專利名稱：提高免疫應(yīng)答的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在真核細(xì)胞中可操縱的DNA表達(dá)構(gòu)建體在制備疫苗中的應(yīng)用，皮內(nèi)注射該疫苗來誘導(dǎo)1型細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，還涉及對(duì)應(yīng)的將介導(dǎo)轉(zhuǎn)移的分子連接到基因表達(dá)構(gòu)建體來提高免疫應(yīng)答的方法。
本發(fā)明涉及遺傳免疫領(lǐng)域。
遺傳免疫依據(jù)的原理是接種基因表達(dá)構(gòu)建體以代替接種滅活病原體或者其特異性抗原的傳統(tǒng)方法。這些表達(dá)構(gòu)建體編碼病毒、細(xì)菌或者寄生蟲等病原體的免疫原性蛋白，或者在發(fā)生惡性疾病時(shí)特異性地表達(dá)或者呈遞的抗原。因此，僅僅是給被接種者提供生產(chǎn)外源蛋白的遺傳信息，結(jié)果病人的體細(xì)胞內(nèi)生成了外源蛋白，隨后形成有效的抵抗外源抗原的免疫應(yīng)答。
背景技術(shù)：
以往，預(yù)防感染性疾病以及免疫方法的原理都是基于機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)已經(jīng)被有效抵抗的病原體的識(shí)別。
兩種主要途徑差別顯著體液途徑依賴于B淋巴細(xì)胞生成抗體以及非獲得性免疫如補(bǔ)體系統(tǒng)的體液成分，而細(xì)胞免疫系統(tǒng)依賴于T-淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞的活性。T-淋巴細(xì)胞能夠識(shí)別感染了病毒的細(xì)胞?，F(xiàn)今已知道稱為1型輔助細(xì)胞誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞途徑，而2型輔助細(xì)胞激活后誘導(dǎo)體液途徑(Mosmann等，免疫學(xué)雜志(J.Immuno.)，1986，136(10)3561-6)。相應(yīng)地，細(xì)胞途徑也稱為Th1途徑以及體液途徑也稱為Th2途徑。存在于細(xì)胞外的細(xì)菌通常通過Th2途徑被殺死。Th2途徑對(duì)于體內(nèi)中和細(xì)菌毒素和抵抗細(xì)胞外的不同種類寄生蟲的反應(yīng)也是重要的。
此外，主要寄居在細(xì)胞內(nèi)的病原體，如已知的一些細(xì)菌種屬和所有病毒，主要是通過Th1途徑即細(xì)胞毒性細(xì)胞來對(duì)抗。
已知多種方法用于將編碼免疫原性抗原或其部分的DNA，通過化學(xué)、物理或者生物轉(zhuǎn)染方法，轉(zhuǎn)移(“轉(zhuǎn)染”)到抗原呈遞細(xì)胞或者其他體細(xì)胞的細(xì)胞核中。
轉(zhuǎn)染方法，也稱為“基因穿梭”，指病毒載體、質(zhì)?；蛘吖矁r(jià)閉合微小化DNA構(gòu)建體(參見EP0914318 B1；下文稱為MIDGE(微小化的免疫學(xué)限定的基因表達(dá)載體(minimalistic immunologically defined geneexpression vectors)))。與之密切相關(guān)的野生型病毒和載體通常具有高的轉(zhuǎn)染效率和組織特異性，但是出于對(duì)安全性考慮以及抗載體免疫的問題，它們被認(rèn)為是有爭(zhēng)議的。使用裸DNA不存在抗載體免疫的問題。當(dāng)在體內(nèi)以及體外應(yīng)用來自質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)時(shí)，出現(xiàn)了在細(xì)胞類型和組織中涉及轉(zhuǎn)染效率和特異性的問題。因此，人們已經(jīng)進(jìn)行優(yōu)化基于DNA的轉(zhuǎn)染方法的嘗試。通過不同連接方法把各種多肽和其他有機(jī)分子連接到基因穿梭上。還利用配體受體相互作用通過連接配體來提高基因穿梭的攝入(Fraser等，1998，免疫學(xué)論文(Semin.Immunl.)，10(5)363-72)。
通過將猴病毒SV40的核定位信號(hào)共價(jià)連接到編碼乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的表達(dá)盒上，肌肉應(yīng)用后，抗體滴毒提高10-15倍(Schirmbeck等，分子醫(yī)學(xué)雜志(J.Mol.Med.)，2001年6月，79(5-6)343-50)。出現(xiàn)不同的抗體反應(yīng)的亞型分布，在皮內(nèi)應(yīng)用粒子介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移(“基因槍”)后，強(qiáng)烈偏向Th2特異的IgG1亞型，而在肌肉應(yīng)用后偏向Th1特異的IgG2a亞型。未出現(xiàn)與使用不同載體(質(zhì)粒、微小化載體)相關(guān)的差別。
類似地，HIV-1基因產(chǎn)物TAT的11氨基酸T肽片段(YGRKKRRQRRR)用于將200nm脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。但是為使試驗(yàn)成功，必須每個(gè)脂質(zhì)體使用數(shù)量約500的T肽(Torchilin等，PNAS2001，98(15)8786-8791)。Frankel證明了這種肽具有能夠?qū)㈦牡鞍邹D(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)的膜穿透功能(Frankel等，1988，細(xì)胞(Cell)551179-1188，Green等，1988，細(xì)胞(Cell)551179-1188，US5670617)。
應(yīng)用抵抗各種疾病的免疫治療來誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答的預(yù)防接種似乎是有利的。特別是對(duì)于細(xì)胞內(nèi)寄生蟲如利什曼原蟲和瘧疾以及病毒性疾病如HIV。從這點(diǎn)上看，任何在注射DNA后提高Th1傾向的方法對(duì)于形成有效免疫應(yīng)答是有利的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種方法，按接種的DNA表達(dá)構(gòu)建體的每個(gè)含量計(jì)算，與本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)中的方法相比，該方法激發(fā)更強(qiáng)烈和更具有細(xì)胞傾向性的(Th1)免疫應(yīng)答。
本目的通過獨(dú)立權(quán)利要求來實(shí)現(xiàn)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過將含有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或者核定位結(jié)構(gòu)域的肽共價(jià)連接到編碼用于免疫接種的抗原的共價(jià)閉合DNA構(gòu)建體(MIDGE)的發(fā)夾環(huán)上，隨后將該構(gòu)建體免疫接種動(dòng)物，產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的數(shù)量和質(zhì)量都顯著偏向細(xì)胞免疫應(yīng)答?？傊?，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其用于通過皮內(nèi)注射溶液形式的表達(dá)抗原的、綴合了肽的DNA表達(dá)構(gòu)建體，以激發(fā)1型細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答。在其他方面，本發(fā)明也明顯地區(qū)別于本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)，這種1型反應(yīng)的誘導(dǎo)完全不是本領(lǐng)域科學(xué)界能夠預(yù)見的。作為這種偏見的例子可以參見白細(xì)胞生物學(xué)雜志上一篇由DNA免疫接種領(lǐng)域的奠基人之一David Weiner發(fā)表的文章(Shedlock und Weiner，白細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Leukocyte Bio.)，68卷，2000年12月，793-806)作者明確闡述關(guān)于不同應(yīng)用形式的預(yù)期(如上，第795頁左欄下方)“針對(duì)皮膚的輸送方式，包括皮內(nèi)注射......已經(jīng)被證明首先引起體液反應(yīng)，表現(xiàn)為迅速遞進(jìn)成Th2型反應(yīng)，伴隨生成IgA和IgG1亞型抗體。”Th1反應(yīng)是無法預(yù)期的，這使得本發(fā)明對(duì)于本領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)人員來說是意外和不可預(yù)見的。
本申請(qǐng)人和德國(guó)烏爾姆大學(xué)研究小組合作(Schirmbeck等，被引用)未能解釋當(dāng)與未修飾載體比較以及通過粒子轟擊皮膚應(yīng)用時(shí)抗體水平變化的原因。因此，不得不推斷本發(fā)明得到的有益效果僅限于皮膚注射的應(yīng)用。
但是這將是巨大的技術(shù)進(jìn)步。原因之一，將DNA表達(dá)構(gòu)建體應(yīng)用于皮膚是有益的，這是由于皮膚存在較多造成這些構(gòu)建體次級(jí)效應(yīng)的細(xì)胞，因此，只需要接種較少DNA。另一個(gè)原因是肌肉注射比較痛苦，對(duì)于家畜伴隨形成接種疤痕，妨礙接種部位作為食用肉的商業(yè)應(yīng)用，導(dǎo)致免疫接種動(dòng)物的價(jià)值降低。
TAT肽的轉(zhuǎn)導(dǎo)序列元件能夠轉(zhuǎn)移數(shù)量級(jí)別比其天然底物更大的核酸構(gòu)建體，這種結(jié)果令人驚奇和難以預(yù)期。由于迄今試驗(yàn)僅僅給出轉(zhuǎn)移小得多的分子的效果，這種結(jié)果不能預(yù)期。Dowdy等證明把這種肽序列融合到蛋白分子中使得將大小為120kDa的蛋白轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中成為可能(Dowdy等，2000，醫(yī)藥科學(xué)趨勢(shì)(Trends Pharmacol.Sci.)，21(2)45-8)。因此，申請(qǐng)人旨在證實(shí)TAT衍生的T肽是否也能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)數(shù)量級(jí)別更大的DNA表達(dá)構(gòu)建體。僅由于分子大小(1800bp表達(dá)構(gòu)建體的大小為1.2MDa)和完全不同的分子形狀，這種假設(shè)并不是微不足道和絕對(duì)的。雖然蛋白質(zhì)和多肽通常是球形的，但是缺乏拓?fù)鋸埩Φ腄NA分子首先估計(jì)認(rèn)為是線性分子?？紤]到與蛋白的區(qū)別，還需要考慮到磷酸殘基引起的表面電荷，其使得DNA成為一個(gè)負(fù)電荷強(qiáng)烈的分子。
而且，肽序列區(qū)別于含有核定位信號(hào)(NLS)的猴病毒SV40。一些生物體中存在這種用于將蛋白質(zhì)傳送到細(xì)胞核所必需的信號(hào)序列。大于60kDa的分子只能通過這種核定位信號(hào)傳送到細(xì)胞核中。特別地，已經(jīng)證明SV-40 NLS可以把分子量為465kDa的蛋白轉(zhuǎn)移細(xì)胞核內(nèi)(Lanford等，1986，細(xì)胞15；46(4)575-82)。本發(fā)明利用肽的這種功能來提高基因轉(zhuǎn)移。所用的肽序列為PKKKRKV。
用于制備這種在細(xì)胞或者細(xì)胞復(fù)合體中轉(zhuǎn)錄RNA分子的核酸構(gòu)建體的方法，基于EP0941318 B1，其中核酸構(gòu)建體●通過由一條具有與相應(yīng)的另一條鏈部分互補(bǔ)并且反向平行的堿基序列的脫氧核糖核酸環(huán)鏈構(gòu)成，得到一個(gè)形似啞鈴的結(jié)構(gòu)，●其中與相應(yīng)的另一條鏈部分互補(bǔ)并且反向平行的堿基序列，主要由啟動(dòng)子序列、編碼序列以及或者聚腺苷酸信號(hào)或者其他RNA穩(wěn)定序列元件組成，●未互補(bǔ)的堿基序列形成含有單鏈脫氧核酸的兩個(gè)環(huán)(“發(fā)夾環(huán)”)，與相應(yīng)的另一條鏈部分互補(bǔ)并反向平行的堿基序列的5’和3’端相連，其中●發(fā)夾環(huán)至少由下面的寡核苷酸(ODN1或ODN2)之一形成ODN 15’-PH-GGG AGT CCA GT XT TTC TGG ACODN 25’-PH-AGG GGT CCA GTT TTC TGG AC，其中X表示一個(gè)氨基殘基修飾激活的核苷殘基(胸腺嘧啶)，●和一種通過交聯(lián)分子共價(jià)連接到這個(gè)發(fā)夾環(huán)的有機(jī)分子。
這種方法能夠?qū)⒎肿庸矁r(jià)連接到核酸構(gòu)建體上。從本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)知曉的解決問題的方案中，配體的連接不是通過將配體直接連接到質(zhì)粒上來實(shí)現(xiàn)，而是借助橋連分子，而且尚未在分子水平上確定連接位點(diǎn)。因而存在啟動(dòng)子或者治療基因的功能會(huì)受到這些修飾損害的危險(xiǎn)。從分子水平上確定的連接，也使得按照現(xiàn)代藥物生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)則來描述這些構(gòu)建體成為可能，這是這些載體作為藥物應(yīng)用的先決條件。申請(qǐng)人在室內(nèi)實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肽以非共價(jià)方式加入時(shí)，不出現(xiàn)所觀察到的誘導(dǎo)Th-1反應(yīng)的效果。由于上述原因，共價(jià)連接顯然是有利的；原因應(yīng)當(dāng)是由于牢固的共價(jià)連接提高了轉(zhuǎn)染以及轉(zhuǎn)錄的效果。根據(jù)申請(qǐng)人進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，通過連接許多其他堿性(陽離子)肽也能夠獲得觀察到的效果，因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍不只限于本申請(qǐng)所描述的兩種肽的應(yīng)用。
用編碼HBsAg的MIDGE載體進(jìn)行的小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和用p36 LACK抵抗碩大利什曼原蟲的免疫實(shí)驗(yàn)，已經(jīng)確證了這些理論性考慮。在本發(fā)明中，不同的肽被共價(jià)連接到載體上。通過比較不同免疫接種方式(vaccination regiem)，確定一種有效而且安全的免疫接種保護(hù)。測(cè)定的參數(shù)是Th2/Th1強(qiáng)度的變化和通過免疫接種獲得的保護(hù)，這些參數(shù)通過用碩大利什曼原蟲的前鞭毛體攻擊后測(cè)定病灶的大小來確定。在該范圍內(nèi)這是很重要的，因?yàn)槔猜x小鼠攻擊系統(tǒng)是Th1-Th2二分理論模型，并且除了為各種抗原而測(cè)定的替代物參數(shù)外，例如抗體亞型數(shù)量，以及生物效應(yīng)-免受感染-可以在完整的生物體中測(cè)定。在本申請(qǐng)中可以看到從使用“裸”的、非肽修飾的DNA到連接到陽離子肽的表達(dá)構(gòu)建體的巨大創(chuàng)造性。前者沒有產(chǎn)生顯著的對(duì)攻擊感染的保護(hù)，而肽修飾表達(dá)構(gòu)建體的兩種應(yīng)用，沒有進(jìn)一步使用白細(xì)胞介素或者其他的免疫調(diào)節(jié)劑，產(chǎn)生完全保護(hù)。在本發(fā)明中，這表明本發(fā)明的免疫接種方式引起免疫接種方式朝向干擾素-γ介導(dǎo)的1型免疫應(yīng)答強(qiáng)烈偏向(Th1免疫應(yīng)答具有干擾素-γ細(xì)胞因子分布和免疫球蛋白Th1亞型偏向)，這無法通過替代物參數(shù)來檢測(cè)。本發(fā)明的疫苗在溶液中應(yīng)用。
在通過來自未致敏T輔助細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞(APC)呈遞抗原過程中，形成T輔助細(xì)胞朝向或者Th1(細(xì)胞毒性的)或者Th2(體液的)免疫應(yīng)答的偏向。其中，這種偏向的一個(gè)決定因素是APC和輔助細(xì)胞在其中發(fā)生相互作用的細(xì)胞因子環(huán)境，以及參與相互作用的受體的特性(Pulendran等，科學(xué)，193，253-256，2001)。
由于亞型IgG1和IgG2a反映整個(gè)免疫應(yīng)答的偏向，測(cè)定抵抗兩種抗原(HBsAg和p36/LACK)的干擾素γ(IgG)的亞型分布。從這點(diǎn)上看，IgG1亞型是體液反應(yīng)的特征，伴隨被激活的淋巴細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素I1-4和IL-10的增加；而亞型IgG2a水平上升是典型的細(xì)胞的Th1反應(yīng)，伴隨著IFNg和IL-12分泌量增加。此時(shí)不排除存在各種亞型，但是可以相對(duì)滴度作為形成的主導(dǎo)類型的免疫應(yīng)答的指標(biāo)。
皮內(nèi)應(yīng)用HbsAg表達(dá)質(zhì)粒溶液僅僅產(chǎn)生Th2型免疫應(yīng)答(見附圖1)。沒有出現(xiàn)朝向Th1抗體亞型的改變參見附圖3)。然而，許多醫(yī)學(xué)上非常重要的疾病，要求形成細(xì)胞毒性反應(yīng)，這些疾病為肝炎(hepatide)、白細(xì)胞病毒感染如HIV和細(xì)胞內(nèi)寄生蟲感染。從這點(diǎn)上看，作為本發(fā)明的目的，形成Th1主導(dǎo)的免疫應(yīng)答不僅僅是數(shù)量上提高，因?yàn)檩^少的DNA產(chǎn)生了較高的滴度。相反，與本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明是質(zhì)量改進(jìn)，不能從文獻(xiàn)中公開的數(shù)據(jù)預(yù)期。
現(xiàn)今還不知曉這種質(zhì)量變化背后的機(jī)制。將配體連接到微小化表達(dá)載體上引起報(bào)道基因體外表達(dá)增加的事實(shí)(數(shù)據(jù)未顯示)并不必要地預(yù)示免疫接種改善，其Th亞型減少。如果能夠根據(jù)當(dāng)前科學(xué)知識(shí)作任何預(yù)測(cè)，那么導(dǎo)致Th2反應(yīng)的DNA使用量的下降應(yīng)當(dāng)是由于減少使用免疫刺激細(xì)菌DNA基序(motif)。而對(duì)于在本申請(qǐng)中探究的連接到NLS和T肽的載體，情況正好相反。
抗碩大利什曼原蟲抗原p36LACK的免疫接種試驗(yàn)的結(jié)果表明從保護(hù)效果上看，本發(fā)明所述方法優(yōu)于本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)中目前熟知的用重組牛痘病毒(rVV)進(jìn)行二次免疫(加強(qiáng))的免疫接種方式。此外，本發(fā)明的方法避免了由質(zhì)粒和減毒病毒引起的潛在副作用，同時(shí)在保護(hù)效果上還具有可比性(Gonzalo等，微生物與感染(Microbes and Infection)3(9)701-711)。而且就達(dá)到相似或者更好的保護(hù)效果來看，制備本發(fā)明所述方法更簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)，最重要的是，本發(fā)明的方法更加安全。
用HBsAg進(jìn)行的體內(nèi)試驗(yàn)的結(jié)果非常令人驚奇，其DNA的使用量比現(xiàn)有文獻(xiàn)中描述的用于免疫的不用顆粒組合物的未加佐劑的DNA用量少得多。用HBsAg進(jìn)行免疫時(shí)，通常30-100μg質(zhì)粒被注射到肌肉或者真皮中(Schirmbeck等，1998，疫苗，16卷，第9/10期949-954)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)總結(jié)如下●微小化核酸構(gòu)建體被修飾，來提高免疫應(yīng)答。
●這些被修飾的微小化核酸構(gòu)建體引起更強(qiáng)烈地受免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞途徑介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
采用本發(fā)明的DNA表達(dá)構(gòu)建體和含有這種構(gòu)建體的疫苗的令人驚奇的效果顯示在附圖包含的描述中?？s寫表示pMOK p36 編碼p36抗原的質(zhì)粒Mp36-NLS 編碼p36抗原的MIDGE連接到NLS肽PMOK ctr 編碼HBsAg的對(duì)照質(zhì)粒rVVp36 編碼p36的重組牛痘病毒phosphate 作為對(duì)照的磷酸緩沖液control+ 陽性對(duì)照，感染碩大利什曼原蟲的小鼠的血清control- 陰性對(duì)照，未處理小鼠的血清從屬權(quán)利要求中描述更有效的方法；下面通過實(shí)施例和附圖更加詳細(xì)描述本發(fā)明。


附圖1ELISA測(cè)定小鼠中抗乙肝表面抗原(HBsAg)的總IgG；附圖2ELISA測(cè)定在用1μg DNA加強(qiáng)后抗乙肝表面抗原的總IgG；附圖3和4抗乙肝表面抗原的IgG的亞型IgG1和IgG2a的測(cè)定；附圖5抗碩大利什曼原蟲的p36LACK抗原的免疫接種試驗(yàn)的結(jié)果。
附圖6測(cè)定在用碩大利什曼原蟲攻擊感染后抗p36 LACK的總IgG抗體滴度。所有免疫接種方案都有一個(gè)可檢測(cè)的抗體反應(yīng)，其中循環(huán)抗體滴度最高的由MIDGE p36-NLS/MIDGE p36-NLS引起。
實(shí)施例實(shí)施例1激活用于連接硫醇功能化分子的寡脫氧核糖核苷酸通?？梢酝ㄟ^許多化學(xué)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)多肽、糖或者其他天然化合物等分子的連接。這些標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)形成酰胺鍵、酯鍵或者亞胺鍵，這些化學(xué)鍵都可以從有機(jī)合成化學(xué)構(gòu)成中知曉。
在發(fā)明中申請(qǐng)人進(jìn)行被連接的分子中含有的硫醇?xì)埢c核酸分子上的馬來酰亞胺的反應(yīng)來說明發(fā)明。通過氨基殘基(表示為X)反應(yīng)，將馬來酰亞胺殘基導(dǎo)入核酸組成中，是在ODN合成中使用商業(yè)上可以購(gòu)得的雙功能偶聯(lián)試劑通過NHS羧酸的轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)導(dǎo)入的。制備只有一個(gè)位點(diǎn)被修飾的MIDGE構(gòu)建體，使用發(fā)夾環(huán)中含有一個(gè)脫氧尿嘧啶(XT)殘基被氨基殘基修飾的ODN1和未被修飾的ODN25’-PH-GGG AGT CCA GT XT TTC TGG AC(柏林TIB-Molbiol，簡(jiǎn)稱ODN1＝Seq ID 5)，其中PH表示5’-OH磷酸化，和5’-PH-AGG GGT CCA GTT TTC TGG AC(柏林TIB-Molbiol，簡(jiǎn)稱ODN 2＝Seq ID 6)。
氨基修飾的ODN1按下述方式用于連接用于共價(jià)連接的交聯(lián)分子(本申請(qǐng)溶于DMF中的硫代-KMUS(N-(馬來酰亞胺基十一酰氧基)磺基琥珀酰亞胺(sulfo-KMUS(N-Maleimidoundecanoyloxy)sulfosuccinimide))，PIERCE產(chǎn)品-Nr.21111)按4倍于氨基-ODN的含量加入(最終濃度為0.1mM)，每次間隔30分鐘，直到最終濃度達(dá)到5mM。在交聯(lián)反應(yīng)緩沖液中(50mM NaHPO4，75mM NaCl，pH7.6)，37℃下反應(yīng)兩個(gè)小時(shí)以上。隨后，加入Tris-HCl(pH7.5；最終濃度50mM)來中止反應(yīng)。激活的氨基ODN在-70℃乙醇(300mM NaOAc pH5.3；20mM MgCl2；2.5倍反應(yīng)體積的100％乙醇)中沉淀30分鐘。沉淀物以15000rpm(4℃)離心30分鐘，并在相同的條件下用70％乙醇洗滌15分鐘。最后，激活的氨基ODN溶解在水中(MilliQ級(jí))，在-20℃保存待用。
實(shí)施例2將T肽連接到寡脫氧核糖核苷酸(ODN)上把在實(shí)施例1中描述的激活的氨基ODN溶解在偶聯(lián)反應(yīng)緩沖液中(1x＝50mM NaHPO4，75mM NaCl，pH7.0)，最終濃度為0.1mM。隨后，加入序列為YGRKKRRQRRR的T肽(＝Seq ID 3；由柏林Charité的PeterHenklein博士制備和提供)的水溶液，最終濃度為0.2mM。在37℃下持續(xù)反應(yīng)1小時(shí)。
通過反相HPLC從未反應(yīng)的ODN中純化和分離生成的肽連接ODN。通過凝膠電泳分析每個(gè)反應(yīng)批次。用真空離心機(jī)濃縮含有T-ODN的片段并溶解在超純水中。用Nukleosil-300 C18柱(10μm，250mm長(zhǎng)×8mm內(nèi)徑)通過HPLC純化修飾的ODN。梯度持續(xù)從0％緩沖液A(100mM碳酸銨)到42％緩沖液B(80％乙腈)，流速為2.4ml/min 47分鐘以上。
實(shí)施例3將SV-40 NLS連接到激活的ODN上將在實(shí)施例1中描述的激活的氨基ODN溶解在偶聯(lián)反應(yīng)緩沖液中(1x＝50mM NaHPO4，75mM NaCl，pH7.0)，最終濃度為0.1mM。隨后，加入序列為PKKKRKV的SV-40 NLS肽(＝Seq ID 4；Henklein博士制備和提供)的水溶液，最終濃度為0.2mM。在37℃下持續(xù)反應(yīng)1小時(shí)。
通過反相HPLC從未反應(yīng)的ODN中純化和分離生成的肽連接ODN。通過凝膠電泳分析每個(gè)反應(yīng)批次。用真空離心機(jī)濃縮含有NLS-ODN的片段并溶解在超純水中。
實(shí)施例4制備MIDGE-HbsAgT-肽MIDGE是由僅表達(dá)盒組成的雙鏈DNA構(gòu)成的微小化表達(dá)載體，表達(dá)盒為CMV啟動(dòng)子、內(nèi)含子、各個(gè)基因序列和聚腺苷酸序列。按如下方式制備所述構(gòu)建體質(zhì)粒pMOK HbsAg用Eco311徹底消化。存在Eco311時(shí)，用T4 DNA連接酶進(jìn)行按照實(shí)施例1偶聯(lián)了T肽的5’磷酸化發(fā)夾形的ODN1以及ODN2的連接，加熱到70℃來終止反應(yīng)。濃縮得到的混合物，在沒有脫氧核糖核苷酸三磷酸情況下用Eco311和T7DNA聚合酶進(jìn)行處理。通過陰離子色譜來純化。通過限制性內(nèi)切酶消化來驗(yàn)證各種配體已被成功偶聯(lián)。通過凝膠電泳比較從MIDGE上消化(用BamHI和Eco311)得到的ODN與各個(gè)對(duì)照ODN的大小，結(jié)果表明載體連接到多肽。(HbsAg的序列顯示于Seq ID1)。
類似地進(jìn)行MIDGE HbsAg NLS-肽的制備。
實(shí)施例5質(zhì)粒pMOKp36的重組構(gòu)建體從起始質(zhì)粒pSCp36 PCR擴(kuò)增得到2個(gè)片段1.PCR約800bp引物左5’-TTATATGGTACCATGAACATACGAGGGTCACCT(＝Seq ID7)，引物右5’-TTATATGAGCTCAGAAGACACGGACAGGGACCTCTTCCGTCG(＝Seq ID 8)2.PCR約950bp引物左5’-TTATATGGTACCATGAACATACGAGGGTCACCT(＝Seq ID9)，引物右5’-TTATATGAGCTCTTACTCGGCCGTCGGAGATGG(＝Seq ID10)
用Eco311消化第二次PCR反應(yīng)的PCR產(chǎn)物，分離較小片段(約200bp)。
用Bpil消化第一次PCR反應(yīng)的PCR產(chǎn)物。
連接200bp的片段和第一次PCR反應(yīng)的被消化片段，然后用Kpnl和Sacl消化，通過連接將其插入到已經(jīng)用Kpnl和Sacl消化了的pMOK載體上。得到的質(zhì)粒命名為pMOK p36。pMOK p36用于制備MIDGEp36-NLS(p36 LACK的序列顯示在Seq ID 2)。
激活ODN、將NLS序列連接到寡核苷酸上以及制備MIDGE p36-NLS按照上述方法進(jìn)行。
結(jié)果下列附圖中詳細(xì)描述獲得的結(jié)果附圖1表示總IgG HBsAg水平的測(cè)定。通過ELISA測(cè)定抗體水平，波長(zhǎng)入＝450nm時(shí)的吸收值讀作OD(光密度)。以質(zhì)粒和未修飾的MIDGE載體作為對(duì)照。具有不同連接的MIDGE表現(xiàn)為抗體滴度明顯升高，表明HBsAg表達(dá)量增加。采用縮寫pMOK質(zhì)粒MIDGE未修飾MIDGEM-NLS連接到NLS的MIDGEM-TAT連接到T肽的MIDGE附圖2表示在11周后用1μgDNA二次免疫的增強(qiáng)效果。在首次和第二次免疫中免疫所用DNA的含量為1μg。在本試驗(yàn)中，修飾的MIDGE仍然顯著提高免疫應(yīng)答。
附圖3和4表示抗HbsAg的IgG亞型IgG1和IgG2a的測(cè)定。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，連接到T肽和連接到NLS序列的MIDGE引起細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答(Th1)，這在抗體亞型分布中顯示。
附圖5表示在二次免疫和用碩大利什曼原蟲前鞭毛體攻擊感染后，抗體亞型分布IgG1和IgG2a的比例。免疫方式MIDGE p36-NLS/MIDGEp36-NLS具有引起細(xì)胞(Th1)免疫應(yīng)答的不可預(yù)期的效果。通過比較，pMOK p36/rVVp36方式引起的免疫應(yīng)答中Th2/Th1的波動(dòng)是細(xì)微的。
實(shí)驗(yàn)例1小鼠中HBsAg抗體的測(cè)定按照實(shí)施例4制備編碼乙肝表面抗原(亞型ay)MIDGE。通過ELISA測(cè)定乙肝抗原的抗體滴度來證實(shí)表達(dá)了所編碼抗原。根據(jù)實(shí)施例4制備MIDGE。特別地，制備未修飾的MIDGE和具有一個(gè)配體的MIDGE，特別是MIDGE-NLS和MIDGE-T。質(zhì)粒pMOK HBsAg作為附加對(duì)照。未處理小鼠的血清用作陰性對(duì)照。
將MIDGE(未修飾的以及NLS修飾的)和質(zhì)粒溶解在50μl pH7.2的磷酸鈉中，注射到Balb/c小鼠的皮內(nèi)。所用DNA的量為10μg，每只小鼠分別每次接種1μg。每組5只小鼠。11周后，進(jìn)行二次免疫(加強(qiáng))。在第2、4和8周，測(cè)定血清中抗體。結(jié)果在圖1中表示。當(dāng)使用10μg DNA時(shí)，在第4周可以觀察到總免疫球蛋白G(IgG)明顯增加，表明與質(zhì)粒相比，所有MIDGE構(gòu)建體所表達(dá)的HBsAg都升高。最好的效果是由被修飾的MIDGE引起。誤差桿顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差。首次使用1μg DNA不會(huì)引起HBsAg滴度在第4周顯著上升(結(jié)果未顯示)，但是，在第11周加強(qiáng)后出現(xiàn)滴度令人意外地急劇升高。而且，修飾的MIDGE具有最好效果(見附圖2)。這些結(jié)果表明即使是使用最小量的DNA，MIDGE也能產(chǎn)生高抗體滴度。
實(shí)驗(yàn)例2抗利什曼原蟲p36抗體的接種試驗(yàn)使用36kDa抗原，也稱為L(zhǎng)ACK，免疫接種產(chǎn)生抗碩大利什曼原蟲屬的有效保護(hù)。在免疫接種試驗(yàn)中，使用所有編碼免疫原性p36抗原的不同基因穿梭具有NLS連接的MIDGE、質(zhì)粒pMOK p36和重組牛痘病毒p36(rVV)。按照下表將表達(dá)構(gòu)建體注射到雌性小鼠(Balb/c)，與最有效的首次/加強(qiáng)免疫接種進(jìn)行比較。

每組10只小鼠。
DNA量為pMOK p36100μg，皮內(nèi)注射MIDGE p36-NLS54.8μg，皮內(nèi)注射rVVp365×107pfu/小鼠，腹腔注射并溶解在pH7.2磷酸鈉緩沖液中。
2周后，用各種DNA構(gòu)建體(見表)進(jìn)行二次免疫(加強(qiáng))。在加強(qiáng)后3周，用5×104碩大利什曼原蟲前鞭毛體攻擊感染。小鼠右后足皮下注射。
攻擊感染后8周，對(duì)所有小鼠放血取血清(見附圖6)。通過ELISA測(cè)定抗p36的總IgG抗體滴度以及測(cè)定IgG1和IgG2a，波長(zhǎng)入＝406nm時(shí)的吸收值讀作光密度。
序列表<110>莫洛根有限公司<120>提高免疫應(yīng)答的方法<130>XI 1420/02<150>DE 101 48 697.9<151>2001-10-02<150>DE 101 56 678.6<151>2001-11-12<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>4533<212>DNA<213>pMOK HBsAg<220>
<221>其他特征<222>(1839)..(1045)<223>卡那霉素抗性，反向互補(bǔ)<220>
<221>polyA_位點(diǎn)<222>(4080)..(4281)<223>
<220>
<221>其他特征<222>(2447)..(3243)<223>CMV<220>
<221>內(nèi)含子<222>(3250)..(3386)<223>
<220>
<221>其他特征<222>(3393)..(4073)<223>插入HBsAg subtyp ay<400>1tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta60tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag120aacatgtctc gggaggcctc acgtgacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac180cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac240aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg300tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac360ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat420ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag480cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac540ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt600gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt660atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc720aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga780aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac840gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc900cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct960gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca1020tccatagttg cctgactccc cgtctcagaa gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat1080gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc1140gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg tcctgacagc ggtccgccac1200
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<221>啟動(dòng)子<222>(2447)..(3243)<223>CMV<220>
<221>內(nèi)含子<222>(3250)..(3386)<223>
<220>
<221>其他特征<222>(3393)..(4331)<223>p36蛋白質(zhì)<220>
<221>polyA_位點(diǎn)<222>(4338)..(4539)<223>poly A位點(diǎn)aus SV 40<400>2tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta60tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag120aacatgtctc gggaggcctc acgtgacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac180cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac240aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg300tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac360ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat420ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag480cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac540ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt600gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt660atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc720aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga780aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac840gaaaactcac 9ttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc900
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<212>PRT<213>人類免疫缺陷病毒1型，TAT肽<400>3Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg1 5 10<210>4<211>7<212>PRT<213>猴病毒40，NLS肽<400>4Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val1 5<210>5<211>20<212>DNA<213>ODN 1<220>
<221>修飾的堿基<222>(12)..(12)<223>XT＝用反應(yīng)性氨基修飾的胸腺嘧啶<400>5gggagtccag ttttctggac20<210>6<211>20<212>DNA<213>ODN 2<400>6aggggtccag ttttctggac20<210>7
<211>33<212>DNA<213>1.PCR引物左<400>7ttatatggta ccatgaacat acgagggtca cct33<210>8<211>42<212>DNA<213>1.PCR引物右<400>8ttatatgagc tcagaagaca cggacaggga cctcttccgt cg42<210>9<211>33<212>DNA<213>2.PCR引物左<400>9ttatatggta ccatgaacat acgagggtca cct 33<210>10<211>33<212>DNA<213>2.PCR引物右<400>10ttatatgagc tcttactcgg ccgtcggaga tgg 3權(quán)利要求
1.在真核細(xì)胞中可操縱的DNA表達(dá)構(gòu)建體在制備用于皮內(nèi)注射引起1型細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的疫苗中的用途，其中所述構(gòu)建體在啟動(dòng)子序列的調(diào)控下編碼一種或多種抗原，且所述DNA表達(dá)構(gòu)建體被共價(jià)連接于一或多個(gè)寡肽以提高轉(zhuǎn)染效率。
2.權(quán)利要求1所述的DNA表達(dá)構(gòu)建體的用途，其中免疫接種多核苷酸序列以表達(dá)構(gòu)建體的形式存在，所述表達(dá)構(gòu)建體由含有線性雙鏈區(qū)的共價(jià)閉合線性脫氧核糖核酸分子組成，其中形成雙鏈的單鏈?zhǔn)峭ㄟ^由脫氧核糖核苷酸組成的短單鏈環(huán)連接，其中所述形成雙鏈的單鏈僅由在被免疫接種的動(dòng)物的體內(nèi)可操縱的啟動(dòng)子和終止子序列調(diào)控下的編碼序列組成。
3.權(quán)利要求1或2所述的DNA表達(dá)構(gòu)建體的用途，其中所述構(gòu)建體編碼乙肝表面抗原(HBsAg)。
4.前述的一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求所述的DNA表達(dá)構(gòu)建體的用途，其中寡肽具有5-25個(gè)氨基酸長(zhǎng)度并且其中至少一半氨基酸是由賴氨酸和精氨酸組成的組的成員之一。
5.權(quán)利要求4所述的DNA表達(dá)構(gòu)建體的用途，其中所述的寡肽含有核定位序列。
6.權(quán)利要求4或5所述的DNA表達(dá)構(gòu)建體的用途，其中所述的寡肽含有序列PKKKRKV(脯氨酸-賴氨酸-賴氨酸-賴氨酸-精氨酸-賴氨酸-纈氨酸)。
7.權(quán)利要求4或5所述的DNA表達(dá)構(gòu)建體的用途，其中所述的寡肽含有序列YGRKKRRQRRR。
8.使用權(quán)利要求1-7所述的DNA表達(dá)構(gòu)建體皮下注射來引起1型細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的疫苗。
9.權(quán)利要求8所述的疫苗，其中該疫苗存在于溶液中。
10.應(yīng)用于人類的權(quán)利要求8和9所述的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由注射抗原編碼表達(dá)構(gòu)建體來引起細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答的方法。根據(jù)本發(fā)明，使用微小化表達(dá)構(gòu)建體，其僅由啟動(dòng)子、編碼序列和終止子組成并且在它們的兩端包含發(fā)夾形脫氧核糖核苷酸，陽離子肽被共價(jià)連接到該環(huán)。皮內(nèi)注射這些偶聯(lián)了肽的表達(dá)構(gòu)建體后引起明顯的細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)類型。描述了在真核細(xì)胞中可操縱的DNA表達(dá)構(gòu)建體在制備皮內(nèi)注射引起1型細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的疫苗中的用途。
文檔編號(hào)C12N15/85GK1564694SQ02819588
公開日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2002年10月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月2日
發(fā)明者索尼婭·莫雷諾·洛佩斯, 馬科斯·蒂蒙·希門尼斯 申請(qǐng)人:莫洛根股份公司