專利名稱：調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的傳送系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明在總體上涉及通過施用微膠囊化抗原選擇和／或選擇性地調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法。
免疫系統(tǒng)是細(xì)胞、組織和器官的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，它直接或間接地指向并最終破壞外來物質(zhì)。在增強(qiáng)免疫應(yīng)答所涉及的多種細(xì)胞中，淋巴細(xì)胞是一種有重要作用的白細(xì)胞。一種淋巴細(xì)胞是B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)，它通過激起體液免疫應(yīng)答而產(chǎn)生對(duì)抗特異抗原的抗體，來靶向并間接破壞外來物質(zhì)。另一種淋巴細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)，它通過激起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答而靶向并直接殺死外來物質(zhì)。有三種主要的T細(xì)胞亞型，分別為T輔助細(xì)胞、T抑制細(xì)胞和T細(xì)胞毒性細(xì)胞。T輔助細(xì)胞包括兩種TH1和TH2細(xì)胞。TH2細(xì)胞幫助B細(xì)胞激起體液免疫應(yīng)答，并通過產(chǎn)生T細(xì)胞毒性細(xì)胞所需的生長因子幫助T細(xì)胞毒性細(xì)胞維持它們自己。TH2細(xì)胞表達(dá)CD4糖蛋白抗原。T抑制細(xì)胞阻止或抑制T輔助細(xì)胞；它們表達(dá)CD8糖蛋白抗原。T細(xì)胞毒性細(xì)胞，也被稱為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，表達(dá)CD8糖蛋白抗原，并是T細(xì)胞的一個(gè)分支，該T細(xì)胞通過直接接觸靶細(xì)胞而殺死表達(dá)特異性抗原的細(xì)胞。前-CTL是將被定型為CTL細(xì)胞譜系的T細(xì)胞，它們已經(jīng)經(jīng)歷胸腺成熟并對(duì)某種特定的抗原有特異性，但是缺乏細(xì)胞溶解功能。CTL在以下三種情形下是重要的效應(yīng)細(xì)胞(1)非吞噬細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)感染或并沒有被吞噬作用所完全包括的感染如病毒感染；(2)由細(xì)菌如單核細(xì)胞增多性李斯特菌引發(fā)的感染；和(3)急性同種移植物排斥反應(yīng)和腫瘤排斥反應(yīng)。
免疫原應(yīng)答在用蛋白質(zhì)作為免疫原時(shí)最為可預(yù)料。在免疫治療中，蛋白質(zhì)通常是經(jīng)非腸道途徑施用，例如注射。由于胃中存在蛋白酶和酸、小腸中存在酶，它們可降解口服的蛋白質(zhì)，因此盡管注射對(duì)于一部分患者來說不方便和不舒服，但它仍成為一種普遍的施用途徑。結(jié)果顯示，口服可溶解的蛋白質(zhì)如典型抗原白蛋白(OVA)，可導(dǎo)致誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫耐受，它以喪失抗體或T細(xì)胞對(duì)蛋白免疫原的應(yīng)答為特征。然而據(jù)美國專利No．5，591，433所公開，免疫活性生物分子和其他的治療蛋白質(zhì)可口服，這是通過將蛋白質(zhì)微囊化和對(duì)微球進(jìn)行包衣以形成pH-敏感的腸溶衣包被的微球顆粒，來抵抗消化蛋白溶解酶和酸的作用。在上述專利中公開的微球包括與惰性顆粒連接的蛋白，惰性顆粒的顆粒尺寸為其直徑約為30-35目(約600μm到約500μm)，并被對(duì)酸穩(wěn)定的多聚體所包被。然而，需要的是從復(fù)雜的免疫功能中更好地選擇和選擇性地調(diào)節(jié)特定的免疫應(yīng)答的方法，以在需求治療的不同環(huán)境中更好地對(duì)不同的抗原刺激物產(chǎn)生反應(yīng)。
例如，當(dāng)前的腫瘤治療包括化療、放療和手術(shù)切除一些或所有的實(shí)體瘤的組合。每一種治療的機(jī)制都是以去除惡性腫瘤細(xì)胞為目標(biāo)，但都以破壞非惡性細(xì)胞為其運(yùn)行代價(jià)。因而，這些治療都沒有運(yùn)用身體自身摧毀細(xì)胞的能力，即免疫系統(tǒng)和特別是細(xì)胞毒性T細(xì)胞，來殺死惡性細(xì)胞。增加免疫應(yīng)答和／或選擇性地刺激細(xì)胞毒性T細(xì)胞數(shù)量的方法因而是對(duì)傳統(tǒng)治療方法的有益的補(bǔ)充。并且，這樣的方法可在沒有化療藥物、放射或手術(shù)副作用的情形下運(yùn)用。然而癌細(xì)胞卻不能被免疫系統(tǒng)確認(rèn)為外來物質(zhì)，因而不能作為被摧毀的靶子。腫瘤治療發(fā)展的一個(gè)目標(biāo)就是刺激免疫系統(tǒng)使其對(duì)癌細(xì)胞能產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在三種主要的T細(xì)胞類型中，T細(xì)胞毒性細(xì)胞經(jīng)常直接地指向靶子并摧毀癌細(xì)胞。因此，選擇性地增加T細(xì)胞毒性細(xì)胞亞型可能是一種制約不受調(diào)節(jié)的細(xì)胞分裂的有益方法，而不受調(diào)節(jié)的細(xì)胞分裂正是癌細(xì)胞的標(biāo)志。
作為另一個(gè)例子，T細(xì)胞毒性細(xì)胞也能直接靶向和摧毀細(xì)胞外感染性疾病因子和在受感染的細(xì)胞中的感染疾病因子。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫包括兩種類型的反應(yīng)。第一種類型是巨噬細(xì)胞活化作用導(dǎo)致被吞噬的微生物被殺死。第二種類型是感染細(xì)胞被CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)溶解。個(gè)體間對(duì)細(xì)胞內(nèi)微生物免疫應(yīng)答類型的差異，例如在HIV感染中，是疾病進(jìn)程和臨床結(jié)果的重要決定因素。選擇性地增加T細(xì)胞毒性細(xì)胞亞型可能被用來治療感染性疾病。
因此需要能更好地調(diào)節(jié)和／或選擇性地刺激免疫應(yīng)答的方法和組合物。如此的方法和組合物將能在免疫治療或基因治療中找到廣泛的用途，治療的疾病包括過敏、感染性疾病、癌癥、移植排斥和自身免疫病。如此的方法和組合物也將是對(duì)當(dāng)今這些疾病的治療方法有益的預(yù)防和／或治療性補(bǔ)充。
發(fā)明概述本發(fā)明提供能誘導(dǎo)一般性或選擇性免疫應(yīng)答增強(qiáng)的方法和組合物。一種免疫原傳送系統(tǒng)含有結(jié)合于惰性粒子上的免疫原的微球，其中惰性粒子的顆粒尺寸為大于35目。微球被施用到哺乳動(dòng)物的小腸。優(yōu)選地，微球通過口服施用并含有一層或多層腸溶衣，可在膠囊中被施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，惰性粒子的顆粒尺寸為大于40目，并可是nonpareil、硅石粉、鹽結(jié)晶或糖結(jié)晶。
應(yīng)答可能包括TH1細(xì)胞、TH2細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)亞類數(shù)量的總體增加，或從TH2類型的應(yīng)答到TH1類型應(yīng)答的選擇性的增強(qiáng)的轉(zhuǎn)變，或從TH1類型的應(yīng)答到TH2類型應(yīng)答的選擇性的增強(qiáng)的轉(zhuǎn)變，或從前-CTL到CTL的增強(qiáng)的分化。免疫原可以是多肽、蛋白片段、DNA、和／或RNA，可以是基因、基因片段或疫苗。
免疫原可通過含有許多可選擇性地誘導(dǎo)特定免疫應(yīng)答的微球的劑量復(fù)合體和／或劑量組合物來施用。一定劑量的微球可含有相同的或不同的腸溶衣、相同的或不同的配方、和／或相同的惰性粒子核心組成和大小、或各種不同的核心組成和大小。在單一的惰性粒子或各獨(dú)立的惰性粒子中，免疫原也可與一種增效試劑一起施用。如果在單一惰性粒子中與免疫原和增效試劑一同配制，施用劑量中的不同的各個(gè)惰性粒子就可能具有相同的或不同的腸溶衣、相同的或不同的配方、和／或相同的惰性粒子核心組成和大小、或各種不同的核心組成和大小。同樣地，如果在各獨(dú)立的惰性粒子中與免疫原和增效試劑一起配制，施用劑量中的各獨(dú)立微球也可能具有相同的或不同的腸溶衣、相同的或不同的配方、和／或相同的或不同的惰性粒子核心組成和大小。
將被認(rèn)識(shí)到的是，本文公開的傳送系統(tǒng)和運(yùn)用該系統(tǒng)的方法具有廣泛的用途。本發(fā)明的這些和其他優(yōu)點(diǎn)將要被下面的圖示、詳細(xì)描述和實(shí)施例進(jìn)一步說明。
圖示的簡要描述

圖1是卵清蛋白(OVA)的不同施用模式對(duì)初級(jí)淋巴細(xì)胞增殖的效果圖。
圖2A是淋巴增殖分析的結(jié)果圖，應(yīng)用含有OVA、佐劑中的OVA的微球或作為安慰劑的微球。圖2B是應(yīng)用非特異性促細(xì)胞分裂素刺激物伴刀豆蛋白A(ConA)的結(jié)果圖。
圖3A是用在體外皮下施用含有OVA和佐劑的微球進(jìn)行刺激的效果圖，圖3B是口服含有OVA的微球的效果圖。
圖4是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在不同的效應(yīng)物靶(ET)比例下的應(yīng)答圖。
圖5表示用單克隆抗體處理以去除效應(yīng)T細(xì)胞亞群后對(duì)用OVA微球免疫的小鼠腎細(xì)胞的CTL活性的作用。圖5A表示在效應(yīng)物對(duì)靶的比例是40∶1時(shí)的CTL活性。圖5B表示在效應(yīng)物對(duì)靶的比例是20∶1時(shí)的CTL活性。
本發(fā)明的詳細(xì)描述術(shù)語的定義術(shù)語免疫原或抗原在此廣泛地應(yīng)用，包括任何當(dāng)施用于哺乳動(dòng)物時(shí)能引起免疫應(yīng)答的化學(xué)或生物學(xué)物質(zhì)。盡管免疫原經(jīng)常是蛋白質(zhì)，但它也可是核酸。在本發(fā)明中，免疫原包括但不限于下列物質(zhì)過敏原蛋白和其消化片段如從豚草屬、黑麥、六月草、鴨茅、黃花草、紅頂草、梯牧草、黃酸模、小麥、玉米、北美艾灌叢、早熟禾、Californiaannual grass、藜、百慕大草、俄羅斯薊、山地雪松、橡樹、白蠟樹、美國梧桐、楓樹、榆樹和其他中得到的花粉過敏原，塵土、螨、蜜蜂和其他昆蟲毒物、食物過敏原、動(dòng)物頭皮屑、微生物疫苗，后者又包括病毒、細(xì)菌、原生生物、線蟲和蠕蟲疫苗和它們的多種組分如表面抗原，包括從如下列生物中得到的含有糖蛋白或蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、基因或基因片段的疫苗金黃色葡萄球菌、釀膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌、沙門桿菌菌種、志賀氏菌菌種、大腸桿菌、克雷伯氏菌菌種、變形菌菌種、霍亂弧菌、Helicobacterpylori、Pseudomonas aeruginosa、流感嗜血菌、百日咳博德特氏菌、結(jié)核分枝桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌、蒼白密螺旋體、和衣原體菌種、破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、流感病毒、腺病毒、副粘病毒、風(fēng)疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、乙肝病毒、皰疹病毒、狂犬病病毒、人體免疫缺陷病毒、乳頭瘤病毒，還有原生生物寄生蟲如鼠弓形體、隆凸肺囊蟲、梨形鞭毛蟲、陰道梨形蟲、腹球蟲、腸絨毛蟲、人體酵母菌、和不同種的內(nèi)阿米巴、阿米巴、瘧原蟲、利什曼、錐蟲、巴倍蟲、隱擔(dān)孢子、肌囊蟲和Cyclospora，還有線蟲和不同種類的吸蟲、滌蟲和內(nèi)臟幼蟲。
免疫原可作為治療或預(yù)防劑施用來誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在此使用時(shí)，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答包括激起免疫應(yīng)答和調(diào)節(jié)、選擇性地刺激，和／或增強(qiáng)總的或選擇性的免疫應(yīng)答。治療免疫原在此被定義為減輕病理狀況或疾病的物質(zhì)?？稍诒景l(fā)明中應(yīng)用的治療劑包括但不限于免疫原試劑和基因治療劑。預(yù)防劑在此被定義為可阻止或減輕隨后的獲得性疾病或病理過程的嚴(yán)重性的物質(zhì)。預(yù)防劑的一個(gè)例子是抵抗能帶來感染性疾病的微生物的疫苗。微球制劑當(dāng)在此應(yīng)用時(shí)，除非特別說明，所有的百分?jǐn)?shù)都以組分重量相對(duì)于微球總重量給出。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，制得免疫原的一種水溶液，它含有任選的穩(wěn)定化試劑來對(duì)免疫原提供物理保護(hù)。免疫原水溶液一般是免疫原重量占微球的約0．5％到約10％，并優(yōu)選1％。
穩(wěn)定化試劑通常是治療上非活性的、水溶性的糖，它可在免疫原的制劑和／或后續(xù)包被步驟中保護(hù)免疫原。穩(wěn)定化試劑的例子包括乳糖、甘露醇和海藻糖。穩(wěn)定化試劑以從約0．1％到約10％，并優(yōu)選5％的濃度加入。如果免疫原溶液的粘度較低，可希望加入約1％到10％的聚乙烯吡咯烷酮或其他粘合劑如羥丙基纖維素或羥丙基甲基纖維素，把免疫原結(jié)合到惰性粒子上。
通過例如噴霧的辦法，把一種或多種免疫原和一種選擇性的穩(wěn)定因子結(jié)合到一種藥學(xué)惰性物質(zhì)(下文稱為惰性粒子)上。惰性粒子可能具有多種形狀如珠狀、球狀、粉末、晶體或顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，可用一個(gè)被定義為藥學(xué)惰性物質(zhì)的小球微粒的nonpareil。這樣的nonpareil可在商品名NuPareils(Crompton ＆ Knowles CorpMahwah，NJ)下買到。在其他實(shí)施方案中，可用硅粉、糖結(jié)晶或鹽結(jié)晶。惰性粒子無論是什么形狀的，都有大于35目，優(yōu)選為大于40目，最優(yōu)選地在45到200目之間的顆粒尺寸。
Glatt牌的粉狀包衣顆粒如GPCG-1HS、GPCG-5HS、或GPCG-60HS液體床包衣機(jī)都適用于用來把免疫原包被到惰性粒子上。Wurster型的液體床包衣機(jī)的多種其他品牌(NIRO，Vector，F(xiàn)luid Air，等)也適合于應(yīng)用。包被條件和時(shí)間依設(shè)備和包被粘度的不同而改變；然而，包被一般地必須在溫度低于50℃時(shí)進(jìn)行，而優(yōu)選為低于35℃，以避免蛋白質(zhì)免疫原的變性。
干的免疫原-包被的惰性微粒也優(yōu)選用一層或多層酸穩(wěn)定多聚體包被來形成腸溶衣。這層包被致使免疫原抵抗在胃的酸性環(huán)境下的降解。并且，在小腸中適于選擇性T細(xì)胞應(yīng)答的特定pH條件下，改變腸溶衣的組成和／或量可容許腸溶衣溶解并因而釋放出免疫原。可用與上述包被步驟相似的方式和相似的設(shè)備來制備一種或多種多聚物的包被。
腸溶衣優(yōu)選為水基乳液多聚體如丙烯酸乙酯／甲基丙烯酸共聚合體，以EudragitL-30D(Huls America IncSomerset，NJ)牌出售，其分子量為約250，000，一般以30％W／V的水分散劑。使用其他多聚體包被的例子包括無溶劑的Eudragit L／S 100或羥丙甲基纖維素乙酸琥珀酸酯。腸溶衣使微膠囊化的免疫原可被口服并不被從微球中釋放，直到遇到腸的特別區(qū)域。腸溶衣的化學(xué)組成可被配成在小腸最適宜選擇性T細(xì)胞應(yīng)答的特定pH條件下溶解放出免疫原?；蛘撸c溶衣可被配制為在遇到足夠的機(jī)械的和／或化學(xué)的腐蝕后才釋放出免疫原。
包被組分可與增塑劑聯(lián)合使用以提高包被的連續(xù)性。幾種周知的增塑劑可以應(yīng)用，優(yōu)選檸檬酸三乙基酯(Morflex IncGreensboro，NC)。盡管增塑劑可是液體，但卻并不認(rèn)為它們是溶劑，因?yàn)樗鼈兾挥诎吕锊⒏淖冏约旱奈锢硖匦缘珔s并不溶解蛋白免疫原。溶解或變性免疫原的增塑劑將不被接受。
可加入滑石粉(約3％)以阻止微?；ハ嗾辰?。也可加入消泡劑(約0．0025％)如山梨糖醇倍半油酸酯(Nikko Chemicals Co．LtdJapan)或硅酮。可加入抗靜電劑(約0．1％)如Syloid 74FP(DavidsonChemical Division，Cincinnati，OH)?；?、消泡劑和抗靜電劑只在需要時(shí)才加入。
含有免疫原、任選的穩(wěn)定劑或其他配方成分的惰性粒子被干燥，并可用上述腸溶衣包被。包被溶液是約30％到約75％的聚合體、約0％到約10％的增塑劑、約0％到約3％的滑石粉、約0％到約0．0025％的消泡劑、約0％到約3％的抗靜電劑和水。一般的優(yōu)選方法是在溶液中不加有機(jī)溶劑。有機(jī)溶劑能變性免疫原。增效試劑在另一個(gè)實(shí)施方案中，可加入增效試劑以提高蛋白的免疫原性。增效試劑在此被定義為增強(qiáng)其他免疫原的抗原性的物質(zhì)。因而增效試劑間接地刺激免疫應(yīng)答。增效試劑的例子包括佐劑、生物粘接劑、粘性粘接劑和促進(jìn)劑。佐劑在此定義為任何生物或化學(xué)物質(zhì)，當(dāng)與免疫原施用時(shí)，其能增加對(duì)抗抗原的免疫應(yīng)答。其作用方式或者是在淋巴細(xì)胞暴露于抗原的部位集中抗原，或者是誘導(dǎo)能調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞功能的細(xì)胞因子。佐劑可是治療上可接受的生物化合物、化學(xué)化合物，或者是生物化合物和化學(xué)化合物的聯(lián)合。化學(xué)佐劑的例子是可水分散的無機(jī)鹽如硫酸鋁、氫氧化鋁(alum)和磷酸鋁。生物佐劑的例子外源性細(xì)胞因子是粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)和γ干擾素(IFNγ)、微生物如BCG(bacilleCalmette-Guerin)、小棒桿菌、和百日咳博德特氏菌，細(xì)菌內(nèi)毒素如霍亂毒素B(CTB)、脂多糖(LPS)、和胞壁酰二肽(N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺[MDP])。商業(yè)可得的佐劑如DETOX-PC也是可得的。增效試劑的另一個(gè)例子是半抗原，在此定義為其本身沒有抗原性但當(dāng)與高分子量載體相偶合時(shí)則具有抗原性的低分子量物質(zhì)。生物粘接劑如Lycopersicon esculentum植物凝集素(番茄凝集素，LT)和粘性粘接劑如脫乙酰殼多糖-樣的N-三甲基脫乙酰殼多糖氯化物與糖結(jié)合并在腸的位點(diǎn)-特異區(qū)形成糖聚合物。促進(jìn)劑在此定義為促進(jìn)吸收、運(yùn)輸或呈遞抗原、佐劑或半抗原的配方組分，它因而促進(jìn)期望的免疫應(yīng)答。促進(jìn)劑的例子是糖蛋白、脂蛋白、膽汁鹽、飽和酸、磷脂、糖脂、甘油三酯、膽固醇、環(huán)糊精和甘油及其他。所有上述增效試劑可單獨(dú)或結(jié)合、或作為共價(jià)或非共價(jià)復(fù)合物的部分被摻入進(jìn)微球制劑中。
增效試劑可在包被惰性粒子之前加到水分散體或免疫原的溶液中。或者，增效試劑可加入到非免疫原結(jié)合的惰性粒子上。一般地，加入增效試劑的量為1％到10％。增效試劑可結(jié)合到與結(jié)合免疫原相同的惰性粒子上?；蛘?，增效試劑可與第一個(gè)惰性粒子結(jié)合，免疫原結(jié)合第二個(gè)惰性粒子，這樣，增效試劑就應(yīng)用于與非免疫原結(jié)合的惰性粒子。作用的可能機(jī)理當(dāng)與其他T細(xì)胞類型相比時(shí)，發(fā)現(xiàn)從顆粒尺寸大于35目的惰性粒子得到的的微球能更促進(jìn)和選擇性地刺激T細(xì)胞毒性細(xì)胞。如圖1所示，本發(fā)明的微球具有增效試劑樣的效應(yīng)并且T細(xì)胞的刺激程度隨微球的惰性粒子大小的減少而增加。用含有顆粒尺寸大于35目的微球(空白方框)的卵清蛋白(OVA)經(jīng)口服免疫小鼠，從中分離其腎細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，表明在培養(yǎng)中OVA特異性增殖，比用含有佐劑與OVA的顆粒尺寸小于35目的微球口服免疫的小鼠腎細(xì)胞增殖(實(shí)體方框)要多兩倍，并且其增殖要比用OVA加佐劑DETOX-PC(斜線方框)經(jīng)非腸道免疫的細(xì)胞的增殖多三倍。這表明，口服顆粒尺寸大于35目的微球的免疫對(duì)于抗原特異性的T細(xì)胞增殖具有增效試劑樣的作用。圖4顯示，應(yīng)用連接到顆粒尺寸大于35目的惰性粒子上的腸溶衣包被的免疫原，在選擇T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答上具有增效試劑樣的作用，該作用相當(dāng)于共同施用OVA和DETOX-PC佐劑得到的應(yīng)答。因此，在一些情況下在微球制劑中加入佐劑如氫氧化鋁(alum)或DETOX-PC或其他增效試劑，可能產(chǎn)生對(duì)T細(xì)胞毒性細(xì)胞群落的額外的刺激作用，因而可以較低的免疫刺激藥物的起始劑量，得到相當(dāng)于用較高劑量的免疫刺激藥物得到的免疫應(yīng)答。
盡管這些選擇性刺激的準(zhǔn)確機(jī)理尚不清楚，一個(gè)解釋可能是，較小的腸抗原包被粒子可在膠囊化的抗原和位于哺乳動(dòng)物消化道的適合的免疫細(xì)胞受體系統(tǒng)之間提供增加的接觸點(diǎn)，特別是在集合淋巴結(jié)的擴(kuò)散淋巴組織中。這些小微粒在單位重量下也可含有較高的某種制劑成分，它們中的一些可促進(jìn)抗原呈遞和傳送。然而，其他的解釋也是可能的。微球劑量在應(yīng)用中，將含有免疫原-結(jié)合的惰性粒子(惰性粒子顆粒尺寸大于35目)和用任選的增效試劑包被的腸溶衣的本發(fā)明微球，按劑量程序和組成施用以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，所述組成由上述尺寸和組成不同置換而成。優(yōu)選微球通過管飼法或喂食來口服施用，或者也可經(jīng)非腸道施用，如皮下注射。劑量可是連續(xù)的或間斷的并在不同的時(shí)間和不同的配方下施用。當(dāng)在此使用時(shí)，配方包括微球不同百分比的組合物和不同的生理化學(xué)組成，例如尺寸、包衣、聚合體、增塑劑、抗粘試劑、消泡劑、抗靜電劑、增效試劑和賦形劑。
例如，施用的劑量可包括許多單個(gè)惰性粒子，其中每個(gè)惰性粒子含有一種或多種免疫原和增效試劑(如果加入)。如果制劑為單一惰性粒子，施用劑量中的不同的單個(gè)微球可含有相同的或不同的腸溶衣、相同或不同的多聚物、增塑劑、粘合劑、抗粘試劑、消泡劑、抗靜電劑、增效試劑和賦形劑的配方，和／或相同的或不同的惰性核心組成和尺寸。或者，劑量可被配制成含有惰性粒子和一種或多種免疫原(如果加入，在各獨(dú)立的惰性粒子中還有增效試劑)的聯(lián)合。如果在各獨(dú)立的惰性粒子中和免疫原與增效試劑一起配制，施用劑量中的各獨(dú)立微球可含有相同的或不同的腸溶衣、相同或不同的多聚物、增塑劑、粘合劑、抗粘試劑、消泡劑、抗靜電劑、增效試劑和賦形劑的配方，和／或相同的或不同的惰性核心組成和尺寸。這些惰性粒子的尺寸、組成、腸溶衣和配方組分的不同的排列組合可幫助施用的微球沿著腸達(dá)到抗原的選擇分布和呈現(xiàn)。
微球可被置于凝膠膠囊中讓人和動(dòng)物口服。劑量將依賴于個(gè)體和治療過程。當(dāng)應(yīng)用含有豚草作為抗原的本發(fā)明的微球進(jìn)行治療時(shí)，劑量將是約0．03到約35單位，以主要的過敏原蛋白Amb-a-1計(jì)，每天施用。過敏原的劑量與注射免疫治療中應(yīng)用的劑量可不同。應(yīng)用在應(yīng)用中，含有腸溶衣抗原和任選的增效試劑的本發(fā)明的微球有很多用途。例如，含有糖蛋白、蛋白、蛋白片段、多肽、或來自微生物、病毒或寄生蟲的基因片段微球，對(duì)于典型的用來治療感染疾病的抗微生物、抗病毒、抗寄生蟲的藥劑將是有價(jià)值的預(yù)防和／或治療輔助手段。作為另一個(gè)例子，從HER-2／neu癌基因的“自我-蛋白質(zhì)”中而來的含有非決定區(qū)表面抗原決定族的肽片段可被用做本發(fā)明微球中的免疫原，來提高癌癥疫苗的有效性，這是通過打斷對(duì)過度表達(dá)的腫瘤蛋白質(zhì)的耐受實(shí)現(xiàn)的。此作用將特別地有價(jià)值，因?yàn)镠ER-2／neu是“自我”蛋白質(zhì)，并因而不引發(fā)免疫應(yīng)答。通過在本發(fā)明的微球中應(yīng)用含有非決定區(qū)表面抗原決定族的肽段而不是整個(gè)蛋白質(zhì)(Disis等，J．Immunol1996156，3151-3158)，一種癌疫苗能引發(fā)T細(xì)胞毒性細(xì)胞針對(duì)“自我”腫瘤抗原的應(yīng)答。作為另一個(gè)例子，免疫原可是過敏原，它增加TH1型的應(yīng)答并因而增加典型的TH1細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-β(TNF-β)和白介素-2(IL-2)，它們可進(jìn)一步降低在如哮喘的過敏條件下的感染。
本發(fā)明將由下述實(shí)施例做進(jìn)一步的說明。
OVA蛋白被包被到惰性粒子上，用含有生物可降解的聚甲基丙烯酸共聚物(Eudragit L30D)的水腸包被系統(tǒng)把抗原膠囊化。惰性粒子是約45目的Nupareils。免疫從Taconic Farm(Germantown，NY)得到六到八周齡的C57BL／6(H-2Kb)雌性小鼠。免疫小鼠，方法是通過皮下注射乳化在DETOX-PC佐劑(RIBI ImmunoChem Research，Hamilton，MT)中的30μg OVA蛋白，或者經(jīng)口腔通過飼管插到喉嚨后部飼喂含有200μgOVA的微球。對(duì)照組小鼠口服安慰劑微球。在第0、14和28天進(jìn)行三次系列免疫。在最后一次免疫三周后處死動(dòng)物。淋巴增殖在它們第三次免疫后21天從免疫的動(dòng)物體內(nèi)取腎，通過70μm尼龍細(xì)胞過濾器(Falcon；Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)機(jī)械分散細(xì)胞以得到單個(gè)細(xì)胞懸浮液。通過Ficoll-Hypaque梯度(d=1．119g／cm)離心除去死細(xì)胞和紅細(xì)胞。然后把腎的單核細(xì)胞通過尼龍羊毛柱(Robbins Scientific CorpSunnyvale，CA)從收獲的細(xì)胞群落富集T細(xì)胞。富集的T細(xì)胞用完全培養(yǎng)液(RPMI1640，輔以10％FCS、15mMHEPES緩沖液，2mM谷氨酰胺、0．1mM非必需氨基酸，50單位／毫升盤尼西林，50單位／毫升鏈霉素、50μM 2-巰基乙醇和1mM丙酮酸鈉)清洗，并分散在96-孔平底微滴定板(Falcon；Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ)上，濃度為1×105／孔。
然后在有作為抗原呈遞細(xì)胞(APC)的自身同源腎細(xì)胞存在下(5×105／孔)溫育淋巴細(xì)胞。接受刺激的孔含有OVA蛋白(100μg／ml)、OVA257-264肽(100μg／ml)或伴刀豆蛋白(Con A；2．5μg／ml)，對(duì)照孔只在完全培養(yǎng)基中含有T細(xì)胞和APC。所有培養(yǎng)物的最終體積為200μl，并在37℃、5％ CO2下培養(yǎng)2天(Con A)或5天(抗原刺激物)。在最后的18到24小時(shí)，用1μCi／孔的[3H]胸腺嘧啶(DuPont NewEngland Nuclear，Wilmington，DE)脈沖標(biāo)記培養(yǎng)物。用PHD細(xì)胞收獲器(Cambridge Technology，Cambridge，MA)收獲細(xì)胞，用液閃計(jì)數(shù)器(LS 6000IC，Duarte，CA)定量測(cè)定摻入的放射性。平均三個(gè)孔的結(jié)果，報(bào)告為刺激指數(shù)(SI)，其計(jì)算公式為SI=被刺激的孔(cpm)／對(duì)照孔(cpm)CTL的體外刺激初級(jí)CTL培養(yǎng)物從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組收獲腎細(xì)胞(25×106)，混合每個(gè)組三只動(dòng)物的腎細(xì)胞，在25cm2垂直燒瓶中用10ml完全RPMI培養(yǎng)基(10％FCS、15mM HEPES緩沖液，2mM谷氨酰胺、0．1mM非必需氨基酸，50單位／毫升盤尼西林，50單位／毫升鏈霉素、50μM 2-巰基乙醇和1mM丙酮酸鈉)溫育，條件是37℃、5％ CO2，并在5μg／ml OVA257-264肽的存在下。長期CTL系七天后收獲初級(jí)CTL培養(yǎng)物，通過Ficoll梯度(d=1．08g／ml；Organon Teknika CorpDurham，NC)離心回收活的淋巴細(xì)胞?；厥盏牧馨图?xì)胞在24孔平底培養(yǎng)板(Corning Costar CorpCambridge，MA)上被再刺激，培養(yǎng)板中含有0．5×106淋巴細(xì)胞、5×106被照射(2000拉德)同源C57BL／6腎細(xì)胞、5μg／ml OVA257-264肽和10單位／ml重組人白介素-2(IL-2)(Cetus CorpEmeryville，CA)。在其后每周的再刺激中，除了肽劑量不同之外，抗原特異性的CTL再刺激都是以相同的方式進(jìn)行。在8周體外刺激后，肽濃度降至2μg／ml。細(xì)胞毒性測(cè)定進(jìn)行4個(gè)小時(shí)的51Cr釋放測(cè)定。靶細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)被用50μCiNa51CrO4／1×106細(xì)胞標(biāo)記90分鐘。在50μl完全RPMI培養(yǎng)基中標(biāo)記靶細(xì)胞(1×104)，并加到96孔U-底培養(yǎng)板(Corning Costar Corp．)的孔中。當(dāng)適合時(shí)，在加入T細(xì)胞效應(yīng)劑之前，靶細(xì)胞與下列中的一種或多種在37℃、5％ CO2下溫育30分鐘OVA257-264肽、抗-CD8的抗體(從2．43雜交瘤得到的上清)、或抗-CD4的抗體(從GK1．5雜交瘤得到的上清)。把效應(yīng)細(xì)胞加入到50μl完全培養(yǎng)基的靶中。板在37℃、5％ CO2下溫育4小時(shí)。在溫育后，用Skatron收獲器(Skatron，IncStering，VA)收獲上清。用γ計(jì)數(shù)器(Beckman Instruments)定量測(cè)定放射性的釋放，用下面的等式計(jì)算百分比溶解
％比溶解=(實(shí)驗(yàn)(cpm)-自動(dòng)釋放(cpm)／最大釋放(cpm)-自動(dòng)釋放(cpm))×100結(jié)果報(bào)告為三個(gè)樣品的平均值加減標(biāo)準(zhǔn)方差。
自動(dòng)釋放是從在沒有T細(xì)胞效應(yīng)子存在下加入了100ml培養(yǎng)液的孔中算出的。最大釋放從加入了2％Triton X-100溶液的孔中算出的。流動(dòng)血細(xì)胞記數(shù)收獲淋巴細(xì)胞，用含有Ca2+、Mg2+和5％胎牛血清(FBS)的冷Dulbecco磷酸鹽緩沖液(DPBS)洗滌三次。在冰上溫育細(xì)胞45分鐘，或者與異硫氰酸熒光素(FITC)-偶合的抗小鼠CD2、CD3、CD4、CD8、CD28、CD11a／CD18、和α／β T細(xì)胞受體(TCR)，或者與合適的異型對(duì)照FITC-偶合的大鼠IgG2ak、大鼠IgG2bλ、或田鼠IgG抗體(PharMingen，San Diego，CA)。然后用沒有Ca2+和Mg2+的DPBS溶液洗滌兩次。用本領(lǐng)域內(nèi)的熟練技術(shù)人員熟知的流動(dòng)細(xì)胞分析方法分析從10，000活細(xì)胞／樣品中得到的數(shù)據(jù)，用Becton Dickinson FACscan流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器，波長為488nm，帶通道濾器為530nm。淋巴增殖分析圖2A和圖2B表示淋巴增殖分析的結(jié)果。如圖2A所示，為了確定用標(biāo)準(zhǔn)蛋白OVA口腔免疫能否導(dǎo)致細(xì)胞免疫應(yīng)答的活化，用含有OVA蛋白(微球-OVA)的腸溶衣微球免疫C57BL／6小鼠，劑量分別為12．5μg／ml、25μg／ml和100μg／ml(斜線方框)。為了比較用OVA口服免疫得到的免疫應(yīng)答和用同樣的抗原經(jīng)非腸道免疫得到的效果，OVA蛋白被分散到DETOX-PC佐劑中，并經(jīng)皮下注射到第二組C57BL／6小鼠中(黑色方框)。第三組C57BL／6小鼠經(jīng)口服免疫接受安慰劑微球(白色方框)。通過測(cè)量[3H]胸腺嘧啶的摻入測(cè)定淋巴細(xì)胞的增殖。
如圖2A所示，經(jīng)口接受100μg／ml微球-OVA的小鼠T細(xì)胞，其刺激指數(shù)為38．3，而用在佐劑中的OVA蛋白免疫的小鼠的T細(xì)胞的刺激指數(shù)為9．1。在OVA蛋白存在時(shí)自身淋巴細(xì)胞不增殖。如圖2B所示，各個(gè)組的淋巴細(xì)胞對(duì)用2．5μg／ml Con A非特異分裂原刺激都表現(xiàn)出強(qiáng)的刺激指數(shù)。
如圖3A和圖3B所示，在IVS只三個(gè)循環(huán)之后，抗原-特異性溶解的出現(xiàn)是顯然的。圖3A表明從經(jīng)皮下注射乳化在DETOX-PC佐劑中的OVA免疫的小鼠中得到的細(xì)胞效應(yīng)子。圖3B表明從經(jīng)口服微球-OVA免疫的小鼠的T細(xì)胞效應(yīng)子。黑色圓圈代表用25μg／ml OVA257-264CTL表面抗原決定族肽預(yù)脈沖標(biāo)記EL4細(xì)胞。空白圓圈代表沒有脈沖標(biāo)記的EL4細(xì)胞。
在IVS三個(gè)循環(huán)之后，抗原-特異性的溶解是明顯的，在此時(shí)間點(diǎn)，非特異性的EL4細(xì)胞的溶解也可察到。在IVS六個(gè)循環(huán)后，非特異性的EL4細(xì)胞溶解就顯著地降低(約10％到20％)。在IVS八個(gè)循環(huán)之后，兩個(gè)細(xì)胞系都得到較高的(約50％到約60％)抗原特異性溶解和較低的(少于10％)非特異性溶解。
如圖4所示，從免疫動(dòng)物中得到的CTL細(xì)胞系的強(qiáng)度用效應(yīng)子∶靶的比例的函數(shù)表示。EL4細(xì)胞與25μg／ml OVA257～264肽被預(yù)先脈沖標(biāo)記。黑色圓圈代表微球-OVA。黑色四方體代表在DETOX-PC佐劑中乳化的OVA。十字代表安慰劑微球體，空白三角代表非肽脈沖的EL4細(xì)胞的非特異性的51Cr攝入。兩種細(xì)胞系都可通過一個(gè)范圍多種效應(yīng)子∶靶比例滴定。當(dāng)被施以安慰劑微球的動(dòng)物中的腎細(xì)胞在與實(shí)驗(yàn)細(xì)胞相同條件下被培養(yǎng)的時(shí)候，它們?cè)隗w外不能被激活以識(shí)別肽脈沖標(biāo)記的靶細(xì)胞。這個(gè)觀察也表明實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系在經(jīng)口服或腸道用OVA免疫后通過體內(nèi)活化得到它們的抗原特異性，而并非是體外培養(yǎng)的結(jié)果。
為驗(yàn)證從各個(gè)免疫動(dòng)物中得到的細(xì)胞系以CD8+T細(xì)胞依賴方式溶解腫瘤細(xì)胞，做了抗體封閉實(shí)驗(yàn)。圖5A和圖5B表明抗原-特異靶細(xì)胞溶解的CD8+T細(xì)胞依賴性。圖5A顯示應(yīng)用OVA257-264標(biāo)記的EL4細(xì)胞在40∶1的效應(yīng)子∶靶比例下一個(gè)4小時(shí)的51Cr釋放測(cè)定，以確定觀察的靶細(xì)胞被從經(jīng)皮下注射佐劑中的OVA免疫的動(dòng)物中得到的CTL系溶解CD8+T細(xì)胞的依賴性。圖5B顯示應(yīng)用OVA257-264標(biāo)記的EL4細(xì)胞在20∶1的效應(yīng)子∶靶比例下一個(gè)4小時(shí)的51Cr釋放測(cè)定，以確定觀察的靶細(xì)胞被從經(jīng)口服微球-OVA免疫的動(dòng)物中得到的CTL系溶解CD8+T細(xì)胞的依賴性。
如圖5A和圖5B所示，在4小時(shí)51Cr釋放測(cè)定中，從雜交瘤GK1．5、分泌的抗-CD4抗體或者雜交瘤GK2．43、分泌的抗-CD8抗體中得到的上清，在它們加入到OVA257-264標(biāo)記的EL4靶細(xì)胞之前就與T細(xì)胞溫育。在抗CD8抗體存在的情況下，抗體-特異性腫瘤細(xì)胞溶解被抑制。相反地，抗-CD4抗體的存在導(dǎo)致T細(xì)胞介導(dǎo)的抗原-特異性細(xì)胞溶解的較少抑制(約1％到10％)。當(dāng)T細(xì)胞與含有抗-CD8抗體的2．43雜交瘤的上清預(yù)溫育時(shí)，兩種T細(xì)胞系的溶解活性都被消除。T細(xì)胞與含有抗CD4抗體的GK1．5雜交瘤上清的預(yù)溫育不帶來此細(xì)胞系溶解活性的較大降低。
FACS分析可通過流動(dòng)細(xì)胞記數(shù)分析OVA-衍生的細(xì)胞系上存在T細(xì)胞表面標(biāo)記物。表1表明在八個(gè)IVS循環(huán)之后T細(xì)胞系的表型特征。細(xì)胞系從小鼠的腎細(xì)胞中得到，小鼠如上所述通過微球-OVA或佐劑中的OVA免疫。表1
如表1所示，兩種細(xì)胞系都有多于95％的T細(xì)胞，它們以CD3細(xì)胞表面分子來鑒定。從用佐劑中的OVA免疫的小鼠中得到的培養(yǎng)淋巴細(xì)胞中衍生得到的T細(xì)胞系含有49．6％的CD8+T細(xì)胞，從經(jīng)口服微球-OVA免疫的小鼠中得到的培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞衍生得到的細(xì)胞系含有92．7％的CD8+T細(xì)胞。表明除了整和分子CD11a／CD18之外，兩種細(xì)胞系都表達(dá)輔刺激分子受體CD2和CD28。從兩組免疫的動(dòng)物中得到的培養(yǎng)的T細(xì)胞也表達(dá)α／β T細(xì)胞受體。這些數(shù)據(jù)幫助表明，用蛋白抗原OVA通過口服微球免疫活化的T細(xì)胞在表型上與用同樣的抗原經(jīng)非腸道免疫活化得到的結(jié)果是相似的。
本發(fā)明的微球調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。應(yīng)答可包括一般的促進(jìn)產(chǎn)生TH1細(xì)胞、TH2細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)亞類，或從TH2類型的應(yīng)答促進(jìn)轉(zhuǎn)變?yōu)門H1類型的應(yīng)答，或從TH1類型應(yīng)答促進(jìn)轉(zhuǎn)變?yōu)門H2類型的應(yīng)答，或促進(jìn)的前-CTL到CTL的分化。免疫原可是肽、蛋白質(zhì)片段、蛋白質(zhì)、DNA、和／或RNA，也可是基因、基因片段或疫苗。治療或預(yù)防制劑包括免疫原、免疫治療制劑或基因治療制劑，或者單獨(dú)使用或者聯(lián)合使用，它們可以腸微膠囊化的組分與具有大于35目的惰性粒子結(jié)合的形式經(jīng)口服方式傳送，并以底物珠子、顆粒、粉末、或晶體的形式存在。
將可期望在此公開的傳送系統(tǒng)的組成和方法能在較為寬廣的條件下被用做治療或預(yù)防。因而，本發(fā)明的實(shí)施例只是發(fā)明人優(yōu)選的實(shí)施例，它們并不在任何意義上具有限制作用。對(duì)這些實(shí)施例的多種改變、修飾或變更都可進(jìn)行，而并不被認(rèn)為偏離了本發(fā)明的精神和隨后的權(quán)利要求的范圍。
權(quán)利要求
1．在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將含有連接到惰性粒子上的免疫原的微球施用到所說哺乳動(dòng)物的小腸，其中所說惰性粒子的顆粒尺寸大于35目。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所說的微球經(jīng)口服施用，所說的微球包括腸溶衣包被的微球。
3．權(quán)利要求1的方法，其中所說的微球通過凝膠膠囊施用。
4．權(quán)利要求1的方法，其中所說的免疫原從由下列物質(zhì)組成的組中選取肽、蛋白質(zhì)片段、蛋白質(zhì)、基因、基因片段、DNA、RNA和其組合。
5．權(quán)利要求1的方法，其中所說的免疫原是疫苗。
6．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括施用連接到惰性粒子上的增效試劑，其中所說的惰性粒子選自免疫原-結(jié)合的惰性粒子和非免疫原-結(jié)合的惰性粒子。
7．權(quán)利要求1的方法，其中施用多個(gè)微球，以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
8．權(quán)利要求7的方法，其中所說的多個(gè)微球包含選自由不同的惰性粒子大小、不同的惰性粒子組成、不同的腸溶衣、不同的配方和其結(jié)合所組成的組中的組合物。
9．權(quán)利要求1的方法，其中所說含有所說的免疫原的微球誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞數(shù)目的增加。
10．權(quán)利要求9的方法，其中所說含有所說的免疫原的微球誘導(dǎo)細(xì)胞群落的增加，所述細(xì)胞選自TH1淋巴細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和它們的組合。
11．權(quán)利要求1的方法，其中所說的惰性粒子的顆粒尺寸大于約40目。
12．權(quán)利要求1的方法，其中所說的免疫原被包含在惰性粒子上，所述惰性粒子從由nonpareil、硅粉、鹽結(jié)晶和糖結(jié)晶組成的組中選擇。
13．減輕哺乳動(dòng)物中癌癥的方法，包括將含有結(jié)合到惰性粒子上的免疫原的微球施用到所說哺乳動(dòng)物的小腸，所說的惰性粒子的顆粒尺寸大于約35目。
14．權(quán)利要求13的方法，其中所說的微球經(jīng)口服施用，所說的微球包括腸溶衣包被的微球。
15．權(quán)利要求13的方法，其中所說的微球通過凝膠膠囊施用。
16．權(quán)利要求13的方法，其中所說的免疫原從由肽、蛋白質(zhì)片段、蛋白質(zhì)、基因、基因片段、DNA、RNA和它們的組合所組成的組中選擇。
17．權(quán)利要求13的方法，其中所說的免疫原是疫苗。
18．權(quán)利要求13的方法，進(jìn)一步包括施用結(jié)合到惰性粒子上的增效試劑，所說的惰性粒子選自免疫原-結(jié)合的惰性粒子和非免疫原結(jié)合的惰性粒子。
19．權(quán)利要求13的方法，其中施用多個(gè)微球，來選擇性地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
20．權(quán)利要求19的方法，其中所述的多個(gè)微球具有選自由不同的惰性粒子大小、不同的惰性粒子組成、不同的腸溶衣、不同的配方和其結(jié)合所組成的組中的組合物。
21．權(quán)利要求13的方法，其中所說含有所說的免疫原的微球誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞數(shù)目的增多。
22．權(quán)利要求21的方法，其中所說含有所說的免疫原的微球誘導(dǎo)細(xì)胞群落的增加，所述細(xì)胞選自TH1淋巴細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和它們的組合。
23．權(quán)利要求13的方法，其中所說的惰性粒子的顆粒尺寸大于約40目。
24．權(quán)利要求13的方法，其中所說的免疫原包含在惰性粒子上，所述惰性粒子從由nonpareil、硅粉、鹽結(jié)晶和糖結(jié)晶組成的組中選擇。
25．在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括給所說的哺乳動(dòng)物經(jīng)口服施用含有腸溶衣包被的含有蛋白免疫原的惰性粒子的微球，所說的惰性粒子的顆粒尺寸大于約40目。
26．權(quán)利要求25的方法，進(jìn)一步包括施用結(jié)合到惰性粒子上的增效試劑，所說的惰性粒子選自免疫原-結(jié)合的惰性粒子和非免疫原結(jié)合的惰性粒子。
27．權(quán)利要求25的方法，其中施用多個(gè)微球，以選擇性地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
28．權(quán)利要求27的方法，其中所說的微球具有從由不同的惰性粒子大小、不同的惰性粒子組成、不同的腸溶衣、不同的配方和其結(jié)合所組成的組中選擇的組合物。
29．權(quán)利要求25的方法，其中所述免疫應(yīng)答包括T淋巴細(xì)胞群落的增加。
30．權(quán)利要求29的方法，其中所述免疫應(yīng)答包括細(xì)胞群落的增加，所述細(xì)胞選自TH1淋巴細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和它們的組合。
31．含有包含在惰性粒子上的免疫原和腸溶衣的微球，所說的惰性粒子的顆粒尺寸大于約35目。
32．權(quán)利要求31的組合物，它被包含在膠囊中。
33．權(quán)利要求31的組合物，進(jìn)一步含有增效試劑。
全文摘要
含有結(jié)合到顆粒尺寸大于約35目的惰性粒子上的抗原的微球,用于位點(diǎn)－特異性釋放并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答可以是全部的增強(qiáng)的T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答或選擇性的應(yīng)答。微球的物理和化學(xué)特征和/或施用模式可被工程化,以增加用于治療感染性疾病癌癥的T
文檔編號(hào)A61P35/00GK1292686SQ99803862
公開日2001年4月25日 申請(qǐng)日期1999年3月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月12日
發(fā)明者羅伯托·L·里韋拉 申請(qǐng)人:阿勒詹尼克斯公司