞性肺癌(Rehfeld等人，1989)的生長。
一些腫瘤類型，包括結(jié)腸直腸、胃、胰和肝細胞腺癌在它們的質(zhì)膜上擁有CCK-B/胃泌素受體，且這些腫瘤細胞對胃泌素的反應(yīng)是強力細胞增殖(Rehfeld,J.F,1972,Upp等人，1989和Watson等人，1993)。在結(jié)腸直腸癌患者中血漿總胃泌素水平升高，而且，特別是在許多使用胃泌素抗血清的結(jié)腸直腸腫瘤中已測到該激素前體前胃泌素量的增加(Ciccotosto等人，1995)。最近，發(fā)現(xiàn)許多癌細胞也分泌胃泌素，從而影響了自主增殖途徑(Van-Solinge等人，1993,Nemeth等人，1993和Seva等人，1994)。
肽類激素G17和G34結(jié)合于正常細胞胞膜上的CCK-B/胃泌素受體。然而，已發(fā)現(xiàn)G17刺激胃泌素依賴性癌細胞的生長，而G34不能。特別是，血清相關(guān)的G17能夠在腫瘤細胞中以CCK-B/胃泌素受體介導(dǎo)的內(nèi)分泌方式，刺激結(jié)腸直腸腫瘤的生長(Watson等人，1993)。G17與其它種類的胃泌素激素相比，由于對腫瘤細胞上CCK-B/胃泌素受體親和力可能增加，特別涉及到刺激結(jié)腸直腸腺癌的生長(Rehfeld,1972和1993)。已發(fā)現(xiàn)CCK-B/胃泌素受體以高親和力形式表達于56.7％人原代結(jié)腸直腸腫瘤上(Upp等人，1989)。
許多研究顯示，除了能夠?qū)ν庠葱詢?nèi)分泌胃泌素起反應(yīng)外，人的胃和結(jié)腸直腸腫瘤還產(chǎn)生胃泌素和它的前體(Ciccotosto等人，1995,Finley等人，1993,Kochman等人，1992,Nemeth等人，1993,Van Solinge等人，1993)，從而影響自分泌生長刺激途徑。腫瘤細胞的胃泌素產(chǎn)生不同于內(nèi)分泌G細胞。具體地說，這些腫瘤細胞含有高比例的前體前胃泌素和較低濃度的成熟肽。推測這一異常的比例是由于胃泌素固有失調(diào)性釋放的聯(lián)合肽基甘氨酸α-酰胺化單加氧酶的活性受限造成的(Ciccotosto等人，1995,Kelly,1985)。非調(diào)節(jié)性釋放的胃泌素將導(dǎo)致不同分子形式的該激素的異常產(chǎn)生和分泌。具體地說，結(jié)腸癌細胞不能有效加工前胃泌素，導(dǎo)致較少的前體胃泌素轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒祀模纱水a(chǎn)生了大部分不完整或畸變的胃泌素(Dickinson,1993和Rehfeld等人，1993)。另外，結(jié)腸直腸腫瘤中胃泌素水平的增加部分是由于結(jié)腸直腸腫瘤細胞中胃泌素基因的異常表達造成的(Hoosein等人，1990,Baldwin等人，1992和Finley等人，1993)。已在這些細胞中鑒定到類胃泌素肽(Hoosein等人，1988,Watson等人，1991和Finley等人，1993)，并證明為前體胃泌素(Van-Solinge等人，1993和Nemeth等人，1993)。
在一些結(jié)腸直腸癌中存在酰胺化的G17(G17-NH2)，證明一些腫瘤保留了只在分泌性顆粒中發(fā)生的胃泌素酰胺化那樣的完整的加工途徑(Varro等人，1994)。由于結(jié)腸直腸細胞系的基礎(chǔ)生長顯示可被抗胃泌素抗體抑制，內(nèi)源性產(chǎn)生的胃泌素也可作為自分泌生長因子(Hoosein等人，1988)。這在第二個研究中得到證實，即用Northern印跡分析在同一細胞系中顯示有胃泌素mRNA，且放射免疫試驗顯示細胞培養(yǎng)上清液中有胃泌素樣免疫反應(yīng)性(Hoosein等人，1990)。胃泌素肽也起旁分泌作用(Watson等人，1991b)，這在顯示惡性結(jié)腸直腸粘膜細胞亞群中胃泌素免疫反應(yīng)性更顯著的實驗(Finley等人，1993)中得到了證實。
當(dāng)G17結(jié)合于它的受體時，形成了一個G17/受體復(fù)合體，它通過調(diào)節(jié)細胞功能的第二信使方式刺激了細胞生長(Ullrich等人，1990)。G17結(jié)合于CCK-B/胃泌素受體導(dǎo)致觸發(fā)了對磷脂酰肌醇的破壞；蛋白激酶C的激活，從而增加了胞內(nèi)鈣離子的濃度；和通過促分裂原活化的蛋白激酶誘導(dǎo)了c-fos和c-jun原癌基因，顯示于對細胞增殖的調(diào)節(jié)(Tadisco等人，1995)。另外，已將結(jié)合于CCK-B/胃泌素受體的胃泌素與隨后的酪氨酸激酶造成的磷酸化增加相關(guān)聯(lián)，該酪氨酸激酶pp125FADK(粘著斑激酶)在傳遞促分裂信號中也起作用(Tanaguchi等人，1994)。
由于近年來在存活率上只得到了很小的改進，結(jié)腸直腸癌仍是難以治療的可怕疾病。手術(shù)是原發(fā)病的有效治療手段，但對經(jīng)常存在的殘留潛在病灶是無效的。通常向直腸癌患者推薦手術(shù)后的放射治療，來減少疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險。晚期直腸癌患者，手術(shù)后最有效的傳統(tǒng)治療是用5-氟尿嘧啶(5-FU)作的化療。然而已表明，5-FU治療對患者只有有限的益處，因為5-FU有高毒性且治療費用高，并且無論是單獨使用還是與其它細胞毒類藥物聯(lián)用，5-FU都不能明顯延長存活。在大多數(shù)情況下，潛伏的或不宜手術(shù)的結(jié)腸直腸腫瘤對化療或放療的反應(yīng)不是很好，故需要新的治療手段來補充現(xiàn)有的方案。
最近，一些研究顯示用5-FU和甲酰四氫葉酸的輔佐性聯(lián)合化療在晚期結(jié)腸直腸癌患者中改善了5-FU的效果。甲酰四氫葉酸是葉酸的衍生物，也稱為亞葉酸、噬橙菌因子或5-甲酰-5,6,7,8-四氫葉酸。研究顯示對杜克(Duke)階段C的患者，5-FU/甲酰四氫葉酸的聯(lián)合治療可以減少10-15％的死亡率(Moertel,1994)。對相同的患者組，用5-FU/甲酰四氫葉酸進行靜脈內(nèi)和腹腔內(nèi)聯(lián)合治療結(jié)果沒有明顯的病愈存活和總體存活優(yōu)勢點的傾向(Scheithauer等人，1995)。在晚期疾病中，相同的藥物聯(lián)合可導(dǎo)致存活優(yōu)點(Taylor,1993)，顯示出聯(lián)合組存活的中值為13.5個月，而用5-FU治療的患者為7.5個月(Petrioli等人，1995)。然而，這種聯(lián)合化療仍有顯著發(fā)病并其造成有害的副作用，包括口炎、腹瀉和骨髓抑制(Mahood等人，1991；Erlichman等人1988；Pietnelli等人，1989)，從而造成生活質(zhì)量問題，尤其對于晚期患者。
在許多實驗性胃腸癌中體內(nèi)和體外治療性評價了許多高親和力CCK-B/胃泌素受體拮抗劑。例如，丙谷胺，一種谷氨酸的衍生物(Seva等人，190；Harrison等人，1990和Watson等人，1991a)；Benzotrip，色氨酸的一種N-酰衍生物；L-365,260,Aspercillin的一種衍生物(Bock等人，1989)；和CI-988，一種模仿CCK五肽序列C端的分子(Hughes等人，1990)，已顯示出在體內(nèi)和體外都能有效地中和外源胃泌素對腸胃腫瘤生長的作用(Watson等人和Romani等人，1994)。然而，這些拮抗劑有嚴重的毒副作用而且缺少特異性，它們封閉了正常細胞中該受體所有潛在配體(如G34和CCK)的作用。最近，也已描述了高潛能和選擇性的CCK-B/胃泌素受體拮抗劑，如YM022(Yuki等人，1997)和YF476(Takinami等人，1997)。
在臨床前期的研究中已廣泛評估了丙谷胺和Benzotript。這些化合物的主要問題在于它們?nèi)狈λ幮?，而且替代G17需要相當(dāng)高的濃度(Watson等人，1992a；Watson等人，1992b)。除了這一點，丙谷胺和Benzotript還抑制了許多細胞系的基礎(chǔ)的胃泌素刺激性增殖(Seva等人，1990；Watson等人，1991a)。另外，在受治療的動物中，丙谷胺增加了胃泌素敏感性小鼠結(jié)腸腫瘤MC26異種移植的小鼠存活達39天，而對照動物為25天。
由于這類胃泌素拮抗劑對胃泌素/CCK-B受體的低特異性，故認為對生長的抑制是由胃泌素受體非依賴性作用誘導(dǎo)的。另外，識別和結(jié)合胃泌素的細胞受體不結(jié)合于測試的所有抑制劑(Seva等人，1994)。所以，如果在自分泌生長級聯(lián)反應(yīng)中不發(fā)生對胃泌素與受體結(jié)合的完全抑制，則胃泌素拮抗劑可能無法阻斷這種腫瘤生長的啟動機理。
由此，需要新的治療方法，它既可以自身作為一種療法，又可用于與化療聯(lián)合。聯(lián)合治療提供了提高治療指數(shù)和/或減少所需化療劑量的可能性，從而限制了不良副作用。
一種選擇性免疫中和胃泌素激素生物活性的治療方法，將提供一種有效的手段來控制或防止與結(jié)腸直腸癌相關(guān)的過量胃泌素激素產(chǎn)生引起的病理性改變。
共同轉(zhuǎn)讓的美國專利No.5,023,077、5,468,494、5,607,676、5,609,870和5,622,702公開了通過產(chǎn)生抗胃泌素抗體，用于控制患者G17和G34水平的免疫原和免疫原性組合物，還公開了這些組合物用于治療胃和十二指腸潰瘍及胃泌素誘導(dǎo)的癌癥的用途。本發(fā)明涉及美國專利No.5,023,077、5,468,494、5,607,676、5,609,870和5,622,702中公開的抗G17免疫原和免疫原性組合物與化療劑聯(lián)合治療胃泌素依賴性結(jié)腸直腸癌的用途。
本文描述的治療癌的方法有幾個優(yōu)點優(yōu)于現(xiàn)有的結(jié)腸直腸癌治療方法。與單用化療相比，抗G17免疫聯(lián)合化療劑(如5-FU和甲酰四氫葉酸)增加了控制或抑制結(jié)腸直腸腫瘤生長的治療效果。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種治療腫瘤的聯(lián)合方法，包括在與化療聯(lián)合中免疫中和促進腫瘤細胞分裂的肽類激素和因子。具體地說，本發(fā)明提供一種治療胃泌素依賴性癌癥(如結(jié)腸直腸腺癌)的方法。本方法包括，對需要治療的患者進行包括抗G17免疫接種的聯(lián)合治療，結(jié)合給予一種或多種化療劑。用于治療胃泌素依賴性腫瘤的抗G17免疫接種，在產(chǎn)生抗G17抗體上驚人地有效，盡管已知所用化療劑有骨髓抑制作用。
抗G17免疫接種包括，用針對激素G17的抗G17免疫原主動或被動免疫接種患者，來控制患者的G17水平。結(jié)果由于在患者體內(nèi)誘導(dǎo)了抗G17抗體，G17激素在體內(nèi)被中和，它的生理效應(yīng)被抑制，從而抑制了G17依賴性腫瘤細胞生長。
另外，用抗G17免疫接種聯(lián)合標(biāo)準化療，增加了結(jié)腸直腸癌的治療效果，因為在聯(lián)合中治療患者所需的化療劑劑量較低，從而降低了其對正常組織的毒性作用。此外，患者的生活質(zhì)量可以得到改善，他的存活時間也可延長。
在一優(yōu)選實施例中，本方法包括用抗G17免疫原主動免疫接種患有胃泌素依賴性腫瘤的哺乳動物，并聯(lián)合給予一種或多種化療劑，如5-氟尿嘧啶、甲酰四氫葉酸、左旋咪唑、順氯氨鉑、腫瘤壞死因子和丙谷氨?？笹17免疫原可以按患者需要，在治療開始和后續(xù)間隔給予。在免疫接種后，患者體內(nèi)產(chǎn)生的抗G17抗體可結(jié)合并中和G17(成熟、酰胺化的G17和G17的前體形式，如，G17-Gly)，并防止G17與其受體結(jié)合，從而防止胃泌素依賴性腫瘤細胞的生長。在預(yù)定的間隔時間，用標(biāo)準技術(shù)監(jiān)視免疫接種患者產(chǎn)生的抗G17抗體的滴度。另外，按標(biāo)準的治療方案給予化療劑或按患者的需要給予較低劑量。
在另一實施例中，本發(fā)明還提供一種治療胃泌素依賴性腫瘤的方法，包括用抗G17抗體被動免疫患胃泌素依賴性腫瘤的患者，并聯(lián)合給予一種或多種化療劑，如5-氟尿嘧啶、甲酰四氫葉酸、左旋咪唑、順式鉑氨、腫瘤壞死因子和丙谷氨。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，抗體可以是由本領(lǐng)域已知方法制得的嵌合性、人化的或人單克隆抗體。按患者的需要，此抗體可以和化療劑一起在治療起始和初期治序后的后續(xù)階段給予。


圖1描繪的圖顯示了用500μg/ml大鼠抗G17(1-9)-DT免疫原免疫接種大鼠后，血清抗體滴度與時間的關(guān)系。
圖2描繪的圖顯示了30mg/kg劑量5-FU/甲酰四氫葉酸治療，對用本發(fā)明的免疫原免疫接種的大鼠所得的抗G17(1-9)抗體滴度的影響。
圖3描繪的Scatchard印跡顯示了30mg/kg5-FU/甲酰四氫葉酸治療對BDIX大鼠白血球平均數(shù)的影響。
圖4描繪的柱狀圖顯示了未治療的、抗G17(1-9)DT治療的和DT治療的大鼠的腫瘤重量的中值。
圖5描繪的棒狀圖顯示了用30mg/kg 5-FU/甲酰四氫葉酸；30mg/kg 5-GU/甲酰四氫葉酸和DT免疫原；30mg/kg5-FU/甲酰四氫葉酸和抗G-17(1-9)-DT；25mg/kg 5-FU/甲酰四氫葉酸和DT免疫原；25mg/kg 5-FU/甲酰四氫葉酸和抗G-17(1-9)DT；20mg/kg 5FU/甲酰四氫葉酸和DT免疫原；20mg/kg 5FU/甲酰四氫葉酸和抗G17(1-9)DT；12.5mg/kg 5-FU/甲酰四氫葉酸和DT免疫原；和12.5mg/kg 5-FU和抗G17(1-9)DT治療的大鼠的腫瘤重量的中值。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供治療腫瘤，尤其是與胃泌素依賴性結(jié)腸直腸癌相關(guān)腫瘤的方法，所用的聯(lián)合治療包括用抗G17免疫原接種患者，用化療劑如5-FU和甲酰四氫葉酸治療患者。令人驚訝的是，已發(fā)現(xiàn)抗G17免疫接種/5-FU-甲酰四氫葉酸聯(lián)合治療較以前的治療結(jié)腸直腸癌方法更有效。用于聯(lián)合治療的化療劑不會顯著抑制免疫接種患者的抗G-17抗體的產(chǎn)生，并且可用較低劑量的化療劑治療腫瘤的生長。另外，免疫接種產(chǎn)生的抗G17抗體滴度能有效中和所有形式的G17激素。
在一優(yōu)選實施例中，本方法包括用抗G17免疫原性組合物主動性免疫接種患胃泌素依賴性結(jié)腸直腸癌的患者結(jié)合給予患者化療劑。按患者所需，即用標(biāo)準方法和腫瘤標(biāo)準放射評估分析免疫接種后患者血清中抗G-17滴度，給予后續(xù)抗G17免疫原加強免疫接種。也可在腫瘤手術(shù)前向患者提供抗G-17免疫接種。
抗G-17免疫原包括天然或合成的G17 N端氨基酸的肽片段作為免疫原的免疫部分。該肽片段偶聯(lián)于一個免疫原性載體如白喉類毒素(DT)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，抗G17免疫原包括G17的氨基端氨基酸，從位點1到9，所具有的氨基酸序列為pyroGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu，偶聯(lián)于白喉類毒素。其它適合的免疫原性蛋白載體包括牛血清白蛋白、匙孔_血藍蛋白(keylimpethemocyanin)、血青蛋白和破傷風(fēng)毒素。
本發(fā)明的免疫原還包括適合于將此免疫肽突出于蛋白載體，提高其結(jié)合于淋巴細胞受體能力的一個延伸肽或間隔肽(spacer peptide)序列。適合的間隔肽序列是SSPPPPC(序列表中的SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。當(dāng)然其它間隔肽也適合。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，優(yōu)選延伸序列附著于此免疫肽的羧基端。本發(fā)明的免疫原用標(biāo)準方法制得，并在美國專利No.5,023,077、5,468,494、5,607,676、5,609,870、5,688,506和5,662,702中公開，在這里納入本文作為參考。免疫接種后，在接受免疫接種的動物內(nèi)，本發(fā)明的免疫原產(chǎn)生高親和性中和的抗體，抑制了成熟形式和前體形式的G17對腫瘤生長的作用。產(chǎn)生的抗G17抗體結(jié)合并中和成熟和前體G17，從而防止了G17結(jié)合于腫瘤細胞上的受體，最終抑制了腫瘤細胞的生長。免疫原產(chǎn)生的抗體中和了羧基酰胺化和甘氨酸延伸的G17，并顯示出對G34或CCK沒有交叉反應(yīng)。
組合物(其中用于主動免疫接種的免疫原用于治療患者的胃泌素依賴性腫瘤)可以是多種形式的。它們包括，例如固態(tài)、半固態(tài)和液態(tài)劑型，如粉狀、液體溶液、懸浮液、栓劑、和注射用及難溶性溶液。優(yōu)選的形式依賴給藥模式和治療用途。該組合物包含本發(fā)明的免疫原和合適的藥學(xué)上可接受的成分，也可包含其它藥物制劑、載體、佐劑、賦形劑等，它們可用標(biāo)準方案混合。較佳地，該組合物是單元劑量的形式。一次或一段時間中，用于免疫接種或作為藥物施用的活性組合物的量將依賴于接受治療者、給藥的方法和形式以及治療大夫的判斷。
用于治療腸胃癌時，給予患者的免疫原性組合物的有效劑量范圍為0.001-2mg。免疫接種后的1-3個月，有效劑量的該免疫原性組合物，可以引發(fā)患者免疫應(yīng)答產(chǎn)生有效水平的抗體滴度以結(jié)合和中和成熟和前體形式的G17。在免疫接種和用化療劑(如5-FU/甲酰四氫葉酸)治療結(jié)腸直腸癌患者后，用標(biāo)準臨床方案評估對腫瘤生長的治療效果，如超聲波和核磁共振成像(MRI)來檢測腫瘤的存在和腫瘤的大小(如果存在腫瘤)?？笹17抗體的滴度也可通過從患者獲得的血樣進行監(jiān)測。
應(yīng)按需要予以加強免疫接種，來維持有效抗體滴度。按照本方法可有效治療胃泌素依賴性結(jié)腸直腸腺癌和其它胃泌素依賴性癌，如胃、肝、胰和肺的小細胞性癌，能夠抑制腫瘤的生長和減小腫瘤的大小。
對于被動免疫，用藥學(xué)上可接受的載體如鹽水(例如磷酸鹽緩沖鹽水)，靜脈給予患者抗G-17抗體。
按照標(biāo)準治療方案推薦的劑量給予化療劑，可以在治療初期同時、免疫接種前或免疫接種后與抗G17免疫原一起給藥。在一些病例中，在免疫接種前或后均給予化療劑可能有利。也可按患者的需要給予后續(xù)的化療治療，然后作MRI和超聲波成像來評定。
進行以下實施例來證明本聯(lián)合治療對結(jié)腸直腸癌的作用。
實施例1
進行以下試驗來測定抗G17(1-9)-DT提供的潛在臨床益處。本項研究的目的為(a)確定特異性大鼠抗G17(1-9)-DT免疫接種對大鼠腸胃道組織學(xué)表現(xiàn)的長期影響。
(b)評估5-FU/甲酰四氫葉酸聯(lián)用對抗G17(1-9)-DT產(chǎn)生的抗體滴度的影響；和(c)確定抗G17-(1-9)-DT和5-FU/甲酰四氫葉酸聯(lián)用對大鼠結(jié)腸模型的治療作用。
細胞系DHDK12是大鼠上皮腫瘤細胞系(Martin,1993)。該細胞系在含有10％胎牛血清(FCS,Sigma,Poole,UK)的RPMI 1640生長培養(yǎng)基(Gibco,Paisley,Scotland)中，濕潤條件、37℃、5％CO2培養(yǎng)。
免疫原抗G17(1-9)-DT免疫原包括G17的氨基酸殘基1-9，通過羧基端連接于肽間隔臂SSPPPPC(序列表中的SEQ ID NO:1)，然后與DT偶聯(lián)。用于這些研究的免疫原，用大鼠G17的氨基端9個氨基酸替換人G17表位，通過肽間隔臂連接于白喉類毒素(DT)制成對大鼠G17是特異性的。由大鼠抗G17(1-9)-DT產(chǎn)生的抗血清以抗大鼠G17(1-9):DT表示。
實驗動物由Cancer Studies Unit,University of Nottingham,UK提供雌性和雄性BDIX大鼠，6-10周齡、340-420g。這些將大鼠成對地關(guān)養(yǎng)，25℃、50％濕度，并保持12小時明亮12小時黑暗的循環(huán)。
在每次試驗前，動物按相同重量分。每組6-13只動物。所有動物實驗的免疫接種方案都遵照UK Coordinating Committee for Cancer Research(UKCCCR)指南進行。
將大鼠抗G17(1-9)-DT溶于無菌鹽水(0.9％)pH7.3到1mg/ml。在偶聯(lián)物溶液中加入佐劑，正胞壁酰二肽(Peninsula Labs.,Belmont,CA,USA)，得到終偶聯(lián)物的濃度在200-500μg/ml之間。用油性載體(montanide ISA 703；AMSSeppic Inc.,Paris,France)以1∶2(v/v)的比例通過乳化，配制該含水溶液。在置于一個通過三路栓與另一注射器相連的玻璃注射器后，將混合液在注射器內(nèi)來回擠壓40次形成乳化液。類似地配制含有DT肽和胞壁酰二肽的乳化液用于對照大鼠。皮下注射200μl體積的乳化液(50μg/大鼠) (實驗動物的右側(cè))。對動物免疫接種如下所述一次注射或21天間隔后重復(fù)。
細胞毒性處理治療方案在第1、3和5天，大鼠接受靜脈注射12.5和25mg/kg的5-氟尿嘧啶(5-FU,David Bull Labs.,Warwick.UK)和12.5-25mg/kg甲酰四氫葉酸(Lederle Labs.,Gosport,Hants,UK)，在整個研究中期間每4周重復(fù)一次(Asao,1992)。在免疫接種抗G17(1-9)-DT(200μg/ml)前或后，給予大鼠細胞毒性組合物。
引發(fā)腫瘤的生長以2.5×107/ml的細胞濃度，將DHDK 12細胞懸浮于無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS,Oxoid,Hants.,UK)中。對大鼠腹腔注射1ml Hypnorm(0.315ng/ml檸檬酸芬太奴和10mg/ml氟阿尼酮；Jannsen,Berrse,Belgium)、Hypnovel(5ng/ml咪達唑侖；Roche,Basel,Switzerland)和無菌蒸餾水(以1∶1∶5比例)。在右邊皮下切開后，將200μl體積的細胞懸浮液注射到腹壁肌肉層中，用創(chuàng)緣夾閉合手術(shù)切口。每個實驗組由6-13個動物組成。
測定大鼠抗G17(1-9)-DT-免疫接種的大鼠中特異性抗體的水平為了得到分析用的血樣，在整個試驗的各個時間點大鼠尾部采血，試驗終止時在末端麻醉下心臟穿刺采血?？勾笫驡17抗體血清水平用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定。將大鼠G17牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)物溶于0.1M甘氨酸緩沖液(pH 9.5)中至2μg/ml，然后以每孔25μl置于96-孔免疫(Immunulon)U平板(Dynatech Labs.,Sussex,UK)上。4℃培育諸孔，過夜后吸出未吸附的偶聯(lián)物，用緩沖液(0.9％鹽水，0.5％Tween-20[Sigma],0.02％NaN3[Sigma],pH7.3)洗滌諸孔。該緩沖液用于所有的洗滌步驟和試劑稀釋。按10倍系列稀釋度處理血清，起始稀釋度為1∶100。陽性對照為上述免疫接種動物的大鼠抗大鼠G17(1-9)-DT抗血清，陰性對照為正常大鼠血清和單用DT免疫接種的大鼠的血清。所有對照血清都采用與測試血清相同的稀釋度。以25μl每份將稀釋的血清加入到孔中，有或無25μl/孔大鼠G17-BSA(100μg/ml)(作為可溶性抑制劑)?；€對照孔只加入25μl的試驗緩沖液。室溫培育平板60分鐘，然后用試驗緩沖液洗滌。以1∶500稀釋度、50μl/孔，將羊抗大鼠免疫球蛋白(H+L)-生物素(Zymed,SanFrancisco,CA,USA)加入到孔中，室溫暗處培育60分鐘。洗滌后，以1∶100稀釋度加入親和素-堿性磷酸酶(Zymed)，室溫培育平板60分鐘。進一步洗滌后，將ρ硝基苯磷酸鹽(pNPP)底物(Sigma)加入到孔中(50μl/孔)，5分鐘顯色后，在405nm讀取吸光度。未用大鼠G17-BSA處理和用其處理的血清吸光度間的差異計算為特異性吸光度。
測定血白細胞數(shù)在實驗中通過尾部放血和在實驗結(jié)束時通過心臟穿刺，從大鼠收集肝素化血。用FACScan(熒光激活細胞分選儀)分析血白細胞數(shù)目(在HematologyDepartment at the University Hospital,Nottingham)。
組織學(xué)在長期抗G17(1-9)-DT免疫接種大鼠終止時，解剖并用福爾馬林固定免疫接種大鼠和年齡相匹配對照大鼠的胃、結(jié)腸和直腸的代表性區(qū)域。將這些切片包埋在石蠟中，用切片機切成4μm的切片，蘇木精和曙紅染色，并由不知道處理組的組織病理學(xué)家作評價。
隱窩細胞(crypt cell)的增殖率處死動物1小時前，腹腔注射長春花堿(2mg/kg,Sigma)，以在評估結(jié)腸隱窩細胞增殖(CCPR)前誘導(dǎo)結(jié)腸上皮停滯于分裂中期。計數(shù)每隱窩分裂中期的細胞數(shù)。從每只大鼠中取出結(jié)腸和直腸，縱向切開，在Camoys溶液中固定每只大鼠的粘膜。在解剖顯微鏡下，平緩地縱向擠壓隱窩成片，計數(shù)處于分裂中期的細胞數(shù)(放大率×25)。
統(tǒng)計分析用IBM PC的SPSS統(tǒng)計軟件包，分析體內(nèi)實驗結(jié)果進行Mann Whitney非參數(shù)檢驗。
抗G17(1-9)-DT的長期研究如上所述用大鼠抗G17(1-9)-DT免疫原免疫接種五只雄性大鼠，在單次免疫接種后的34周內(nèi)，測定它們抗體的滴度。在該時間點，給大鼠第二次注射大鼠抗G17(1-9)-DT加強免疫。圖1顯示了研究結(jié)果。圖1顯示了用500μg/ml大鼠抗G17(1-9)-DT免疫接種大鼠后40周，大鼠抗體滴度隨時間的變化。每點代表一個動物。如上述，用1∶100血清稀釋液作ELISA試驗測量抗體滴度。箭頭所指為免疫接種。在第一次免疫接種后，5只大鼠中的4只對大鼠抗G17(1-9)-DT免疫原有應(yīng)答。在單次注射后，第7周在5只大鼠中的3只測到了抗體，第9周在5只大鼠的4只中測到了抗體。在第一次抗體驟增后15-20周之間又有第二次驟增，第二次驟增后抗體滴度平穩(wěn)下降，在第34周達到0。在該時間點，圖1也顯示了在第二次用大鼠抗G17(1-9)-DT免疫接種后，所有大鼠在免疫接種后的1-2周都可測到抗大鼠G-17抗體滴度。
實施例2
對長期抗G17(1-9)-DT免疫接種的大鼠的組織學(xué)分析如實施例1，用蘇木精和曙紅染色后，從組織學(xué)上評估了胃、結(jié)腸和直腸的標(biāo)本。將其與年齡和性別相匹配的對照大鼠作比較。從纖毛(villae)長度/隱窩/粘膜厚度來看，用抗G17(1-9)-DT治療的大鼠和年齡匹配對照大鼠的腸胃道都是相同的。胃中，這兩個動物組的腸嗜鉻細胞樣(ECL)在數(shù)量和外觀上都相似。然而，在抗G17(1-9)-DT治療大鼠胃粘膜中存在G細胞顆?；?granulation)的某些證據(jù)。
實施例3長期抗G17(1-9)-DT免疫接種的大鼠結(jié)腸上皮隱窩細胞的增殖率(CCPR)如上所述，分析了結(jié)腸上皮的CCPR和抗大鼠G17抗體滴度。表1顯示了所評價的5只大鼠中的4只CCPR與抗大鼠G17抗體滴度比較得到的結(jié)果。對照大鼠的平均CCPR為18.93(標(biāo)準差為3.2)，抗G17(1-9)-DT免疫接種的大鼠為23.7(標(biāo)準差為7.9)?？笹17(1-9)-DT免疫接種的和年齡匹配對照大鼠之間CCPR沒有統(tǒng)計學(xué)差異。這些結(jié)果表明對照和抗G17(1-9)-DT免疫大鼠的結(jié)腸上皮中隱窩細胞分裂率相同。
表1抗大鼠G17:DT抗體滴度與結(jié)腸隱窩細胞增殖的比較

實施例4細胞毒性處理先后對大鼠抗G17(1-9)-DT誘生抗體水平的作用如實施例1所述，在免疫接種抗G17(1-9)-DT前或后，以1∶1比例將5-FU/甲酰四氫葉酸(30mg/kg)靜脈注射入大鼠。每組大鼠由6只雄鼠和6只雌鼠組成，用1∶1000稀釋的血清作ELISA測量平均抗體滴度。如實施例1所述，測量每只大鼠血樣的抗體水平。
圖2顯示了用30mg/kg5-FU/甲酰四氫葉酸進行多輪先和后細胞毒藥物治療對抗G17(1-9)-DT免疫接種(500mg/ml)產(chǎn)生的抗體滴度的作用。在圖中數(shù)據(jù)如下顯示-□-無細胞毒藥物治療，7次免疫接種；-◆-在4次細胞毒藥物治療前有2次免疫接種；-○-在4次細胞毒藥物治療前有1次免疫接種；-△-在4次免疫接種前有1次細胞毒藥物(免疫接種期中有2次細胞毒藥物治療)；-田-在4次免疫接種前有2次細胞毒藥物治療；-*-在3次免疫接種前有3次細胞毒藥物治療；和-●-在2次免疫接種前有4次細胞毒藥物治療。
圖2顯示了每組6只雄鼠和6只雌鼠的平均值。標(biāo)準差在平均值10％上下。與未用抗G17(1-9)-DT免疫接種的大鼠相比，用細胞毒藥物治療5-FU/甲酰四氫葉酸先處理的聯(lián)合治療對抗體滴度無顯著作用，無論是所達到的抗體水平還是達到這些水平所需的時間。評價的最大治療輪數(shù)是4次細胞毒藥物治療然后作2次免疫接種。
圖3顯示了治療對BDIX大鼠的血白細胞(WBC)計數(shù)的作用。
圖3顯示了用30mg/kg 5-FU/甲酰四氫葉酸進行BDIX大鼠(接受4次細胞毒藥物治療然后再接受2次免疫接種)的細胞毒藥物治療處理對血白細胞(WBC)計數(shù)平均值的影響。如圖所示，在細胞毒藥物治療后，評價的代表性大鼠中WBC計數(shù)有顯著的減少(p＜0.005,Students’t-檢驗)。多輪細胞毒藥物治療減少了該讀數(shù)，表示有骨髓抑制。然而，對大鼠產(chǎn)生的抗G17(1-9)-DT的抗體應(yīng)答沒有影響。如圖2所示。
實施例55-FU甲酰四氫葉酸和抗G17(1-9)-DT聯(lián)合治療對體內(nèi)DHDK12腫瘤生長的作用如上述實施例，通過與對照組動物的腫瘤相比較，測試了5-FU/甲酰四氫葉酸(12.5-30mg/kg)和大鼠抗G17(1-9)-DT(200μg/ml)聯(lián)合治療對BDIX大鼠腹壁肌肉層中的大鼠結(jié)腸腫瘤DHDK 12細胞系生長的作用。在治療結(jié)束后處死大鼠，用標(biāo)準方案切除腫瘤并稱重。每組由10-12只大鼠(混合性別)組成。腫瘤重量的中值在各柱上方用四分位差表示。如實施例1所述，用Mann Whitley U非參數(shù)檢驗進行統(tǒng)計學(xué)評價。
圖4和圖5顯示了抗G17(1-9)-DT免疫接種對腹壁肌肉層中植入DHDK 12腫瘤細胞的BDIX大鼠的腫瘤最終重量中值的作用。該植入途徑導(dǎo)致了血管化良好的腫瘤可順從血循環(huán)給藥的治療方法(Watson,1996)。已顯示當(dāng)給予500μg/ml劑量時，大鼠抗G17(1-9)-DT能夠抑制56.5％最終DHDK 12腫瘤的重量(Watson,1996)。在本實驗中，為了測定用5-FU/甲酰四氫葉酸聯(lián)合治療的好處，將抗G17(1-9)-DT的劑量降低到200μg/ml，其導(dǎo)致了如圖4所示的顯著抑制了25.7％的腫瘤生長。圖4顯示了未治療對照大鼠、抗G17(1-9)-DT免疫接種大鼠和DT免疫接種大鼠切除的腫瘤數(shù)據(jù)。50天后，未治療大鼠腫瘤重量的中值為4.43g。DT免疫接種導(dǎo)致的腫瘤重量中值為4.7g，這與未治療大鼠的腫瘤重量無顯著性差異，但顯著大于抗G17(1-9)-DT免疫接種大鼠腫瘤重量中值(3.49g,p=0.034,Mann Whitney)。
圖5顯示，單用5-FU/甲酰四氫葉酸(30mg/kg)能顯著減少腫瘤重量到中值1.01g(p=0.0106，當(dāng)與未治療大鼠相比)。當(dāng)大鼠用相同細胞毒性劑量的5-FU/甲酰四氫葉酸和DT免疫接種時，腫瘤重量中值無顯著性差異(0.945g)。
用5-FU/甲酰四氫葉酸(30mg/kg)和大鼠抗G17(1-9)-DT免疫接種聯(lián)合治療，導(dǎo)致的腫瘤重量中值為0.68g，這與5-FU/甲酰四氫葉酸/DT治療組(p=0.27)沒有明顯的區(qū)別。25mg/kg 5-FU/甲酰四氫葉酸和DT免疫接種聯(lián)合產(chǎn)生的腫瘤重量中值為0.96g，與之相比，抗G17(1-9)-DT免疫接種和5-FU/甲酰四氫葉酸聯(lián)合治療組產(chǎn)生的腫瘤重量平均值為0.68g(無明顯差異(p=0.409))。當(dāng)5-FU/甲酰四氫葉酸的劑量減到20mg/kg時，5-FU/甲酰四氫葉酸/DT免疫原聯(lián)合導(dǎo)致的腫瘤重量中值為1.23g。當(dāng)20mg/kg 5-FU/甲酰四氫葉酸與抗G17(1-9)-DT免疫接種聯(lián)合時，腫瘤重量中值顯著減少到0.71g(p=0.027,Mann Whitney)。
最后，圖5也顯示了12.5mg/kg 5-FU/甲酰四氫葉酸與抗G17(1-9)-DT免疫接種聯(lián)合(p=0.015,Mann Whitney)導(dǎo)致的腫瘤重量中值從1.34g減少到0.41g。比較了在聯(lián)合中用12.5、20或30mg/kg 5-FU/甲酰四氫葉酸的5-FU/甲酰四氫葉酸-抗G17(1-9)-DT聯(lián)合，它們之間不存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異。
由于用5-FU/甲酰四氫葉酸聯(lián)合化療顯示在晚期癌和(特別是)輔佐治療方法中有限的益處(Moertel,1994；Scheithauer,1995；Taylor,1993；Petrioli,1995)，需要一種新的治療性藥政，可以聯(lián)合5-FU/甲酰四氫葉酸來提高治療指數(shù)(以及可能減少化療劑量限制毒性)，或當(dāng)化療無效時作為二線療法。這種新療法必須順從這種用途。聯(lián)合化療的免疫療法先前被認為是有問題的，因為化療劑相關(guān)的骨髓抑制，如用5-FU/甲酰四氫葉酸所見(Mahood,1991)。然而，在本研究中按Asao等人的誘導(dǎo)大鼠骨髓抑制的最大可耐受劑量5-FU/甲酰四氫葉酸(30mg/kg)給藥，不影響抗大鼠G17:DT抗體滴度的水平和達到此水平所需的時間(在用抗G17(1-9)-DT免疫原免疫接種后)。
在用5-FU/甲酰四氫葉酸聯(lián)合抗G17(1-9)-DT的治療研究中，20mg/kg和12.5mg/kg的劑量就實現(xiàn)了增強作用。當(dāng)與抗G17(1-9)-DT聯(lián)合時，20mg/kg的劑量和最大耐受劑量一樣有效，12.5mg/kg的劑量顯示出更大治療效果的趨勢。后一趨勢的原因未知，但可能是因為該細胞毒性劑量比較高的劑量水平對免疫系統(tǒng)的影響程度較小，這可能有助于對腫瘤的全身性炎癥反應(yīng)。連續(xù)多輪給予5-FU/甲酰四氫葉酸將表現(xiàn)為對腫瘤生長“有全部或無任何”作用，就象已發(fā)現(xiàn)劑量降低到1mg/kg時不抑制腫瘤生長那樣。通過減少給予毒性劑的輪數(shù)，可以逐步滴定出治療效果(Watson,Personal communication)。所以，本發(fā)明的聯(lián)合治療可以給予低于通常劑量的5-FU/甲酰四氫葉酸，從而減少該藥物的副作用，同時可用本發(fā)明的聯(lián)合方法有效殺死腫瘤細胞，因為免疫系統(tǒng)只受到極小的影響。所以，提高了抗G17(1-9)-DT免疫接種對腫瘤生長的抑制作用。從化療劑本身的骨髓抑制作用來看，本聯(lián)合治療的這些特性是出乎意外的和令人驚訝的。
另外，由于對宿主沒有有害的作用，如接受單針免疫接種的大鼠中存在的可測抗體水平的時間長度所示，抗G17(1-9)-DT免疫接種可以作為長期療法。第一次免疫接種顯示80％的有效性(根據(jù)抗胃泌素抗體的誘導(dǎo))，第二次免疫接種后為100％的有效性(抗體水平立即升高)。雖然單次注射抗G17(1-9)-DT可能增強化療的效果，在大部分宿主中沒有副作用，但抗G17(1-9)-DT免疫接種的特征和加強免疫后宿主應(yīng)答的速度表明多次注射的治療方案可能是理想的。如簡單的組織學(xué)估測定的那樣，除了抗大鼠G17抗體在循環(huán)中可維持長時間外，看來對腸胃道沒有長期有害影響。另外，結(jié)腸粘膜細胞的隱窩細胞增殖指數(shù)揭示對它們的生長沒有明顯的影響。
實施例6用5-FU/甲酰四氫葉酸和抗G17(1-9)-DT聯(lián)合治療人結(jié)腸癌患者的療法先前已顯示了單用抗G17(1-9)-DT免疫接種在胃泌素依賴性癌的治療中是有價值和安全的。本文的抗G17免疫原和5-FU/甲酰四氫葉酸聯(lián)合提高了癌癥治療的有效性，尤其是對結(jié)腸癌的治療，而且在聯(lián)合治療中可以減少所需化療劑的劑量這將減少現(xiàn)用任何化療劑的有害細胞毒副作用。本發(fā)明的免疫原和化療劑的聯(lián)合也可用作對單用化療無反應(yīng)的患者的二線治療。
用化療和免疫療法聯(lián)合治療人結(jié)腸直腸腫瘤或結(jié)腸癌的患者。
具體地說，可以同時給予5-FU/甲酰四氫葉酸和抗G17免疫原組合物或抗G17抗體來治療胃泌素反應(yīng)性結(jié)腸直腸腫瘤或結(jié)腸癌患者。
確切的說，該較佳的免疫療法提供了一種免疫原性組合物，其包含一個氨基端G17(1-9)肽:DT偶聯(lián)物與藥學(xué)上可接受的載體，還可以包括佐劑來進一步刺激免疫應(yīng)答。
該較佳的免疫療法可根據(jù)臨床考慮在化療之前、之間或之后開始。例如，對于患巨大腫瘤(large tumor burden)的患者，較佳的是先進行幾輪化療來減小腫瘤塊，然后再開始免疫治療。
另外，對于小腫瘤的患者或在治療性手術(shù)后，可以在化療之前或之間進行免疫治療。
抗G17免疫原的主動性免疫接種的劑量范圍可在300μg到1200μg之間，取決于患者的免疫狀態(tài)(或免疫應(yīng)答的能力)。注射間隔可以在第1、7和14天或第1，14和21天或第1、14天然后是28和56天。所有的日程表均可產(chǎn)生類似的抗體滴度。加速的免疫接種日程表提供了更早引發(fā)免疫應(yīng)答的可能性。
抗胃泌素治療的較佳方法是，無論用何種方案，在首次免疫接種后，每6個月給予一次加強免疫。
有效中和G17、Gly G17和G17 NH2的另一個較佳的方法是用抗G17抗體，較佳的是以純化的形式被動免疫接種。更具體地說，為了控制胃泌素活性在多輪化療之前、之間和/或之后，接種10-1000μg抗G17(1-9)抗體。該被動接種可以每天、每周或每兩周進行?？筛鶕?jù)治療的有效性決定隨后采用其它方案。
另一種治療聯(lián)合方案是在首輪化療之前和/或之間提供首次動免疫接種，然后如上所述進行主動免疫接種。
許多化療治療方案正在使用。這些本領(lǐng)域認可的方案，雖然本文沒有描述，但也包括在本發(fā)明的聯(lián)合療法中。一種較佳的化療方案是靜脈注射425mg/m2的5-FU丸藥并靜脈輸注甲酰四氫葉酸(葉酸，F(xiàn)A,20mg/m2)1-5天，治療期可達4周。
另一較佳的治療方案是在2小時期間內(nèi)給予200mg/m2FA，然后在2周內(nèi)的1或2天靜脈注射400mg/m25-FU丸藥+在22小時期間給予5-FU 600mg/m2。
另一較佳治療方案是以每天250-300mg/m2的劑量和靜脈注射方式連續(xù)輸注5-FU 4-6周，然后休息2周。
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1．一種治療患者腫瘤的方法，其特征在于，包括免疫中和腫瘤生長因子和給予患者有效劑量的一種或多種化療劑。
2．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的腫瘤是胃泌素依賴性腫瘤。
3．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的腫瘤生長因子是胃泌素。
4．一種用聯(lián)合療法治療胃泌素依賴性腫瘤的方法，其特征在于對需要所述治療的哺乳動物給予有效劑量的抗胃泌素17免疫原，并聯(lián)合一種或多種化療劑。
5．如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的抗胃泌素G17免疫原與白喉類毒素偶聯(lián)。
6．如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的抗胃泌素G17免疫原還含有間隔肽。
7．如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的抗胃泌素G17免疫原含有由氨基酸序列pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu(序列表中的SEQ ID NO:1)組成的肽。
8．如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的化療劑是5-氟尿嘧啶和甲酰四氫葉酸。
9．如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的抗胃泌素G17免疫原在給予5-氟尿嘧啶和甲酰四氫葉酸化療前給予。
10．如權(quán)利要求4或9所述的方法，其特征在于，所述的化療劑在治療過程中以幾輪給藥。
11．如權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括給予一次或多次加強免疫接種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療胃泌素依賴性腫瘤的聯(lián)合療法。該方法包括對患者免疫接種抗胃泌素(17)免疫原性組合物并聯(lián)合給予化療劑如5－氟尿嘧啶和甲酰四氫葉酸。
文檔編號A61K39/00GK1303288SQ99806011
公開日2001年7月11日 申請日期1999年5月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月15日
發(fā)明者P·C·赫法斯, S·格蘭姆斯, S·L·卡爾, S·A·沃森, D·米凱利 申請人:埃弗頓有限公司