專利名稱：增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)合成的弱免疫原抗原的免疫原性的方法。所謂合成的弱免疫原抗原是指下列具有肽或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的化合物，這些化合物或者化學(xué)地或者借助重組DNA技術(shù)來制造，這些化合物以水溶液或作為鋁吸附物在不經(jīng)胃腸給藥之后，僅產(chǎn)生不足道的免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答具有極低的抗體效價和不足的或者低的T細(xì)胞增生。下面，為了簡便起見，將這組抗原稱為合成抗原。當(dāng)這里所描述的合成抗原以水溶液形式給藥時，按照定義，對該合成抗原的免疫應(yīng)答因此可以忽略。作為實(shí)驗(yàn)的參考配制品，使用弗洛伊德氏不全佐藥(IFA)。IFA是一種油包水(W/O)配制劑，它以已知的方式不僅刺激體液的而且刺激細(xì)胞的免疫應(yīng)答?？墒?，由于不希望的強(qiáng)副作用，IFA只允許用于試驗(yàn)?zāi)康?。疫苗這一概念被理解為下述制劑，這種制劑含有附加用作抗原的物質(zhì)，該物質(zhì)本身執(zhí)行純助劑功能或免疫增強(qiáng)功能或者這兩種功能的充分結(jié)合。純助劑例如是為了不經(jīng)胃腸給藥用于溶解抗原的水，抗菌的、等滲的和pH穩(wěn)定的助劑。免疫增強(qiáng)物質(zhì)也經(jīng)常稱為佐藥，其中涉及例如非溶性鋁鹽(磷酸鋁、氫氧化鋁)、某種脂多糖、胞壁酰肽、海藻糖化合物、各種細(xì)胞分裂素如白細(xì)胞間素1、親油的嵌段共聚物(聚羥亞烴)。但是，佐藥性能也具有實(shí)驗(yàn)的參考配制品，即不完全弗洛伊德氏佐劑，并且按其形成本身還具有各種的疫苗給藥形式，如脂質(zhì)體、乳劑、微膠囊。這些給藥形式不僅在體內(nèi)引起形成抗原貯存，而且也具有免疫刺激性能。
研制新疫苗和改進(jìn)現(xiàn)有疫苗制劑，在近年來已變得越來越重要和急迫(E.Eppstein et al.，New adjuvants for Vaccinescontaining purified protein antigens，Advances in DrugDelivery Review 4，233-253(1990))。制造合成抗原也像開發(fā)合適的佐藥制劑和給藥形式一樣，能夠提高弱免疫原化合物的免疫原性，正引起普遍重視。一方面，開發(fā)新抗原是以某些疾病作為目標(biāo)，對這些疾病例如像AIDS、瘧疾、結(jié)核病、霍亂、甲型肝炎、癌癥，還沒有有效的疫苗或者只有一些效果不能令人滿意的疫苗；另一方面，人們致力于用容易生產(chǎn)和純化并改進(jìn)特性的低分子肽和蛋白質(zhì)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的疫苗中所包含的抗原，如滅活的病毒、細(xì)菌或類毒素，這些肽和蛋白質(zhì)在其結(jié)構(gòu)中具有原來的傳染病病原體的抗原區(qū)。這樣的抗原肽和蛋白質(zhì)可以采用生物化學(xué)方法或通過重組DNA技術(shù)，以高純度來獲得。這些新一代的合成抗原在其化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有刺激抗原特異的TH(輔助物)、TC(細(xì)胞毒素的)和B淋巴細(xì)胞的肽序列(抗原決定簇)。此時這種所謂的TH-、TC-和B-細(xì)胞抗原決定簇可以各自單獨(dú)存在，或者共價地連接到一種化學(xué)的(chimeren)B-T抗原決定簇上。因?yàn)檫@些用基因技術(shù)或化學(xué)方法制造的抗原一般具有大約500-2000的低分子量，所以其免疫原性與具有50000-150000分子量的類毒素相反，或者與特殊抗體如滅活病毒和其他微生物相反，是很弱的。
迄今用于增強(qiáng)合成抗原的免疫原性的已知對策是基于，第一步通過共價結(jié)合增加這種抗原的分子量，第二步將這種較高分子量的構(gòu)建體引入免疫增強(qiáng)的制劑中。
已經(jīng)知道，將合成抗原共價地結(jié)合到高分子載體蛋白質(zhì)例如白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、牛血清白蛋白、帽貝屬血清蛋白上，能夠?qū)崿F(xiàn)提高分子量。使用昂貴和不太純的來自外來生物體的載體蛋白質(zhì)，為了抗原和載體蛋白質(zhì)的共價結(jié)合不可缺少反應(yīng)的和較有毒的病原體，以及這些化合物的純化、同一性鑒定和純度鑒定的困難性，是這些抗原載體蛋白質(zhì)構(gòu)建體的缺點(diǎn)。另一方面，有人提議通過下述方式增加B-T抗原決定簇的分子量，即這種抗原決定簇本身以某一種方式把支鏈結(jié)構(gòu)共價地向多體結(jié)合(J.P.Tam，Y.-A.Lu，Proceedingsof the National Academy of Sciences of the USA 86，9084-9088(1989))。這種構(gòu)建體被稱為多抗原肽，簡稱MAP。
此外人們還知道，為了實(shí)現(xiàn)一種抗體形成，B和TH抗原決定簇的組合是必不可少的，并且TC抗原決定簇與TH抗原決定簇的組合，在以IFA給藥后能夠改善細(xì)胞毒素的淋巴細(xì)胞應(yīng)答，也稱為CTL應(yīng)答(C.Widmann et al.，J.Immunol.Methods 155，95-99(1992))。
PS-EP-A1-513861描述了用于這種弱免疫原抗體的各種免疫增強(qiáng)制劑及其高分子構(gòu)建體。首先含有免疫刺激劑的O/W乳劑屬于此。這些粗分散或者膠質(zhì)分散體系的缺點(diǎn)是其固有的熱力學(xué)的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性本身在貯藏過程中能以聚集現(xiàn)象反映。此外，這樣的液體分散制劑的組分經(jīng)受化學(xué)變化，如氧化和水解。此外，所述的制劑大多數(shù)需要免疫刺激劑，如胞壁酰肽，這種免疫刺激劑在毒物學(xué)上是完全不令人擔(dān)心的。最后這些制劑絲毫沒有顯示長期作用。因此，為了達(dá)到能延續(xù)多年的接種預(yù)防，需要按照規(guī)定的接種計劃注射3到4次(所謂的“增強(qiáng)”注射)的疫苗制劑。
此外，國際專利WO92/19263-A1中公布了一種用于抗原免疫增強(qiáng)的體系，該體系使用所謂的可生物降解的微球體、也稱為微膠囊或微粒。這種方法的缺點(diǎn)是，免疫增強(qiáng)主要在胃腸粘膜上覺察到，因而可能僅對少數(shù)病原體(所謂的腸病原微生物)起作用。再者，這種微粒須在十二脂腸內(nèi)用藥，及不可以經(jīng)口給藥或服藥的事實(shí)，排除了實(shí)際應(yīng)用-至少在人體上的應(yīng)用-的可能性。此外，按照PS-EP-A2-333523，一種稱量過的細(xì)的(1-10μm)和粗的(20-50μm)微粒尺寸對于免疫增強(qiáng)作用似乎是一個重要的先決條件。這種對微粒的粒度范圍的要求意味著，在微粒的制造和加工時要增加額外的成本，這是其缺點(diǎn)。
本發(fā)明的任務(wù)是，借助特殊的生物聚合物將合成抗原嵌入可生物降解的微粒中，這種微粒懸浮在一種分散介質(zhì)中并不經(jīng)胃腸給藥，引起系統(tǒng)的免疫應(yīng)答增強(qiáng)。
按照本發(fā)明，這個任務(wù)是采用按照權(quán)利要求1-12所描述的方法來解決的。為此在例子1-6中描述了實(shí)施例。下面參照附

圖1-7詳細(xì)地說明本發(fā)明的方法。
圖1示意地描述按照本發(fā)明的免疫增強(qiáng)。
圖2表示在含MAP的快釋微膠囊和IFA制劑一次給藥后的抗體效價。
圖3表示在含MAP的緩釋微膠囊和IFA制劑一次給藥后的抗體效價。
圖4表示在含MAP的快釋和緩釋微膠囊的混合物和IFA制劑一次給藥后的抗體效價。
圖5表示在含MAP的快釋微膠囊和IFA制劑三次給藥后的抗體效價。
圖6表示在含不同的MAP的微膠囊和IFA制劑一次給藥后，增生的T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。
圖7表示在總是含一種合成Tc抗原和相應(yīng)的MAP的快釋微膠囊混合物一次給藥后的Tc應(yīng)答。
1.將合成抗原嵌入可生物降解的微粒中方法的出發(fā)點(diǎn)是，合成抗原按照本專利說明書開頭部分中的定義，在其已知的化學(xué)結(jié)構(gòu)中至少含有一種所定義的并且可被免疫系統(tǒng)識別的病原體微生物的抗原決定簇。此時在抗原決定簇中不僅可以涉及B細(xì)胞抗原決定簇、TH細(xì)胞抗原決定簇、TC抗原決定簇，而且可以涉及這些抗原決定簇的任何混合物。所謂的多抗原肽(MAP)，單獨(dú)或者與TC抗原決定簇組合，優(yōu)先構(gòu)成本發(fā)明方法的出發(fā)點(diǎn)?？乖瓫Q定簇的來源包括細(xì)菌、病毒、原蟲和腫瘤細(xì)胞。按照本發(fā)明將合成抗原嵌入可生物降解的微粒中。本發(fā)明的實(shí)質(zhì)是，選擇具有特殊物理和化學(xué)性能的生物聚合物，用于制造可生物降解的微粒。決定性的性能是這種生物聚合物以及由其制成的球狀微粒在水介質(zhì)和生理溶液中的潤濕性、不溶性、溶脹能力和可生物降解性。生物聚合物的溶脹能力大小及其生物降解時間決定性地決定抗原從微膠囊中的釋放動力學(xué)?，F(xiàn)已令人驚異地發(fā)現(xiàn)，這種釋放動力學(xué)也影響免疫應(yīng)答的時間進(jìn)程。具有不同的潤濕性、溶脹能力和生物降解時間的這種生物聚合物的例子是聚(乳酸)、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)、聚(羥基丁酸)、聚(羥基丁酸-戊酸共聚物)、聚(己內(nèi)酯(caprolacton))。將合成抗原嵌入生物聚合物中可采用各種已知方法來進(jìn)行，如噴霧干燥、溶劑蒸發(fā)或凝聚。在此情況下，制造成以1-200μm等級的載有抗原的球形微粒。
2.在分散介質(zhì)中懸浮在第二個步驟中，將本發(fā)明的載有抗原的微粒引入適合于將微粒不經(jīng)胃腸給藥的分散介質(zhì)中。就此而言，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)是，分散介質(zhì)是生物相容的和可生物降解的，而且還要具有對于增強(qiáng)免疫應(yīng)答有利的性能。這樣有利的分散介質(zhì)例如有卵磷脂的水溶液和油溶液，或者具有0.1-20％、尤其是2-10％濃度范圍的卵磷脂的水-油乳化液。其他合適的分散介質(zhì)是所謂的微乳化液，它由水、油、表面活性劑和輔助表面活性劑組分組成。此外，使用生物相容的和可生物降解的物質(zhì)例如天然的和合成的單酸甘油酯、甘油二酯和甘油三酯，卵磷脂、聚羥亞烴(Poloxamere)和聚山梨酸酯。所述的分散介質(zhì)的特點(diǎn)是對于可生物降解的微粒有驚人好的潤濕性能和懸浮性能。舉例來說，這種潤濕性能和懸浮性能顯著地優(yōu)于那些通常使用的分散介質(zhì)，如羧甲基纖維素或聚山梨酸酯。將微粒分散在分散介質(zhì)中可以通過簡單的搖動來實(shí)現(xiàn)，這樣就形成了可以注射的配制劑。
3.給藥將載有抗原并懸浮在分散介質(zhì)中的微粒不經(jīng)胃腸給藥，這種給藥可以一次完成，也可以以規(guī)定的時間間隔分幾次進(jìn)行。最新的給藥方式是以“增效”這一概念而為人們所知曉。1和2增效劑量例如可以在第一次注射之后1-4周和3-6個月給藥。在將本發(fā)明的制劑一次或多次給藥之后，產(chǎn)生持續(xù)數(shù)月的增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
4.增強(qiáng)免疫應(yīng)答的效果在BALB/c小鼠中，一般在一次、作為例外也可以在三次不經(jīng)胃腸投給本發(fā)明的載有合成抗原的微粒后，測定免疫應(yīng)答的增強(qiáng)。作為合成的模型抗原使用由破傷風(fēng)毒素(序列947-967)的普通TH抗原決定簇和貝格海(berghei)瘧原蟲圍孢子小體蛋白質(zhì)的重復(fù)區(qū)B細(xì)胞抗原決定簇構(gòu)造的MAP，以及貝格海瘧原蟲圍孢子小體蛋白質(zhì)(序號252-260)的TC抗原決定簇(S.Demotz et al.，J.ofImmunology，142，394-402(1989)；P.Romero et al.，Nature341，323(1989)；J.L.Weber et al.，Exp.Parasitology 63，295(1987))。按照特定的抗體效價、T淋巴細(xì)胞增生和特定的細(xì)胞毒素的T淋巴細(xì)胞活性測定免疫增強(qiáng)的強(qiáng)度和持續(xù)時間。按照已知的免疫方法測定這三個參數(shù)。
圖1示意地說明由本發(fā)明的方法達(dá)到的免疫增強(qiáng)的重要參數(shù)。在本專利說明書中，免疫增強(qiáng)指的是在時間過程中免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，根據(jù)一種給藥的合成抗原在抗體效價、T細(xì)胞增生和TC刺激等級上，與含水抗原溶液相比是增強(qiáng)的，并且與IFA制劑相比是大體相當(dāng)或有所提高。
由此產(chǎn)生了一種可能性，即通過混合具有不同潤濕性、溶脹能力和生物降解時間的生物聚合物，不僅大大增強(qiáng)體液的抗體應(yīng)答，而且大大增強(qiáng)細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，其程度可比得上甚至高于用弗洛伊德氏不全佐藥達(dá)到的增強(qiáng)。此外，按照這種方法的免疫應(yīng)答在時間上是可控制的，與IFA和水溶液相比延長大約幾周。
這里所描述的方法，根據(jù)所用的可生物降解微粒的特制的性能，使一種瞄準(zhǔn)的并在其時間變化過程中可控制的體液和細(xì)胞的免疫應(yīng)答增強(qiáng)成為可能，所述免疫應(yīng)答是針對合成抗原，尤其是針對所謂的MAP。此外，該方法還具有一個突出的優(yōu)點(diǎn)，即能夠刺激包括B和TH淋巴細(xì)胞還有細(xì)胞毒物的T淋巴細(xì)胞的瞄準(zhǔn)和增強(qiáng)的刺激，因此，尤其也能夠?qū)Σ《?、原蟲和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有效的免疫。在此令人驚異地首次能顯示這種細(xì)胞毒物的T淋巴細(xì)胞刺激。與PS-EP-A2-333523和PCT WO92/19263中描述的免疫增強(qiáng)不同，這里所述的這種免疫增強(qiáng)主要是系統(tǒng)的，即不是粘膜的，并且不僅在強(qiáng)度上而且在持續(xù)時間上或者在時間過程中能夠加以控制。此外，對于免疫增強(qiáng)，不需要狹窄的、精確定義的顆粒大小分布，這帶來工藝上的優(yōu)點(diǎn)。
這里所描述的方法在人和動物對疾病的免疫中獲得應(yīng)用，這些疾病是由細(xì)菌、病毒、原蟲和腫瘤細(xì)胞所引起的。特別是這種方法的主要用途表現(xiàn)在能夠?qū)崿F(xiàn)對病毒、原蟲和腫瘤細(xì)胞的免疫，這種免疫僅用傳統(tǒng)的疫苗不能令人滿意的，即效果不足并且要忍受不希望的副作用。利用本發(fā)明的方法刺激細(xì)胞毒物的T細(xì)胞以及持續(xù)長時間的免疫應(yīng)答形成這種應(yīng)用的基礎(chǔ)。
實(shí)施例1描述對具有標(biāo)志P30B2的支鏈多抗原肽的抗體應(yīng)答增強(qiáng)，這種多抗原肽由破傷風(fēng)毒素(序列947-967)的普通TH細(xì)胞抗原決定簇和貝格海瘧原蟲圍孢子小體蛋白質(zhì)的重復(fù)區(qū)的B細(xì)胞抗原決定簇構(gòu)成0.02g P30B2被溶解在2.00g水中，接著用一臺超聲波發(fā)生器將該溶液分散在下述溶液中，所述溶液是2.0g聚(d，l-乳酸-乙醇酸共聚物)50∶50(Resomer 502，Boehringer Ingelheim)溶解在40.0g二氯甲烷中。通過噴霧干燥由這種分散液制成球狀微粒(RG502)。接著，利用搖動將載有抗原的微粒懸浮在5％卵磷脂(0vothin 170，Lukas Meyer，D-Hamburg)的無菌溶液中。將該懸浮液皮下注射到一組8只BALB/c小鼠中(每只0.5ml)。給每只小鼠注射的抗原量是30μg。作為對照物，第二組8只BALB/c小鼠用在弗洛伊德氏不全佐藥(IFA)中的相同抗原量進(jìn)行免疫。采用ELISA測定抗體效價。
圖2表示通過RG502與IFA比較，屬于實(shí)施例1的免疫增強(qiáng)的時間曲線。用RG502和IFA達(dá)到的抗體效價在免疫后的第一個15周是對等的。此后由IFA誘發(fā)的效價下降，而由微膠囊誘發(fā)的效價至少在28周期間保持恒定。用親水的強(qiáng)溶脹的快釋和可迅速生物降解的生物聚合物，如PLGA(50∶50)，在給藥2周后，抗體效價已經(jīng)達(dá)到1－2×103，并且經(jīng)過至少28周的繼續(xù)時間里保持恒定。與此相反，IFA配制劑在一次給藥15周之后測定的效價已降低，并且在28周后僅有2×102。
實(shí)施例2描述對具有標(biāo)志P30B2(按照實(shí)施例1)的支鏈多抗原肽的抗體應(yīng)答增強(qiáng)，這種多抗體肽是由破傷風(fēng)毒素(序列947-967)的普通TH細(xì)胞抗原決定簇和貝格海瘧原蟲圍孢子小體蛋白質(zhì)的重復(fù)區(qū)的B細(xì)胞抗原決定簇構(gòu)成將0.02g P30B2溶解在2.00g水中，接著，用一臺超聲波發(fā)生器使該溶液分散在下述溶液中，所述溶液是2.0g聚(d，l-乳酸)(Resomer 206，Boehringer Ingelheim)溶解在40.0g二氯甲烷中。借助凝聚作用，通過添加硅油誘發(fā)，由這種分散液制成球狀微粒(R206)。接著，利用搖動使載有抗原的微粒懸浮在5％的卵磷脂(Ovothin 170，Lukas Meyer，D-Hamburg)無菌溶液中。將該懸浮液給一組8只BALB/c小鼠皮下注射(每只0.5ml)。每只小鼠注射的抗原量是30μg。作為對照物，用在弗洛伊德氏不全佐藥(IFA)中的相同量的抗原對第二組8只BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。采用ELISA測定抗體效價。
圖3表示通過R206與IFA比較，屬于實(shí)施例2的免疫增強(qiáng)的時間曲線。用疏水的弱溶脹能力的緩釋和可慢速生物降解的R206達(dá)到的抗體效價在最初12周里連續(xù)增加，此后達(dá)到用IFA免疫已經(jīng)2周后的水平。IFA效價在大約15周后又持續(xù)不斷地下降，而R206效價至少28周時間保持恒定。
實(shí)施例3描述對具有標(biāo)志P30B2(按照實(shí)施例1)的支鏈多抗原肽的抗體應(yīng)答增強(qiáng)，這種多抗原肽由破傷風(fēng)毒素(序列947-967)的普通TH細(xì)胞抗原決定簇和貝格海瘧原蟲圍孢子小體蛋白質(zhì)的重復(fù)區(qū)的B細(xì)胞抗原決定簇構(gòu)成與實(shí)施例1類似，P30B2摻入聚(d，l-乳酸-乙醇酸共聚物)75∶25(Resomer RG752，BoehringerIngelheim)，加工成球狀微粒(RG752)。含有相同量的P30B2的微粒RG752、RG502(來自實(shí)施例1)和R206(來自實(shí)施例2)通過搖動而懸浮在無菌的5％卵磷脂(Ovothin 170，Lukas Meyer，D-Hamburg)溶液中。將該懸浮液給一組87BALB/c小鼠皮下注射(每只0.5ml)。每只小鼠注射的抗原量是30μg。作為對照物，用在弗洛伊德氏不全佐藥(IFA)中的相同量抗原對第二組8只BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。采用ELISA測定抗體效價。
圖4表示通過將RG502、RG752和R206的混合物與IFA比較，屬于實(shí)施例3的免疫增強(qiáng)的時間曲線。用由快釋和緩釋生物聚合物組成的這種微膠囊混合物達(dá)到的抗體效價迅速增加，并且在免疫2周后已經(jīng)達(dá)到一定水平，該水平比用IFA誘發(fā)的抗體效價高2.5倍。IFA效價在大約15周后又持續(xù)不斷地下降，而用微膠囊混合物達(dá)到的效價至少28周的時間保持相對恒定。
實(shí)施例4描述對具有標(biāo)志P30B2(按照實(shí)施例1)的支鏈多抗原肽的抗體應(yīng)答增強(qiáng)，該多抗原肽由破傷風(fēng)毒素(序列947-967)的普通TH細(xì)胞抗原決定簇和貝格海瘧原蟲圍孢子小體蛋白質(zhì)的重復(fù)區(qū)的B細(xì)胞抗原決定簇構(gòu)成類似于實(shí)施例1，將P30B2摻入聚(d，l-乳酸-乙醇酸共聚物)50∶50(Resomer RG502，BoehringerIngelheim)，加工成球狀微粒(RG502)。通過搖動使載有抗原的微粒懸浮在5％卵磷脂(Ovothin 170，Lukas Meyer，D-Hamburg)的無菌溶液中。將該懸浮液給一組8只BALB/c小鼠皮下注射(每只0.5ml)。每只小鼠注射的抗原量是3×10μg。在16天(1.增效)后和113天(2.增效)后重復(fù)注射。作為對照物，用在弗洛伊德氏不全佐藥(IFA)中的相同量抗原并按照相同的接種計劃對第二組8只BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。采用ELISA測定抗體效價。
圖5表示與IFA比較，屬于實(shí)施例4的在增效注射RG502后的免疫增強(qiáng)的時間曲線。用RG502和IFA達(dá)到的抗體效價同樣地增加。因此本發(fā)明的方法也適用于通過增效達(dá)到的免疫增強(qiáng)。
實(shí)施例5描述對具有標(biāo)志P30B2(按照實(shí)施例1-4)的多抗原肽的TH淋巴細(xì)胞增生的增強(qiáng)。按類似于實(shí)施例1、2和3的方法將P30B2裝入到RG502、RG752和R206中，并加工成具有不同的溶脹能力的球狀微粒。通過搖動使含有相同量的P30B2的微粒懸浮在5％卵磷脂(Ovothin 170，Lukas Meyer，D-Hamburg)的無菌溶液中。給一組8只BALB/c小鼠皮下注射這種懸浮液(每只0.5ml)。每只小鼠注射的抗原量是30μg。作為對照物，用在弗洛伊德氏不全佐藥(IFA)中的相同量抗原對第二組8只BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。用已知方法測定淋巴結(jié)中的T細(xì)胞增生。
圖6表示將不同的微膠囊制劑及一種IFA配制劑給藥14天后，實(shí)施例5中描述的T淋巴細(xì)胞增生。由圖中可以看出，所有微膠囊制劑，即具有快速抗原釋放的RG502、具有中等延緩速度抗原釋放的RG752和具有極低速度抗原釋放的R206，以及所有三種微膠囊的混合物，與IFA配制劑相比，T淋巴細(xì)胞增生至少以一個可比得上的大小增強(qiáng)，部分地以更強(qiáng)的大小增強(qiáng)。
實(shí)施例6描述對于貝格海瘧原蟲圍孢子小體蛋白質(zhì)的TC細(xì)胞抗原決定簇(CTL359A，序列252-260)激發(fā)的細(xì)胞毒物的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)將0.008g CTL359A溶解在1.0g水中，接著，用一臺超聲波發(fā)生器使該溶液分散于4.0g聚(d，l-乳酸-乙醇酸共聚物)(Resomer 502，Boehringer Ingelheim)在60.0g二氯甲烷中形成的溶液中。采用噴霧干燥由這種分散液制成球狀微粒。將載有CTL359A的微粒和載有P30B2的微粒(按照實(shí)施例1)以CTL359AP30B2＝1∶10的比例混合，以便提高對CTL的免疫應(yīng)答。接著通過搖動使微膠囊混合物懸浮在5％卵磷脂(Ovothin 170，LukasMeyer，D-Hamburg)的無菌溶液中。給一組2只BALB/c小鼠皮下注射這種懸浮液(每只0.5ml)。每只小鼠注射的量共計4μg CTL359A和40μg P30B2。在10天和20天后采用細(xì)胞溶解試驗(yàn)測定TC細(xì)胞應(yīng)答。
圖7表示屬于實(shí)施例6的TC淋巴細(xì)胞應(yīng)答，這種應(yīng)答是在免疫后或者在制劑給藥后10天和20天測定。這種按百分率計的細(xì)胞溶解活性表現(xiàn)依賴于效應(yīng)/靶細(xì)胞比E/T。微膠囊化的TC抗原決定簇和TH抗原決定簇(P30B2＋359A在RG502中)同時給藥，令人驚異地誘發(fā)有意義的TC淋巴細(xì)胞刺激，這種刺激在給藥20天后可以觀察到。尤其引人注意的是出現(xiàn)TC應(yīng)答隨時間的變化過程，這種TC應(yīng)答與TH應(yīng)答或抗體應(yīng)答相反，需要相當(dāng)長的時間。
本發(fā)明的實(shí)質(zhì)是提出增強(qiáng)對合成抗原的免疫應(yīng)答的可生物降解的球形微粒。通過確定所使用的生物聚合物的物理化學(xué)性能，可以在其程度上和時間進(jìn)程中控制這種免疫增強(qiáng)。此外該方法能附加刺激抗體和TH淋巴細(xì)胞增強(qiáng)，也刺激細(xì)胞毒物的T淋巴細(xì)胞。免疫增強(qiáng)的程度至少與通過IFA配制劑達(dá)到的增強(qiáng)相當(dāng)，并且在其時間過程中顯著延長。同時，提供了可供在人和動物對疾病的免疫中使用的方法，所述疾病是由病毒、細(xì)菌、原蟲或腫瘤細(xì)胞引起的。
權(quán)利要求
1.增強(qiáng)人和動物對合成抗原的免疫應(yīng)答的方法，其特征在于，首先將合成抗原嵌入可生物降解的球狀微粒中，然后使這種載有合成抗原的微粒懸浮在一種分散介質(zhì)中，將這種配制劑不經(jīng)胃腸給藥，此時產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，使用一種化合物作為合成抗原，該化合物由一種至少具有B細(xì)胞抗原決定簇和至少一種TH細(xì)胞抗原決定簇的單鏈組成。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，使用一種化合物作為合成抗原，該化合物由重復(fù)共價結(jié)合的B細(xì)胞抗原決定簇和TH細(xì)胞抗原決定簇組成。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，使用一種化合物作為合成抗原，該化合物由一種細(xì)胞毒物的T細(xì)胞抗原決定簇(TC)組成。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，使用一種混合物作為合成抗原，該混合物由至少一種TH抗原決定簇和至少一種TC抗原決定簇組成。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，合成抗原包含來自原蟲或病毒或細(xì)菌或腫瘤細(xì)胞的B-和T-細(xì)胞抗原決定簇。
7.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，合成抗原包含來自原蟲或病毒或細(xì)菌或腫瘤細(xì)胞的，或者來自它們之中的任一種組合的B-和T-細(xì)胞抗原決定簇。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，球狀微粒由一種生物相容的、可生物降解的生物聚合物構(gòu)造成，其中生物聚合物來自聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)、聚己內(nèi)酯、聚(羥基丁酸)、聚(羥基丁酸-戊酸共聚物)、聚原酸酯或聚酐組成的組。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，生物聚合物來自至少兩個不同的組。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，作為分散介質(zhì)使用一種含水的或含油的卵磷脂溶液或一種含水-油的卵磷脂乳狀液。
11.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，作為分散介質(zhì)使用一種微滴乳狀液。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法在人和動物對由病毒、細(xì)菌、原蟲或腫瘤細(xì)胞引起的疾病中的免疫應(yīng)用。
全文摘要
公開了一種增強(qiáng)對合成的或遺傳工程制造的、具有弱免疫原性的抗原的免疫應(yīng)答的方法。將抗原嵌入可生物降解的微粒中，然后將載有抗原的微粒分散在可生物降解的介質(zhì)中，當(dāng)它不經(jīng)胃腸給藥時，與抗原的水溶液相比，產(chǎn)生增強(qiáng)的抗體應(yīng)答、T
文檔編號A61K39/39GK1120809SQ94191709
公開日1996年4月17日 申請日期1994年12月23日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月23日
發(fā)明者B·甘達(dá), G·科拉丁, Y·孟, C·托馬辛, H·P·默克爾 申請人:Gff工業(yè)方向促進(jìn)研究公司