專利名稱：多肽純化方法
技術領域：
本發(fā)明關于一種多肽純化的方法及用此法得到的產物。本發(fā)明尤其，但并非僅僅關于需經過折疊才可獲得生物活性的多肽的純化方法及其產物，如酪氨酸激酶受體TrkA，TrkB和TrkC及其生物活性變體和片段(全部稱作“酪氨酸激酶受體相關多肽”)。
背景技術：
酪氨酸激酶受體TrkA，TrkB和TrkC結合神經營養(yǎng)蛋白。TrkA具有與神經生長因子(NGF)及神經營養(yǎng)蛋白-3(NT3)高親和力結合的生物活性。TrkB和TrkC結合其它的神經營養(yǎng)蛋白。TrkB高親和力結合大腦衍生的神經營養(yǎng)因子(BDNF)和神經營養(yǎng)蛋白-4(NT4)。TrkC與NT3高親和力結合。對TrkB和TrkC的鑒定，克隆及測序在專利US6027927中有描述。每一種受體分子均含多個結構域。酪氨酸激酶受體分子的免疫球蛋白樣結構域(Ig)對應用于治療有特殊價值，尤其如申請人的尚未授權的專利申請WO99/53055描述的，TrkAIg2及其變體可用于治療，如剪接變體TrkAIg2.6。
由于治療上的應用需大規(guī)模生產酪氨酸激酶受體衍生多肽。在細菌表達系統(tǒng)中生產重組多肽有較多優(yōu)點，特別是其產量可高達人細胞表達系統(tǒng)的10倍。
表達得到的多肽處理困難，如TrkA的第二免疫球蛋白樣結構域TrkAIg2，通常以單體，二聚體和聚集體(即二聚體的聚合物，也可能是單體和二聚體的聚合物)的混合物的形式存在。而TrkBIg2和TrkCIg2特別是TrkAIg2的活性形式是單體。因此，產物不能發(fā)揮療效。如Robertson A.G.S.et al(Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 282(1)131-141 Mar 23 2001)所述TrkAIg2二聚體不能結合NGF因此無生物活性。少量的二聚體或聚集體極可能引起更多聚集體的產生導致有生物活性的單體數目的減少。這點比較特殊，因為許多蛋白會以單體，二聚體或四聚體達到動態(tài)平衡的形式存在(例如人生長激素)。為保證制品的長期穩(wěn)定性，需除去二聚體。和許多蛋白一樣，酪氨酸激酶受體相關多肽需有正確的構象才能有生物活性。多肽在細菌包涵體中發(fā)生錯誤的重折疊，未形成正確構象，因而無生物活性。多肽在重組表達系統(tǒng)表達后必須重新折疊成正確的構象。表達后的進一步折疊稱為“重折疊”。
我們僅知道另外有兩個研究小組在細菌細胞中制備重組體TrkAIg2。Ultsch et al(J Mol Biol(1999)290，149-159)制備TrkAIg2，TrkBIg2和TrkCIg2。他們以可溶性蛋白而非包涵體的形式制備TrkAIg2，通過離子交換，疏水作用，再離子交換，凝膠過濾純化產物。由于這里的凝膠過濾這一步驟并不能使多肽發(fā)生重折疊，我們推測多肽的可溶性蛋白形式已具有正確構象。TrkBIg2和TrkCIg2盡管用相同的方法表達，但不可溶，需將它們溶于尿素并通過透析法重折疊，再用離子交換法進一步純化。得到的TrkAIg2，TrkBIg2和TrkCIg2晶體為鏈交換的二聚體，即，一個單體的A鏈和另一單體的B鏈配對形成的二聚體(見圖1)。圖1顯示了一個鏈交換的含有2個TrkAIg2單體的二聚體，其中單體X的A鏈未折疊，與單體Y的B鏈結合。同時，單體Y的A鏈未折疊，與單體X的B鏈結合。它們都沒有活性。文獻的討論部分提到這些二聚體不能與天然配體結合，在293細胞中作為免疫粘附素表達的結構域則相反(Urfer et al(1995)ENBOJournal 14，12，p2795-2805)。TrkAIg2-免疫粘附素分子結構在動物細胞中結合NGF的活性應歸功于含有TrkAIg2正確構象的免疫粘附素大支架結構(IgG的Fc段)，它引起廣泛的糖基化并顯著影響此結構與其它分子的結合。
Windisch et al(Windisch，J M.et al(1995)J.Biol Chem.270 47p28133-28138)以麥芽糖結合蛋白融合結構生產了包括TrkAIg2的TrkA衍生物，但這個結構是沒有活性的，不能用于治療。麥芽糖結合蛋白結構與“困難”蛋白一起使用。曾以為其結構是正確折疊的，現在發(fā)現事實并非如此。
Wiesmann et al(Nature，9thSeptember 1999 401，184-188)通過同時加入NGF和TrkAIg1.2即含有兩個TrkA Ig樣結構域的多肽得到NGF和TrkAIg2的共結晶物。經過很長一段時間，TrkAIg1被慢慢“吃掉”，只留下TrkAIg2與NGF結合。這種方法不適合商業(yè)化生產酪氨酸激酶受體相關多肽。
Holden et al(Holden，P.H.et al Nature Biotechnology，15，July 1997page 668-672)描述了一種方法，可在E.coli中以包涵體形式生產酪氨酸激酶受體相關多肽活性片段及衍生物。此法將多肽從包涵體中提取后通過一個透析步驟重新折疊，但產率僅約16毫克/升。專利WO99/53055描述了一個類似的純化方法，可純化從E.coli包涵體獲得的包括TrkAIg2的TrkA活性片段及其衍生物，也需要透析，產率為約50毫克/升。但產物的穩(wěn)定性較低，需立即快速冷凍才可進一步使用。
如上所述，在Ultsch et al，WO99/53055和Holden et al中描述的方法均有透析的步驟。透析的缺點在于需大量透析緩沖液控制多肽的濃度(一般約為0.1毫克/毫升)以防止多肽的聚合。因此包括透析步驟的酪氨酸激酶受體相關多肽的生產方法都不適合商業(yè)化生產。
本發(fā)明的一個目的是提供一種生產多肽特別是酪氨酸激酶受體相關多肽的方法，比以前的工藝有更高的產率。本發(fā)明進一步的目的是提供一種方法，得到比以前的工藝有更高穩(wěn)定性的產物。
發(fā)明概要如本發(fā)明的一個方面所述，提供了一種生產酪氨酸激酶受體相關多肽的方法，該方法包括在重組表達系統(tǒng)表達酪氨酸激酶受體相關多肽，并通過分離步驟將表達得多肽的單體形式從多聚體的形式中分離出來，而且在分離步驟中，表達得多肽重新折疊成具有生物活性的形式。
這個方法較之以前的工藝有以下優(yōu)點。首先，此法的產率有了顯著提高。其次，此法使多肽的商業(yè)化大規(guī)模生產成為可能。第三，此法不需要單獨的透析步驟進行重折疊。由于透析要求多肽在低濃度下長時間進行重折疊，會消耗大量昂貴的緩沖液。透析之后需要一個回收多肽的步驟，通過離子交換或親和分離實現。離子交換需提高NaCl濃度洗脫產物，往往導致多肽的聚合。而親和分離，比如用組氨酸標記后經鎳螯合柱分離，同樣需高濃度NaCl，用咪唑洗脫，經凝膠過濾除去雜質。第四，此法比以前含透析步驟的工藝快速，因為透析需過夜處理。第五，此法得到的產物更加穩(wěn)定。產物可在約4℃穩(wěn)定存在至少三個月，無需立即快速冷凍。由于產物二聚化程度低，進一步聚合的可能性減小。第六，產物可在較高濃度下得到(高達650μM)，并且不產生鏈交換的二聚體。第七，由于多肽無需如透析所要求的和尿素長時間接觸，酰胺化的可能性很小。酰胺化會影響生物活性，同時，在檢驗活性時用氨聯法連接多肽和芯片基質的難度也會增大。這些優(yōu)點使得用本發(fā)明提供的方法生產的多肽在某些應用中，如生物傳感器，更加實用。
酪氨酸激酶受體可以是天然TrkA，TrkB或TrkC或其活性同源物，變體，片段或含有這些同源物，變體，片段的結構。多肽最好是TrkAIg2或TrkBIg2，特別適合用本發(fā)明提供的方法生產的多肽是TrkA，TrkB，TrkC受體的Ig2亞結構域，最好是TrkAIg2或TrkAIg2.6。
適合的結構可以包括相應天然受體的附加C末端序列。
多肽可帶有一段組氨酸標記序列被表達。酪氨酸激酶受體序列最好是人源的。酪氨酸激酶受體相關多肽可以不可溶的形式被表達。酪氨酸激酶受體相關多肽最好在細菌包涵體中表達。多肽多聚體形式包括二聚體。多肽最好能夠高親和力地與天然酪氨酸受體配體結合。
分離步驟最好含凝膠過濾。鹽濃度在0mM-500mM范圍內比較合適，25mM-200mM更佳，最佳約為100mM，如80mM-120mM。所用凝膠最好能分離分子量約為12-40KDa的分子，如Sephacryl 200，SuperDex 75或SuperDex 200。
分離步驟最好在堿性pH下進行，且低于發(fā)生變性的pH。一般選擇pH8-9，最佳pH8.5。TrkA例外，因為TrkAIg2理論等電點為4.6-6.0。TrkAIg2結構含很多β-折疊，此類蛋白大多會在其pI附近發(fā)生聚集和沉淀。然而，TrkAIg2在正常鹽濃度的溶液中會在生理pH附近聚集和沉淀，這個值與其pI明顯不符。
凝膠過濾時，洗脫速度最好為2.5毫升/分鐘，約93分鐘時收集單體。這個時間會隨儀器和操作條件的變化而變化。多肽最好用細菌表達系統(tǒng)生產。
根據本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，提供了一種用細菌表達系統(tǒng)從包涵體中純化重組TrkAIg2或TrkAIg2.6的方法。在這個方法中，通過凝膠過濾的步驟將TrkAIg2單體從TrkAIg2的單體和多聚體的混合物中分離出來，并發(fā)生重折疊形成活性形式。典型的TrkAIg2多聚體包括TrkAIg2二聚體。
本發(fā)明也提供了一種用本發(fā)明提供的方法得到或能夠得到的穩(wěn)定的TrkAIg2制品，此制品中TrkAIg2二聚體或二聚體聚集物的含量小于20％，較佳的小于1％，最佳的小于0.1％。
本發(fā)明也提供了一種用本發(fā)明提供的方法得到或能夠得到的穩(wěn)定的TrkAIg2制品，此制品中TrkAIg2單體含量高于80％，較佳的高于99％，最佳的100％。更可取地，單體實際上均以活性形式存在。
本發(fā)明也提供了一種用本發(fā)明提供的方法得到或能夠得到的TrkAIg2.6制品，此制品中TrkAIg2.6二聚體或二聚體聚集物的含量小于20％，較佳的小于1％，最佳的小于0.1％。
本發(fā)明也提供了一種用本發(fā)明提供的方法得到或能夠得到的穩(wěn)定的TrkAIg2.6制品，此制品中TrkAIg2.6單體含量高于80％，較佳的高于99％，最佳的100％。更可取地，單體實際上均以活性形式存在。
本發(fā)明也提供了一種用本發(fā)明提供的方法得到或能夠得到的穩(wěn)定的TrkBIg2制品，此制品中TrkBIg2二聚體或二聚體聚集物的含量小于20％，較佳的小于1％，最佳的小于0.1％。
本發(fā)明也提供了一種用本發(fā)明提供的方法得到或能夠得到的穩(wěn)定的TrkBIg2制品，此制品中TrkBIg2單體含量高于80％，較佳的高于99％，最佳的100％。更可取地，單體實際上均以活性形式存在。
本發(fā)明也提供了一種用本發(fā)明提供的方法得到或能夠得到的穩(wěn)定的TrkCIg2制品，此制品中TrkCIg2二聚體或二聚體聚集物的含量小于20％，較佳的小于1％，最佳的小于0.1％。
本發(fā)明也提供了一種用本發(fā)明提供的方法得到或能夠得到的穩(wěn)定的TrkCIg2制品，此制品中TrkCIg2單體含量高于80％，較佳的高于99％，最佳的100％。更可取地，單體實際上均以活性形式存在。
根據本發(fā)明的另一個方面，提供了一種從免疫球蛋白樣多肽的單體和多聚體的混合物中獲得單體的方法。此方法包括在重組表達系統(tǒng)中表達多肽，經一個分離步驟將多肽的單體從單體和多聚體的混合物中分離出來并使單體重折疊形成活性形式。因此，本發(fā)明提供了一種純化免疫球蛋白樣多肽的方法，它具有上述某些或所有優(yōu)點。分離步驟最好包括凝膠過濾。


本發(fā)明涉及的方法和產物以實例描述，并參考附圖2-22圖2顯示氨基酸序列(A)TrkAIg2和TrkAIg2.6；(B)TrkBIg2截短形式和全長形式(黑體字；pET15b序列(MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM)非黑體字)；(C)TrkCIg2截短形式和全長形式(黑體字；pET15b序列(MGSSHHHHHH SSGLVPRGSHM)非黑體字)；圖3是FPLC儀記錄在以前所用的透析法和本發(fā)明提供的方法這兩者間進行比較的比較試驗的覆蓋物圖錄(overlay trace)；圖4顯示不同pH對實驗結果影響的一系列圖錄；圖5顯示用不同體積的透析緩沖液進行比較試驗的一系列圖錄；圖6顯示用本發(fā)明生產的TrkAIg26His和TrkAIg2.66His的質譜分析結果；圖7顯示TrkBIg26His與A:BDNF和B:NT4的結合活性實驗結果；圖8顯示TrkAIg26His與NGF的結合活性實驗結果；圖9顯示TrkAIg2.66His與NGF的結合活性實驗結果；圖10顯示用本發(fā)明生產的TrkBIg26His的質譜分析結果；圖11顯示用PC12細胞神經突生長生物測定法檢測TrkAIg26His的實驗結果；圖12顯示用本發(fā)明生產的TrkCIg26His的質譜分析結果；圖13顯示TrkCIg26His與NT-3的結合活性實驗結果；圖14顯示TrkAIg26His mRNA的預測結構；圖15顯示TrkAIg2noHis mRNA的預測結構；圖16顯示TrkAIg2noHis的一種突變體，有利于TrkAIg2noHis的表達；圖17顯示圖16所示序列的mRNA的預測結構；
圖18顯示圖16所示突變序列pET24a-TrkAIg2noHis在E.coli中表達后的細胞提取物的SDS-PAGE凝膠檢測結果；圖19顯示用本發(fā)明生產的TrkAIg2noHis的質譜分析結果；圖20顯示用PC12細胞神經突生長生物測定法檢測TrkAIg2noHis的實驗結果；圖21顯示TrkBIg2noHis的一種突變體，有利于TrkBIg2noHis的表達；圖22顯示TrkCIg2noHis的一種突變體，有利于TrkCIg2noHis的表達。
定義“多肽”這個名詞包括蛋白質，即，天然的具有生物活性的全長形式的多肽。
“TrkAIg2”一種含有圖2A黑體字所示的氨基酸序列的多肽(無論是否帶有劃線部分的可得到TrkAIg2.6變體的6個氨基酸殘基)和同源物(如序列中的一個或多個氨基酸改變后得到的保守產物)或含有可提高表達和/或純化效率的序列的變體，如末端組氨酸序列和凝血酶裂解序列(圖2非黑體字所示)。
“TrkBIg2”和“TrkCIg2”有相似的含義，分別參考圖2B和圖2C所示序列。
“TrkAIg26His”代表含末端組氨酸標記的變體，“TrkAIg2noHis”代表不含末端組氨酸標記的變體。類似的名詞也適用于相應的TrkB和TrkC的變體及其蛋白。
具體說明末端組氨酸標記的TrkIgs的生產重組TrkAIg26His和TrkAIg2.66His多肽的生產重組TrkAIg26His在E.coli BL21(DE3)中生產，具體方法在專利WO99/53055題為“TrkAIg1，2，TrkAIg1和TrkAIg2的表達”的部分中有描述，再將末端6個組氨酸序列連接到多肽的N-端，如圖2A所示。重組TrkAIg2.66His用相同方法制備。
TrkAIg26His多肽的純化和重折疊收集的細胞在10％的甘油溶液中重懸，用-70℃的液氮冷凍。得到的固體三次通過Xpress(AB Biox)。提取物以10000rpm的速度于4℃離心30分鐘，沉淀含重組多肽的不溶性包涵體。
包涵體依次用500ml 1％(V/V)Triton X-100，10mM TrisHClpH8.0，接著用1mM EDTA溶液，500ml 1M NaCl，10mM TrisHClpH8.0，1mM EDTA溶液，最后用500ml 10mM TrisHCl pH8.0，1mMEDTA溶液洗滌三次。
然后將包涵體溶解在20mM磷酸鈉，30mM咪唑，8M尿素(pH7.4)的溶液中，離心澄清。8M尿素可用6M胍鹽代替。
離心后的上清液混合物上5ml HisTrap柱(Pharmacia)，用50ml的20mM磷酸鈉，30mM咪唑，8M尿素(pH7.4)的溶液洗滌，純化的TrkAIg26His用25ml的20mM磷酸鈉，300mM咪唑，8M尿素(pH7.4)的溶液洗脫。
為使純化的重組TrkAIg26His多肽重折疊，上一步得到的洗脫物上SuperDex 200凝膠過濾柱，用20mM磷酸鈉，100mM NaCl，pH8.5的溶液平衡。柱高65厘米，寬2.6厘米，容積345毫升，由制造商預裝。最大壓力下的流速為2.5毫升/分鐘。
任何聚集體(即，二聚體的聚集物)在空體積(void volume)中被洗脫。二聚體在約80分鐘時被洗脫，單體在約93分鐘時被洗脫。每種蛋白的洗脫時間與柱的直徑和蛋白大小有關。見下面的公式R＝Vo/VeR是蛋白的滯留系數，Ve為蛋白洗脫體積，Vo為空體積這里，Ve＝232.5ml，Vo＝122ml122/232.5＝0.53TrkAIg26His單體對SuperDex 200凝膠的滯留系數為0.53。
多肽用透析法折疊作為比較。先溶于20mM TrisHCl，50mM NaCl，pH8.5的溶液，用HisTrap柱捕獲，再用25ml的20mM磷酸鈉，300mM咪唑，8M尿素(pH7.4)的溶液洗脫。
Biocad Sprint FPLC(Biocad)記錄不同制備條件下TrkAIg26His單體，二聚體，聚集體的洗脫情況。圖3顯示了用兩種不同的方法透析法(Dialysis)和本發(fā)明所述的方法(“SuperDex”)得到的TrkAIg26His重折疊產物進行比較試驗洗脫過程的覆蓋物圖錄?？梢?，本發(fā)明所述方法可以得到更多的單體。
剪接變體TrkAIg2.66His用相同的方法制備并純化。
PH對TrkAIg26His洗脫的影響如前所述，TrkAIg26His在E.coli中表達，純化的包涵體溶解在20mM磷酸鈉，30mM咪唑，8M尿素(pH7.4)的溶液中，離心澄清，上HisTrap柱親和純化，用25ml的20mM磷酸鈉，300mM咪唑，8M尿素(pH7.4)的溶液洗脫。TrkAIg26His洗脫物上SuperDex200凝膠過濾柱(Pharmacia)，用20mM磷酸鈉，100mM NaCl，pH8.5的溶液平衡。流速為2.5毫升/分。洗脫時間由蛋白大小決定。單體，二聚體，聚集體的峰值分別在約93分鐘，80分鐘，50分鐘時出現。圖4顯示pH分別為7.4，8.0，8.5和9.0時的洗脫結果?？梢钥吹?，pH8.5時產率最高，且單體含量最高，聚集體含量最低。
比較試驗分離用透析法重折疊得到的TrkAIg26His產物的單體，二聚體和聚集體。需大量的透析緩沖液。SuperDex 200洗脫分析。
TrkAIg26His在E.coli中表達，純化的包涵體溶解在20mM磷酸鈉，30mM咪唑，8M尿素(pH7.4)的溶液中，離心澄清，上HisTrap柱親和純化，用25ml的20mM磷酸鈉，300mM咪唑，8M尿素(pH7.4)的溶液洗脫。得到的TrkAIg26His用透析法重折疊，溶于20mM TrisHCl，50mM NaCl，pH8.5的溶液(分別用1升，2升，4升)，處理過夜。用HisTrap柱捕獲，再用25ml的20mM磷酸鈉，50mMEDTA，8M尿素(pH7.4)的溶液洗脫。洗脫物上SuperDex 200凝膠過濾柱，用20mM磷酸鈉，100mM NaCl，pH8.5的溶液平衡。流速為2.5毫升/分鐘。需2-4升緩沖液洗滌。當透析緩沖液用量為4升時，單體的產量最高。這個結果顯示若用透析法重折疊多肽所需透析緩沖液的量。
結果見圖5。
用本發(fā)明提供的方法生產的TrkAIg26His和TrkAIg2.66His的特性表達的TrkAIg26His(A)和TrkAIg2.66His(B)多肽用MALDITOF質譜儀檢測分子量，結果見圖6。多肽的分子量用PE BiosystemVoyager-DE STR Matrix-Assisted Laser Desorption Time-of-Flight(MALDITOF)質譜儀測定，氮激光波長為337nm。將芥子酸溶于乙腈和0.1％三氟乙酸的50∶50的混合液，濃度為1mg/100μl，制備新鮮的基質溶液。將0.5μl的樣品和基質點樣到樣品盤中。樣品與作為一個接近的外標準(close external standard)使用的Calmix 3(PEBiosystems)對比來進行校準。在25000V加速電壓，750nsec的提取時間和2700激光強度的線性條件下，波譜范圍可達到5000-80000Da。
測得的TrkAIg26His的分子量為15717.96Da。與其預測的理論分子量(15716.3Da，N-端甲硫氨酸失去后，而這個甲硫氨酸在由表達型載體pET15b得到的帶有末端組氨酸標記的蛋白中也已被除去)相當吻合。
測得的TrkAIg2.66His的分子量為16575.3Da。與其預測的理論分子量(16574.4Da)相當吻合。
穩(wěn)定性用上述方法制得的TrkAIg26His和TrkAIg2.66His在4℃時可穩(wěn)定存在三個月且未失去活性。
加入某些添加劑，如甘油可提高穩(wěn)定性。
用本發(fā)明提供的方法生產的TrkAIg26His的生物活性i.豚鼠后肢疼痛反應用本發(fā)明提供的方法生產的TrkAIg26His的生物活性用豚鼠檢驗(Djouhri，L.et al(2001)J.Neuroscience 21 p8722-8733)。CFA(弗氏完全佐劑)注射豚鼠的后肢和膝蓋，引起的炎癥將提高NGF的水平，使動物對痛覺更加敏感。用玻璃微電極對L6(腰部)細胞和S1(骶骨部)DRG神經元進行細胞內紀錄，鉑電極刺激DRG產生作用電位。紀錄分別在注射CFA后1，2，4天進行。C和Aδ纖維是感受傷害的—它們可將痛覺信號傳到大腦。α和β纖維則不是。人的傷害性神經原在無外界刺激時自發(fā)放電是對炎癥和神經性疼痛的反應。
在第2，3，4天給豚鼠的后肢和膝蓋注射TrkAIg26His 0.45μg，TrkAIg26His可與內源性NGF螯合，消除了CFA誘導的自發(fā)性放電頻率的增加。這意味著完全止痛。
因此，TrkAIg26His能夠抑制豚鼠對CFA誘導的痛覺纖維放電的疼痛反應。
ii.PC12細胞生物測定用本發(fā)明提供的方法生產的TrkAIg26His的生物活性用PC12細胞神經突生長生物測定方法檢測。PC12細胞是一種大鼠嗜鉻細胞瘤細胞株，其表面有NGF受體，在NGF刺激下，PC12細胞體長出神經突。PC12細胞用完全DMEM培養(yǎng)液(含100單位/毫升青霉素，100μg/ml鏈霉素，10％馬血清，10％胎牛血清(FCS)和2mM谷氨酸)稀釋，以每孔2×104個細胞加到膠原蛋白包被的24孔板上，加入NGF，濃度為1ng/ml，并分別加入不同濃度的TrkAIg26His。結果如圖11所示，為48小時后神經突生長的照片。細胞需先固定。圖11A為僅加入1ng/ml NGF時的神經突起，圖11B顯示當加入TrkAIg26His1.25μm時，無神經突生長。
因此，TrkAIg26His能夠抑制PC12細胞在NGF刺激下的神經突的生長。
TrkBIg26His結構域亞克隆TrkBIg26His蛋白含成熟蛋白的286-430的氨基酸殘基，及氨基末端的21個殘基，這21個殘基含有組氨酸表達標記和凝血酶裂解序列。編碼TrkBIg26His結構域的cDNA序列來源于λZAP-pBluescriptllSK(-)/TrkB，有我們克隆得到的人TrkB的一個非催化形式(Allen et al(1994)Neuroscience 60 p825-834)，將此cDNA序列PCR擴增。引物(MWG Biotech)引入酶切位點正向引物為Ndel位點(CGCATATGGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTC)，反向引物為BamHI位點(GCGGATCCCTATTAATGRRCCCGACCGGTTTTATC)。
PCR產物亞克隆到pET15b(Novagen)中，構建表達型載體pET15b-TrkBIg26His。
如圖2B所示的TrkBIg26His截短形式以相同的方法生產，但所用的氨基酸序列為286-383殘基。此截短形式與其配體NT4共結晶，并以X射線晶體結構獲得解釋。
重組TrkBIg26His多肽的生產電感受態(tài)E.coli BL21(DE3)細胞用pET15b-TrkBIg26His轉化，按pET(Vovagen)操作手冊進行表達。轉化后，E.coli細胞裂解液用SDS-PAGE分析18.5Kda的目的蛋白的表達。TrkBIg26His蛋白在可溶于尿素的組分中高水平表達，在其他組分不表達。挑取一個菌落接種到2ml的2YT培養(yǎng)液(含200μg/ml青霉素)中，在37℃培養(yǎng)到對數生長期中期，再接種到50ml的2YT培養(yǎng)液(含200μg/ml青霉素)中，在37℃培養(yǎng)到對數生長期中期，第三次接種到5L的2YT培養(yǎng)液(含200μg/ml青霉素)中，繼續(xù)培養(yǎng)到600nm下光密度為1.0。加入1mM IPTG誘導蛋白表達。菌體在37℃培養(yǎng)過夜。收集菌體，在10％甘油溶液中重懸，-80℃冷凍。冷凍的菌體三次通過Xpress后裂解。連續(xù)用分別含0.1M NaCl，1％Triton X-100，1M NaCl的20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.5)洗滌三次，以除去所有可溶性雜質，只留下含有不溶性蛋白的包涵體。
TrkBIg26His多肽的重折疊含不溶性TrkBIg26His蛋白的包涵體在菌體經Xpress裂解后釋放出來，洗滌除去可溶性雜質。純化后的包涵體溶于8M尿素緩沖液(20mM磷酸鈉，pH8.5，1mMβ-巰基乙醇)，加入“完全”蛋白酶抑制劑混合物片劑(Roche)，于室溫緩慢震蕩培養(yǎng)2小時。8M尿素可用6M胍鹽代替。TrkBIg26His蛋白在還原狀態(tài)下(20mM磷酸鈉，pH8.5，8M尿素，10mM咪唑)用HisTrap鎳柱(Pharmacia)純化，用300mM咪唑洗脫。洗脫物上SuperDex 200凝膠過濾柱(Pharmacia)，在非還原狀態(tài)下(20mM磷酸鈉，pH8.5，100mMNaCl)發(fā)生重折疊。收集分子量約為18.5KDa的洗脫峰，得到的組分含TrkBIg26His單體。
用本發(fā)明提供的方法生產的TrkBIg26His的特性TrkBIg26His的分子量用PE Biosystem Voyager-DE STRMALDITOF質譜儀測定，氮激光波長為337nm。將芥子酸溶于乙腈和0.1％三氟乙酸的50∶50的混合液，濃度為1mg/100μl，制備新鮮的基質溶液。將0.5μl的樣品和基質點樣到樣品盤中。樣品與作為一個接近的外標準使用的Calmix 3(PE Biosystems)對比來進行校準。在25000V加速電壓，750ns的提取時間和2700激光強度的線性條件下，波譜范圍可達到5000-80000Da。
測得的TrkBIg26His的分子量為18451.7Da。與其預測的理論分子量(18449.1Da)相當吻合。
重組TrkCIg26His結構域亞克隆TrkCIg26His蛋白含成熟蛋白的300-399的氨基酸殘基，及氨基末端的21個殘基，這21個殘基含有組氨酸表達標記和凝血酶裂解序列。編碼TrkCIg26His結構域的cDNA序列用引入Ndel酶切位點的正向引物(CGCATATGACTGTCTACTATCCCCCAC)和引入BamHI酶切位點的反向引物(GCGGATCCTTATCAGGGCTCCTTGAGGAAGTGGC)進行PCR擴增。PCR產物亞克隆到pET15b(Novagen)中，構建表達型載體pET15b-TrkCIg26His。
重組TrkCIg26His多肽的生產電感受態(tài)E.coli BL21(DE3)細胞用pET15b-TrkCIg26His轉化，按pET(Vovagen)操作手冊進行表達。轉化后，E.coli細胞裂解液用SDS-PAGE分析13.8KDa的目的蛋白的表達。TrkCIg26His蛋白在可溶于尿素的組分中高水平表達，在其他組分不表達。挑取一個菌落接種到2ml的2YT培養(yǎng)液(含200μg/ml青霉素)中，在37℃培養(yǎng)到對數生長期中期，再接種到50ml的2YT培養(yǎng)液(含200μg/ml青霉素)中，在37℃培養(yǎng)到對數生長期中期，第三次接種到5L的2YT培養(yǎng)液(含200μg/ml青霉素)中，繼續(xù)培養(yǎng)到600nm下光密度為1.0。加入1mM IPTG誘導蛋白表達。菌體在37℃培養(yǎng)過夜。收集菌體，在10％甘油溶液中重懸，-80℃冷凍。冷凍的菌體三次通過Xpress后裂解。連續(xù)用分別含0.1M NaCl，1％Triton X-100，1M NaCl的20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)洗滌三次，以除去所有可溶性雜質，只留下含有不溶性蛋白的包涵體。全部洗滌在4℃下進行。
TrkCIg26His多肽的重折疊含不溶性TrkCIg26His蛋白的包涵體在菌體經Xpress裂解后釋放出來，洗滌除去可溶性雜質。純化后的包涵體溶于8M尿素緩沖液(20mM磷酸鈉，pH8.0，1mM β-巰基乙醇)，于室溫緩慢震蕩培養(yǎng)2小時。8M尿素可用6M胍鹽代替。TrkCIg26His蛋白在還原狀態(tài)下(20mM磷酸鈉，pH8.0，8M尿素，10mM咪唑)用HisTrap鎳柱(Pharmacia)純化，用300mM咪唑洗脫。洗脫物上SuperDex 200凝膠過濾柱(Pharmacia)，在非還原狀態(tài)下(20mM磷酸鈉，pH8.0，100mM NaCl，1Mm β-巰基乙醇)發(fā)生重折疊。收集分子量約為13.8KDa的洗脫峰，含TrkCIg26His的單體。TrkCIg26His的滯留系數為0.51。
用本發(fā)明提供的方法生產的TrkCIg26His的特性TrkCIg26His的分子量用PE Biosystem Voyager-DE STRMALDITOF質譜儀測定，氮激光波長為337nm。將芥子酸溶于乙腈和0.1％三氟乙酸的50∶50的混合液，濃度為1mg/100μl，制備新鮮的基質溶液。將0.5μl的樣品和基質點樣到樣品盤中。樣品與作為一個接近的外標準使用的Calmix 3(PE Biosystems)對比來進行校準。在25000V加速電壓，750ns的提取時間和2700激光強度的線性條件下，波譜范圍可達到5000-80000Da。結果如圖12所示。
測得的TrkCIg26His的分子量為13681.9Da。與其預測的理論分子量(13685.3Da，N-端甲硫氨酸失去后，而這個甲硫氨酸在由表達型載體pET15b得到的帶有末端組氨酸標記的蛋白中也已被除去)相當吻合。
活性試驗TrkAIg26His，TrkAIg2.66His，TrkBIg26His和TrkCIg26His的結合活性獲得的重組TrkIg2單體可與各自全長受體的天然配體結合，且親和力與野生型受體相當，這意味著重組產物是有生物活性的。相反，鏈交換的TrkBIg26His二聚體無生物活性。
TrkIg2結構域與各自配體的結合力用BiaCore system(BiaCore)的基因表面共振法檢測。TrkIg2通過胺偶合與CM5芯片(chip)的基質相連。
TrkIg2的結合活性，表面質?；?plasmon)共振i.TrkBIg26HisBDNF以0.1-25nM的濃度通過芯片，結合速率和解離速率根據1∶1朗氏結合模型估算，KD值為790pM。NT-4以1-100nM的濃度通過芯片，結合速率和解離速率根據1∶1朗氏結合模型估算，KD值為260pM。結果見圖7。圖7A顯示BDNF在0.1，0.2，0.5，1.2，5，10和25nM(均重復實驗)濃度下的實驗結果。在給定KD值下，結合速率和解離速率符合1∶1朗氏結合模型(Chi2＝4.39)。
圖7B顯示NT-4在1，5，25，50，75和100nM(均重復實驗)濃度下的實驗結果。在給定KD值下，結合速率和解離速率符合1∶1朗氏結合模型(Chi2＝2.85)。
ii.TrkAIg26HisNGF以0.1-100nM的濃度通過芯片，結合速率和解離速率根據1∶1朗氏結合模型估算，KD值為92.6pM。結果見圖8。
iii.TrkAIg2.66HisNGF以0.1-100nM的濃度通過芯片，結合速率和解離速率根據1∶1朗氏結合模型估算，KD值為72.9pM。結果見圖9，顯示出很高的親和力，與生物膜上的野生型受體相當。
Djouhri，L.et al(supra)表明TrkAIg26His在體內有抑制傷害性神經異常放電的作用。
iv.TrkCIg26HisNT-3以0.1-100nM的濃度通過芯片。芯片用10μl 10mM的甘氨酸在pH1.5下處理可再生。結合速率和解離速率根據1∶1朗氏結合模型估算，KD值為200μM。結果見圖13。
無組氨酸末端標記的TrkAIgs的生產TrkAIg2noHis的克隆TrkAIg2克隆到pET24a中表達無組氨酸末端標記的TrkAIg2(TrkAIg2noHis)。若無修飾，蛋白不能被表達。
眾所周知，mRNA的二級結構會干擾AUG翻譯起始密碼子和/或核糖體結合位點。用軟件MOFOLD(http//bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/mfold，html)去審查二級結構顯示轉錄起始位點對表達并不理想。圖14顯示pET15b中的TrkAIg26His mRNA的預測結構。編碼組氨酸的mRNA，核糖體結合位點(RBS)及脯氨酸殘基(PRO)的密碼子用輪廓線標出。圖15顯示pET24a中的TrkAIg2noHis mRNA的預測結構?？梢钥吹?，其起始位點較6His模型更難接近。相似的空間位阻在TrkBIg2noHis和TrkCIg2noHis中也存在。
用軟件預測mRNA結構，為消除RBS的空間位阻，在TrkAIg2noHis中導入沉默突變。圖16給出了野生型及一個突變的DNA序列，突變堿基以黑體字標出。用MFOLD預測的mRNA結構見圖17。圖21和圖22分別給出了TrkBIg2noHis和TrkCIg2noHis的突變序列。
來源于pET15b-TrkAIg26His質粒的TrkAIg2序列經PCR擴增，正向引物含突變后的堿基GGAATTCCATATGCCTGCTTCAGTACAATTACACACGGCGGTC，反向引物CCGCTCGAGTTATCATTCGTCCTTCTTCTCCACCGGGTCTCCA。引物在TrkAIg2noHis的5’及3’段分別引入Ndel和XhoI的酶切位點。反應時引物加樣量為100-1000pmol。
PCR程序如下94℃預變性15分鐘后加入PFU聚合酶，94℃變性1分鐘，67℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，循環(huán)30次。最后72℃延伸10分鐘，于4℃放置。PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳分析。TrkAIg2noHis克隆到經Ndel和XhoI消化的pET24a構建表達型載體pET24a-TrkAIg2noHis。
圖18顯示E.coli表達的TrkAIg2noHis的SDS-PAGE分析結果，(M)標記物，(W)全部細胞提取物，(S)可溶性提取物，(I)不溶性提取物?？梢?，TrkAIg2noHis主要在不溶性組分中表達。
重組TrkAIg2noHis多肽的生產電感受態(tài)E.coli BL21(DE3)細胞用pET24a-TrkAIg2noHis轉化，按pET(Vovagen)操作手冊進行表達。轉化后，E.coli細胞裂解液用SDS-PAGE分析13.5KDa的目的蛋白的表達。TrkAIg2noHis蛋白在可溶于尿素的組分中高水平表達，在其它組分不表達。挑取一個菌落接種到2ml的2YT培養(yǎng)液(含50μg/ml鏈霉素)中，在37℃培養(yǎng)到對數生長期中期，再接種到50ml的2YT培養(yǎng)液(含50μg/ml鏈霉素)中，在37℃培養(yǎng)到對數生長期中期，第三次接種到5L的2YT培養(yǎng)液(含50μg/ml鏈霉素)中，繼續(xù)培養(yǎng)到600nm下光密度為1.0。加入1mM IPTG誘導蛋白表達。菌體在37℃培養(yǎng)3小時。收集菌體，在10％甘油溶液中重懸，-80℃冷凍。
制備包涵體冷凍的菌體通過Xpress處理后與20mMTris緩沖液pH8.5，1mMPMSF，10mM EDTA混勻，輕輕地吸移出來，加入20mM Tris緩沖液pH8.5。然后以9000rpm的轉速離心60分鐘，去上清。該步驟重復用20mMTris緩沖液pH8.5，1mM PMSF，10mM EDTA，1M NaCl洗滌沉淀，輕輕地吸移出來加入1％Triton X-100。沉淀最后用20mMTris緩沖液pH8.5，1mM PMSF，10mM EDTA洗滌，于9000rpm離心30分鐘，去上清，得到包涵體，在-70℃冷凍。所有的洗滌操作都在4℃進行。
包涵體可用8M尿素溶解，加入20mM Tris緩沖液pH8.5，25mMDTT，在14℃處理3小時。
TrkAIg2noHis的重折疊含不溶性TrkAIg2noHis蛋白的包涵體在菌體經Xpress裂解后釋放出來，用Triton X-100洗去可溶性雜質。純化后的包涵體溶于8M尿素緩沖液(20mM Tris pH8.5，25mM DTT)，于室溫緩慢震蕩培養(yǎng)3小時。
純化在離子交換柱上進行，如Q Sepharose Fast Flow(Pharmacia)，平衡和跑柱均用加了10mM DTT的8M尿素(pH8.5)緩沖液。若用NaCl濃度梯度洗脫，蛋白約在180mM NaCl時被洗脫，若用一步洗脫，則用200mm的NaCl溶液洗脫。洗脫的蛋白在含100mM NaCl的Tris pH8.5溶液中，以1毫克/毫升的濃度在凝膠過濾柱上發(fā)生重折疊。
有多種凝膠過濾介質適用于蛋白重折疊SuperDex200，SuperDex75，Sephacryl HR100和Sephacryl HR200。在這個體系中，TrkAIg2noHis的滯留系數為0.55。出乎意料的是，在相同條件下，TrkAIg2noHis比TrkAIg26His跑得稍快。得到的單體的數量會隨著溶解的增加而增加。洗脫的蛋白單體組分需用Poros Q柱濃縮。
用本發(fā)明提供的方法生產的TrkAIg2noHis的特性TrkAIg2noHis的分子量用PE Biosystem Voyager-DE STRMALDITOF質譜儀測定，氮激光波長為337nm。將芥子酸溶于乙腈和0.1％三氟乙酸的50∶50的混合液，濃度為1mg/100μl，制備新鮮的基質溶液。將0.5μl的樣品和基質點樣到樣品盤中。樣品與作為一個接近的外標準使用的Calmix 3(PE Biosystems)對比來進行校準。在25000V加速電壓，750ns的提取時間和2700激光強度的線性條件下，波譜范圍可達到5000-80000Da。結果如圖19所示。
測得的TrkAIg2noHis的分子量為13561.2Da。與其預測的理論分子量(13553Da)相當吻合。
用本發(fā)明提供的方法生產的TrkAIg2noHis的生物活性PC12細胞生物測定用本發(fā)明提供的方法生產的TrkAIg2noHis的生物活性用PC12細胞神經突生長生物測定方法檢測。PC12細胞用完全DMEM培養(yǎng)液(含100單位/毫升青霉素，100μg/ml鏈霉素，10％馬血清，10％胎牛血清(FCS)和2mM谷氨酸)稀釋，以每孔2×104個細胞加到膠原蛋白包被的24孔板上，加入NGF，濃度為1ng/ml，并分別加入不同濃度的TrkAIg2noHis。
經SuperDex 200柱重折疊得到TrkAIg2noHis的生物活性試驗結果如圖20所示。照片顯示48小時后神經突的生長情況。細胞需先固定。圖20A為加入1ng/ml NGF時的神經突生長；圖20B顯示未加NGF時無神經突生長；圖20C顯示當加入的2.5μm TrkAIg2noHis時，神經突生長減少；圖20D顯示加入4.5μm TrkAIg2noHis后無神經突生長。
TrkAIg2noHis用SuperDex 75，Sephacryl HR100和SephacrylHR200柱重折疊，可得到相似的結果。
因此，TrkAIg2noHis能夠抑制PC12細胞在NGF刺激下的神經突的生長。
權利要求
1.一種生產酪氨酸激酶受體相關多肽的方法，該方法包括在重組表達系統(tǒng)表達酪氨酸激酶受體相關多肽和通過分離步驟將酪氨酸激酶受體相關多肽表達產物的單體從多聚體形式中分離出來，在這個分離步驟中，酪氨酸激酶受體相關多肽表達產物經重折疊形成具有生物活性的形式。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述的酪氨酸激酶受體是天然的TrkA，TrkB或TrkC，或這些受體的生物活性同源物，變體，片段或是含有其同源物，變體或片段的結構。
3.如權利要求2所述的方法，其中所述的酪氨酸激酶受體的片段或含有這種片段的結構被表達，該片段分別選自TrkA，TrkB或TrkC受體的Ig2結構域。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述的多肽選自TrkAIg2，TrkAIg2.6，TrkBIg2和TrkCIg2。
5.如權利要求4所述的方法，其中所述的多肽是TrkAIg2或TrkAIg2.6。
6.如權利要求1，2，3，4或5所述的方法，其中所述的多肽被表達時帶有組氨酸標記序列。
7.如權利要求1到5的任一權利要求所述的方法，其中所述的多肽被表達時不帶有組氨酸標記序列。
8.如權利要求1到7的任一權利要求所述的方法，其中所述的酪氨酸激酶序列是人源的。
9.如前述任一權利要求所述的方法，其中所述的酪氨酸激酶受體相關多肽以不可溶的形式被表達。
10.如權利要求9所述的方法，其中所述的酪氨酸激酶受體相關多肽在細菌包涵體中被表達。
11.如前述任一權利要求所述的方法，其中所述的多聚體包括二聚體。
12.如前述任一權利要求所述的方法，其中所述的多肽能夠以高親和力與其相應的天然酪氨酸激酶受體的配體結合。
13.如前述任一權利要求所述的方法，其中所述的分離步驟包括凝膠過濾。
14.如前述任一權利要求所述的方法，其中所述的分離步驟采用的鹽濃度在0mM和500mM之間，包括0mM和500mM。
15.如前述任一權利要求所述的方法，其中所述的分離步驟采用的鹽濃度高于25mM低于200mM。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述的分離步驟采用的鹽濃度約為100mM。
17.如權利要求13到16的任一權利要求所述的方法，其中所述的凝膠過濾步驟使用的凝膠能夠分離分子量約為12-40KDa的分子。
18.如權利要求17所述的方法，其中所述的凝膠是Sephadex 200或SuperDex 200。
19.如權利要求18所述的方法，其中所述的凝膠是SuperDex200。
20.如前述任一權利要求所述的方法，其中所述的分離步驟采用的pH在8-9之間。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述的分離步驟采用的pH約為8.5。
22.如前述任一權利要求所述的方法，其中所述的多肽在細菌表達系統(tǒng)中生產。
23.一種純化從細菌表達系統(tǒng)的包涵體中得到的重組TrkAIg2或TrkAIg2.6的方法，其中所述的TrkAIg2或TrkAIg2.6的單體通過一個凝膠過濾步驟從TrkAIg2或TrkAIg2.6的單體和多聚體的混合物中分離出來，并重折疊成活性形式。
24.一種純化從細菌表達系統(tǒng)的包涵體中得到的重組TrkBIg2的方法，其中所述的TrkBIg2單體通過一個凝膠過濾步驟從TrkBIg2的單體和多聚體的混合物中分離出來，并重折疊成活性形式。
25.一種純化從細菌表達系統(tǒng)的包涵體中得到的重組TrkCIg2的方法，其中所述的TrkCIg2單體通過一個凝膠過濾步驟從TrkCIg2的單體和多聚體的混合物中分離出來，并重折疊成活性形式。
26.一種通過如權利要求3到23的任一權利要求所述的方法獲得的TrkAIg2制品，含有TrkAIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于20％。
27.如權利要求26所述的TrkAIg2制品，含有TrkAIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于10％。
28.如權利要求27所述的TrkAIg2制品，含有TrkAIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于1％。
29.如權利要求28所述的TrkAIg2制品，含有TrkAIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于0.1％。
30.一種通過如權利要求3到23的任一權利要求所述的方法獲得的TrkAIg2制品，含有TrkAIg2單體的量大于80％。
31.一種通過如權利要求3到23的任一權利要求所述的方法獲得的TrkAIg2制品，含有TrkAIg2的單體的量大于90％。
32.一種通過如權利要求3到23的任一權利要求所述的方法獲得的TrkAIg2制品，含有TrkAIg2的單體的量大于99％。
33.一種通過如權利要求3到23的任一權利要求所述的方法獲得的TrkAIg2制品，含有TrkAIg2的單體的量為100％。
34.一種通過如權利要求3到23的任一權利要求所述的方法獲得的TrkAIg2.6制品，含有TrkAIg2.6的二聚體或二聚體聚集物的量小于20％。
35.如權利要求34所述的TrkAIg2.6制品，含有TrkAIg2.6的二聚體或二聚體聚集物的量小于10％。
36.如權利要求35所述的TrkAIg2.6制品，含有TrkAIg2.6的二聚體或二聚體聚集物的量小于1％。
37.如權利要求36所述的TrkAIg2.6制品，含有TrkAIg2.6的二聚體或二聚體聚集物的量小于0.1％。
38.一種通過如權利要求4到23的任一權利要求所述的方法獲得的TrkAIg2.6制品，含有TrkAIg2.6單體的量大于80％。
39.一種通過如權利要求4到23的任一權利要求所述的方法獲得的TrkAIg2.6制品，含有TrkAIg2.6單體的量大于90％。
40.一種通過如權利要求4到23的任一權利要求所述的方法獲得的TrkAIg2.6制品，含有TrkAIg2.6單體的量大于99％。
41.一種通過如權利要求4到23的任一權利要求所述的方法獲得的TrkAIg2.6制品，含有TrkAIg2.6單體的量為100％。
42.一種通過如權利要求3，4，6到22，24的任一權利要求所述的方法獲得的TrkBIg2制品，含有TrkBIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于20％。
43.如權利要求42所述的TrkBIg2制品，含有TrkBIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于10％。
44.如權利要求43所述的TrkBIg2制品，含有TrkBIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于1％。
45.如權利要求44所述的TrkBIg2制品，含有TrkBIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于0.1％。
46.一種通過如權利要求3，4，6到22，24的任一權利要求所述的方法獲得的TrkBIg2制品，含有TrkBIg2單體的量大于80％。
47.一種通過如權利要求3，4，6到22，24的任一權利要求所述的方法獲得的TrkBIg2制品，含有TrkBIg2單體的量大于90％。
48.一種通過如權利要求3，4，6到22，24的任一權利要求所述的方法獲得的TrkBIg2制品，含有TrkBIg2單體的量大于99％。
49.一種通過如權利要求3，4，6到22，24的任一權利要求所述的方法獲得的TrkBIg2制品，含有TrkBIg2單體的量為100％。
50.一種通過如權利要求3，4，6到22，25的任一權利要求所述的方法獲得的TrkCIg2制品，含有TrkCIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于20％。
51.如權利要求50所述的TrkCIg2制品，含有TrkCIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于10％。
52.如權利要求51所述的TrkCIg2制品，含有TrkCIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于1％。
53.如權利要求52所述的TrkCIg2制品，含有TrkCIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于0.1％。
54.一種通過如權利要求3，4，6到22，25的任一權利要求所述的方法獲得的TrkCIg2制品，含有TrkCIg2單體的量大于80％。
55.一種通過如權利要求3，4，6到22，25的任一權利要求所述的方法獲得的TrkCIg2制品，含有TrkCIg2單體的量大于90％。
56.一種通過如權利要求3，4，6到22，25的任一權利要求所述的方法獲得的TrkCIg2制品，含有TrkCIg2單體的量大于99％。
57.一種通過如權利要求3，4，6到22，25的任一權利要求所述的方法獲得的TrkCIg2制品，含有TrkCIg2單體的量為100％。
全文摘要
本發(fā)明關于一種純化方法，尤其適用于純化酪氨酸激酶受體相關多肽，和用這一方法得到的產物。此方法包括一種生產酪氨酸激酶受體相關多肽的方法，這個生產方法包括在一個重組表達系統(tǒng)表達酪氨酸激酶受體相關多肽和一個分離步驟，在這個分離步驟中，表達的酪氨酸激酶受體相關多肽的單體從表達的多肽的多聚體形式中分離出來，并重折疊形成具有生物活性的形式。
文檔編號C12P21/02GK1564827SQ02819655
公開日2005年1月12日 申請日期2002年9月17日 優(yōu)先權日2001年9月17日
發(fā)明者戴維·達伍巴恩, 希莉簡·艾倫, 艾倫喬治西姆普松·羅伯特松 申請人:布里斯托爾大學