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結(jié)晶金屬-α-干擾素的制作方法

文檔序號(hào):1049838閱讀:346來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:結(jié)晶金屬-α-干擾素的制作方法
背景技術(shù)
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)結(jié)晶領(lǐng)域,特別是干擾素類蛋白質(zhì)結(jié)晶作用。
人的α-干擾素是含有至少24個(gè)亞種的一族蛋白質(zhì),Zoon K.C,Interferon 91(1987),Gresser I.,ed.AcademicPress,New York。它們最初被描述為能在細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)抗病毒態(tài)的試劑,但現(xiàn)在已知它們是影響免疫系統(tǒng)很多功能的多向性淋巴因子,Opdenakker,等人,Experimentia 45513(1989)。除了它們的體外生物活性外,近來(lái)人α-干擾素被用來(lái)治療一些適應(yīng)癥,例如毛細(xì)胞性白血病,卡波濟(jì)肉瘤,尖銳濕疣,乙肝和丙肝。
α-2b干擾素是純化無(wú)菌的,凍干的重組干擾素制劑。從結(jié)構(gòu)的闡明以及各種劑型的制劑,包括開(kāi)發(fā)控制釋放制劑角度而言對(duì)高度純化結(jié)晶形式α-干擾素,特別是重組型α-2b干擾素的需求是最為重要的。
結(jié)晶人α-干擾素的兩種形式已有報(bào)道,即由Miller等人,Science,215689(1982);Kung等人,U.S.Patent No.4,672,108;Weissmann,The Cloning of Interferon andOther Mistakes,InInterferon 1981,Ian Gresser,ed.,Academic Press,New York,101~134;Weissmann,Phil.Trans.R.Soc.Lònd.B2997(1982);Nagabhushan,等人,Characterization of genetically Engineered alpha-2Interferon′,InInterferonResearch Clinical Applicationand Regulatory Consideration,Zoon等人,Elsevier,NewYork 79(1982)報(bào)道。這些出版物描述了在低溫下由聚乙二醇或通過(guò)調(diào)節(jié)pH或溫度由磷酸鹽緩沖液中結(jié)晶α-2-干擾素的方法。Miller等人的文章還指出結(jié)晶α-2干擾素是“棱柱形”的。在國(guó)際專利申請(qǐng)No.PCT/US 91/03660中公開(kāi)了在22℃由蒸汽擴(kuò)散懸滴實(shí)驗(yàn)從硫酸銨溶液中制備α-2b干擾素的單斜棱晶的條件。
一般情況下,通常在醫(yī)院或診所,α-IFN或者通過(guò)皮下或者通過(guò)靜脈內(nèi)注射給藥。當(dāng)皮下注射時(shí)α-IFN的血清半衰期是2~6小時(shí),當(dāng)靜脈內(nèi)注射時(shí)其血清半衰期是幾分鐘,并且當(dāng)隨時(shí)間測(cè)定血液水平時(shí),特征地顯示“突發(fā)出現(xiàn)”或“脈沖”分布圖形(即血清水平快速上升,接著血清水平快速清除)。因此該蛋白質(zhì)經(jīng)常性給藥的劑量一定要保持該藥的治療有效血清濃度。有臨床情況,當(dāng)讓該蛋白質(zhì)連續(xù)釋放到血液中使該蛋白質(zhì)的血清濃度達(dá)到一坪值且在一段時(shí)間內(nèi)保持該水平,可以在治療上更有利于開(kāi)發(fā)α-IFN制劑。這就是所謂的控制釋放制劑。
至今為止,已知的結(jié)晶α-IFN中沒(méi)有一種具有可控藥物傳送系統(tǒng)所需要的性質(zhì),特別是適于注射的“一般被認(rèn)為安全”(GRAS)類型制劑中的、37℃時(shí)限定的溶解度和穩(wěn)定性。可控釋放治療有許多潛在的優(yōu)點(diǎn)。主要地,可控釋放藥物能以較低有效劑量給藥,提高了其安全性同時(shí)保持或提高了其效力。因?yàn)檠娱L(zhǎng)的生物利用度為增加的生物分布、加強(qiáng)組織和有機(jī)體滲透提供了機(jī)會(huì),因此可發(fā)掘新的治療適應(yīng)癥。
因此需要一種α-IFN可控釋放制劑。本發(fā)明概要本發(fā)明提供了單斜晶形態(tài)的結(jié)晶鋅-α-2-干擾素(α-2-IFN)。本發(fā)明還提供了結(jié)晶鈷-α-2-干擾素和當(dāng)給靈長(zhǎng)類皮下注射時(shí),血清半衰期至少是大約12個(gè)小時(shí)的結(jié)晶α-2-干擾素。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種制備結(jié)晶α-2-IFN的方法,包括生成可溶性金屬-α-2-IFN配合物,在將使金屬-α-2-IFN溶液變?yōu)檫^(guò)飽和并生成結(jié)晶金屬-α-2-IFN的條件下,用一種該金屬的乙酸鹽平衡溶液中的可溶性金屬-α-2-IFN配合物。
本發(fā)明包括有單斜晶,片狀和針狀形態(tài)的結(jié)晶金屬-α-IFN。附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1描述了磷酸鹽緩沖液中α-2b干擾素的血清血液水平,曲線10,和結(jié)晶鋅-α-2b干擾素的血清血液水平,借助硫酸魚(yú)精蛋白賦形劑注射時(shí)與時(shí)間的函數(shù)關(guān)系,圖12。本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及α-干擾素的金屬配合物的新的結(jié)晶形態(tài)。特別是,公開(kāi)了鋅和鈷的結(jié)晶干擾素配合物。這些晶體具有用于藥物傳送系統(tǒng)中所需要的溶解性質(zhì),包括在37℃時(shí)限定的溶解度,顆粒范圍<200μm,以及室溫下在適于注射的溶液中的穩(wěn)定性。用34×106IU結(jié)晶鋅-α-2b-IFN懸浮液進(jìn)行單次皮下注射,與α-2b-IFN非結(jié)晶形INTRON A(Schering-Plough,Kenilworth New Jersey)的血清半衰期2~3小時(shí)相比,其測(cè)定的消除血清半衰期是12個(gè)小時(shí),血清半衰期增長(zhǎng)了4~6倍。
可以用幾種方法,例如如蒸汽擴(kuò)散,液體擴(kuò)散,恒溫和溫度誘導(dǎo)或其組合方法使金屬-干擾素配合物的過(guò)飽和溶液誘發(fā)結(jié)晶。只在蛋白質(zhì)濃度,緩沖液濃度,金屬離子濃度和溫度的窄范圍條件下發(fā)生結(jié)晶作用。可通過(guò)在4°至22℃恒溫下的蒸汽擴(kuò)散(懸滴方法),液體擴(kuò)散(透析和超濾)或通過(guò)溫度誘導(dǎo)方法(溫度隨時(shí)間由4℃升至22℃)得到這些設(shè)計(jì)的過(guò)飽和條件。優(yōu)選地用來(lái)與α-2b干擾素配合的金屬鹽是鈷鹽或鋅鹽,且通過(guò)恒溫或溫度誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)平衡。
金屬-α-IFN配合物的溶液含有一種金屬的乙酸鹽。該金屬的乙酸鹽優(yōu)選選自鋅、鎘、鉀、鋰、鎂和鈷鹽,更優(yōu)選的是乙酸鋅。并且通過(guò)恒溫的方法或者通過(guò)溫度誘導(dǎo)方法使溶液誘發(fā)結(jié)晶。在蒸汽擴(kuò)散和液體擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)中,溶液最好與更濃的乙酸鋅或乙酸鈷溶液平衡。平衡是指較低鹽濃度溶液的溶劑滲透性地?cái)U(kuò)散到有較高鹽濃度的另一溶液的溶液中,以使得兩溶液中鹽濃度達(dá)到平衡的過(guò)程。結(jié)晶開(kāi)始形成時(shí),存在于結(jié)晶α-2-IFN溶液中的乙酸鹽的濃度優(yōu)選為大約60mM至大約140mM,更優(yōu)選乙酸鹽濃度是大約80mM至大約100mM。如下文所述,蒸汽擴(kuò)散或液體擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)時(shí),平衡過(guò)程起始時(shí)乙酸鹽的濃度較低,即為大約20mM至大約70mM。
優(yōu)選α-2-IFN是α-2b-干擾素,更優(yōu)選的是人重組α-2b-干擾素。在一實(shí)施方案中,所用材料是具有序列ID NO1所示氨基酸序列的α-2b-干擾素。
也可以使用α-2a-IFN。α-2a干擾素的初級(jí)氨基酸序列與上述α-2b-IFN序列不同,在23位殘基上用賴氨酸取代了精氨酸。
α-2-干擾素的乙酸鹽溶液優(yōu)選包括pH5.0至7.0,更優(yōu)選pH5.5至6.5的緩沖液,如35mM乙酸鈉,pH6.0的緩沖溶液。
如上所述,本發(fā)明方法包括在所設(shè)計(jì)的產(chǎn)生過(guò)飽和結(jié)晶的條件下,制備金屬-α-2-IFN可溶的配合物。用幾種結(jié)晶方法,如恒溫下蒸汽擴(kuò)散,液體擴(kuò)散和溫度誘導(dǎo)或這些方法的組合能達(dá)到過(guò)飽和條件。在蒸汽擴(kuò)散方法中,鋅-α-2-IFN配合物與將使鋅α-2-IFN溶液變?yōu)檫^(guò)飽和的并在恒溫下生成α-2-干擾素晶體的乙酸鹽溶液平衡。在液體擴(kuò)散方法中,在恒溫下,乙酸鋅緩沖液中的鋅-α-2-IFN配合物對(duì)較高濃度乙酸鋅緩沖液透析。在溫度誘導(dǎo)方法中,通過(guò)使溫度由4℃升至22℃,使金屬乙酸鹽緩沖液中的金屬-α-IFN溶液產(chǎn)生結(jié)晶。
可以使用任何合適的α-2-IFN,例如α-2a-IFN和α-2b-IFN,更優(yōu)選入重組α-2b-IFN(γ-h-α-2a-IFN)或α-2b-IFN(Y-h-α-2b-IFN)。商業(yè)上可獲得的α-2-IFN制品可由Hoffmann-LaRoche(ROFERON)和Schering-Plough(INTRON A)買(mǎi)到。含有α-2-IFN的純干擾素類的混合物可由Burroughs-Wellcome Corporation(WELLFERONS)購(gòu)得。由于人α-IFN高度序列同源性,本發(fā)明方法適用于每一亞種。
可以通過(guò)重組DNA技術(shù)或可以從自然源(例如人外周血液淋巴細(xì)胞,人成淋巴細(xì)胞瘤疹(lymphoblastoid)細(xì)胞系)提純得到人α-2-IFN亞種,例如,如在Pestka,等人,Ann.Rev.Biochem.,56727(1987)中所描述的。優(yōu)選的α-2-IFN是具有SEQ IDNOl氨基酸序列的γ-h-α-2b-IFN。
已經(jīng)從幾種細(xì)胞源純化得到了天然人α-IFN,包括由全血,新生期纖維細(xì)胞,成淋巴細(xì)胞瘤疹和各種白血病細(xì)胞系分離出的白細(xì)胞。人白細(xì)胞干擾素的第一種臨床上可獲得的制劑是由芬蘭的K.Cantell及其同仁研究出的,是將取自正常志愿者的血液離心,用干擾素與抗原接觸,通過(guò)加入仙臺(tái)(Sendai)病毒,誘導(dǎo)產(chǎn)生α-IFN,并且離心。用硫氰酸鉀沉淀所得的上清液,用乙醇萃取,pH沉淀,對(duì)磷酸鹽緩沖鹽水透析,來(lái)得到純化的α-IFN,K.E.Morgensen,等人,Pharmacol,Ther.1369(1977)。
重組α-INF已被幾組大腸桿菌(E.Coli)克隆和表達(dá),例如,C.Weissmann等人,Science 2091343(1980)。重組α-IFN的純化已由幾組使用色譜步驟如硫酸銨沉淀,染色親和色譜,離子交換和凝膠過(guò)濾的結(jié)合描述過(guò),例如,象Weissmann,C,Phil R.Soc.(London),b2997(1982)中所描述的。一種可選擇的純化重組α-IFN的方法使用了固定化抗體的免疫親和層析,P.P.Trotta等人,Developments in Industrial Microbiology 7253(Elsevier Amsterdam 1987)。用于重組α-干擾素的可得的純化方案的綜述見(jiàn)T.L.Nagabhushan and P.P.Trotta,Ulmann′sEncyclopedia of Industrial Chemistry A14,VCH372(Weinheim,F(xiàn)ederal Republic of Germany 1989)。優(yōu)選以常規(guī)純化方法純化所用的α-2b-IFN,如Ullmann′s Encyclopediaof Industrial Chemistry中描述的方法,然后再進(jìn)行反相高效液相色譜。
結(jié)晶α-IFN蒸汽擴(kuò)散的合適的方法包括使用滴液法,例如懸滴或夾滴??梢詫?shí)現(xiàn)金屬-α-2-IFN乙酸鹽溶液與具有比第一種溶液高的乙酸鹽濃度的另一乙酸鹽溶液之間的蒸汽平衡。優(yōu)選平衡作用緩慢發(fā)生,例如歷經(jīng)1小時(shí)至30天。
用類似蒸汽擴(kuò)散來(lái)達(dá)到過(guò)飽和的其它方法,即液體擴(kuò)散,例如透析和超濾,可以實(shí)現(xiàn)大量結(jié)晶。也可以用溫度誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)結(jié)晶,即隨著溫度的提高,金屬-干擾素的非結(jié)晶懸浮液或溶液過(guò)飽和,然后晶核形成且結(jié)晶生成。在臨床制備時(shí),大量的結(jié)晶可用作為純化或濃縮步驟。
在結(jié)晶點(diǎn),即第一顆晶粒生成時(shí)的點(diǎn),乙酸鹽溶液中α-2-IFN的終濃度可以在大約5至大約80mg/ml的范圍。更優(yōu)選,α-2-IFN的濃度是約5至大約50mg/ml。優(yōu)選α-2-IFN的初始濃度是大約40mg/ml。
在蒸汽擴(kuò)散方法中,在結(jié)晶作用發(fā)生前的初始階段,α-2-IFN溶液中金屬乙酸鹽的濃度可以是大約10至大約70mM的范圍。更優(yōu)選,α-2-IFN溶液中金屬乙酸鹽的濃度為大約20至大約45mM。在抗衡溶液中,結(jié)晶作用起始時(shí),乙酸鹽的濃度是大約60至大約140mM,更優(yōu)選為大約80至大約100mM。
α-2-IFN溶液和抗衡乙酸鹽溶液的pH優(yōu)選控制在大約4.0至大約7.0的范圍內(nèi),更優(yōu)選大約5.5至大約6.5。任何合適的非金屬螯合緩沖劑都能用于此目的。例如可以使用乙酸鈉,HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸)和MES(2-[N-嗎啉代]乙磺酸)緩沖液。
優(yōu)選在對(duì)蒸汽擴(kuò)散和液體擴(kuò)散法控制溫度梯度下進(jìn)行結(jié)晶。采用蒸汽擴(kuò)散法時(shí),優(yōu)選溫度范圍為約7℃至約22℃,更為優(yōu)選的范圍為約6℃至約14℃,在約9℃時(shí)通??捎^察到晶核形成。
對(duì)于溫度誘導(dǎo)法,優(yōu)選在瞬時(shí)至幾天的時(shí)間范圍內(nèi)將溫度從1℃升至40℃。優(yōu)選在1至10天間溫度以線性梯度形式由4℃升至22℃。更為優(yōu)選的方案是在1至10天間從4℃升至18℃。
以本發(fā)明方法制備的結(jié)晶α-2-IFN是配制各種藥物制劑的基礎(chǔ)。例如,結(jié)晶的α-IFN可用于控制釋放制劑中,即一種適于皮下,肌內(nèi)或病灶內(nèi)(intralesional)注射的貯庫(kù)制劑(depotpreparation),它可釋放出相當(dāng)于0.1-1.0μg/kg體重的日劑量。使用本發(fā)明方法制備的晶體的貯庫(kù)制劑同包含低于4℃條件下制得的現(xiàn)有技術(shù)的結(jié)晶的制劑相比,顯示出的溶解速率要低得多。尤其是本發(fā)明周圍溫度(22℃)的晶體比要求低溫條件形成結(jié)晶的晶體對(duì)溫度的敏感性低。制劑可含生理有效量的結(jié)晶α-2-干擾素和慣用的藥物可接受載體。也可以設(shè)想將結(jié)晶蛋白的控制釋放效果與其他控制釋放技術(shù)如微膠囊化結(jié)合使用。例如,結(jié)晶蛋白可包埋于Poly[dl-lactic-coglycolic]acid或脂質(zhì)體中。
實(shí)施例下列實(shí)施例用于解釋本發(fā)明,但并不限制本發(fā)明范圍。
下列實(shí)施例所用的α-2-IFN是在E.Coli中表達(dá)的重組人α-2b-干擾素,描述于Weissmann等,Science,2091342(1980)中。按先前在Leibowitz,P.等人在美國(guó)專利US 4,315,852中報(bào)道的方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),收集和提取。結(jié)合使用傳統(tǒng)的純化步驟來(lái)純化得到的提取液乙醇提取,基質(zhì)凝膠藍(lán)配體親合層析,離子交換和凝膠過(guò)濾層析。所得純化的α-2b-IFN制備液以USP級(jí)水或以0.1%三氟乙酸溶液透析,并分別凍干成游離堿或三氟乙酸鹽。
實(shí)施例1單斜晶形態(tài)的結(jié)晶鋅-α-2b-IFN的制備使用Kenyon等在1992年1月17日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)No.07/822,504,1992年10月6日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)No.PCT/US 92/08296中公開(kāi)的自動(dòng)結(jié)晶系統(tǒng),6μl含20mg/ml的α-2b-IFN的17mM乙酸鈉,17mM乙酸鋅(pH為5.5)的液滴懸浮于一硅化結(jié)晶室中的上蓋。此上端平板置于結(jié)晶室的涂有潤(rùn)滑脂的下部結(jié)構(gòu)上,結(jié)晶室位于一小槽的正上方,槽中有1ml 35mM乙酸鈉,35mM乙酸鋅、pH為5.5的溶液。22℃下保溫5-6天后可明顯觀察到大單斜晶體。
實(shí)施例2單斜晶形態(tài)結(jié)晶的鋅-α-2b-IFN的制備單斜晶形結(jié)晶鋅-α-2b-IFN可用另一種方法制備。在該方法中,鋅-α-2b-IFN結(jié)晶條件為,含20mg/ml α-2b-IFN的2.5mM乙酸鈉,37.5mM乙酸鋅,pH6.1的10μl液滴懸浮于一18mm的圓形硅化蓋玻片上。含有1ml 5mM乙酸鈉,75mM乙酸鋅,pH6.1的溶液的結(jié)晶室,圍繞其邊緣涂一圈高真空潤(rùn)滑脂,并用硅化蓋玻片封口,這樣懸滴便懸掛于結(jié)晶室上部,懸掛于乙酸鹽溶液上部。12℃保溫后5-6天即產(chǎn)生大的單斜晶。
實(shí)施例3單斜晶形結(jié)晶的鋅-α-2b-IFN的制備用另一種方法生產(chǎn)單斜晶形鋅-α-2b-IFN。在該方法中,含20mg/mlα-2b-IFN的45mM乙酸鋅,pH6.1的10μl液滴懸浮于硅化蓋玻片上。結(jié)晶室含有1ml 90mM乙酸鋅,pH6.1,并用高真空潤(rùn)滑脂將該懸有液滴的蓋玻片封口,液滴懸掛于結(jié)晶室和乙酸鋅溶液上方。12℃保溫后5-6天內(nèi)即產(chǎn)生大單斜晶。
實(shí)施例4單斜晶α-2b-IFN的X射線衍射數(shù)據(jù)將根據(jù)實(shí)施例1制備的α-2b-IFN單斜晶置于毛細(xì)玻璃管中,22℃時(shí)使用40KV和100mA操作的由Rigaku RU-300旋轉(zhuǎn)陽(yáng)極發(fā)生器產(chǎn)生的CuKα射線進(jìn)行X-射線分析。用同樣的輻射源在NicoletX-100A表面積探測(cè)器上收集原始數(shù)據(jù)。
晶體對(duì)于X-射線衍射分析穩(wěn)定,衍射分辨率為約2.7×10-10m(),但在分辨率為大約3.2×10-10m()時(shí),數(shù)據(jù)變得非常弱。不同批的晶體均做X-衍射分析得出晶體形態(tài)的分析結(jié)果一致。用晶胞參數(shù)值標(biāo)明晶體空間群P21,這些參數(shù)為a=63.1×10-10m(),b=76.6×10-10m(),c=151.4×10-10m(),α=90°,β=91.2°及γ=9 0°。此為單斜晶形的金屬α干擾素的首次報(bào)道。
實(shí)施例5液體擴(kuò)散結(jié)晶法(片晶)為使結(jié)晶懸浮液具有控制釋放施用的應(yīng)用性,必須可能生產(chǎn)出毫克級(jí)至克級(jí)的晶體。上述懸滴法的蒸發(fā)擴(kuò)散法不能提供這樣量級(jí)的結(jié)晶蛋白。因此,使用液體透析法進(jìn)行α-2-IFN結(jié)晶,這是模仿懸滴法的蒸發(fā)擴(kuò)散法建立的實(shí)驗(yàn)。使用一切割分子量為5000KD的微透析袋(Pope Scientific Inc.,Menomonee Falls,Wisconsin)將0.5ml的α-2b-IFN(40mg/ml),35mM乙酸鈉pH5.5的溶液在2.7升35mM乙酸鈉pH5.5的溶液中進(jìn)行透析,溫度為22℃。在22℃在兩天的期間內(nèi),滴加緩沖至pH5.5的乙酸鋅溶液(0.3M)。滴加的目的是緩慢提高α-2b-IFN溶液中乙酸鋅的水平至35mM。乙酸鋅溶液加入1-2小時(shí)后可觀察到懸浮液中出現(xiàn)沉淀。每天用顯微鏡觀測(cè)懸浮液。2周后可發(fā)現(xiàn)懸浮液中出現(xiàn)少量片狀物。每天懸浮液中的晶片數(shù)目都會(huì)增多(平均大小70μm)直至3周后懸浮液中含晶體量約為90%。
實(shí)施例6液體-擴(kuò)散結(jié)晶法(片晶)用一切割分子量為5000KD的微透析袋(Pope Scientific Inc.,Menomonee Falls,Wisconsin)將0.5ml在35mM乙酸鈉pH5.5溶液中的α-2b-IFN的濃度為40mg/ml的α-2b-IFN溶液在2.7升由35mM乙酸鈉和35mM乙酸鋅組成的,pH5.5的緩沖液中進(jìn)行透析。所得懸浮液在22℃保溫3周。通過(guò)顯微鏡觀察3-4周時(shí)可見(jiàn)到大量片狀晶體。
實(shí)施例7溫度誘導(dǎo)結(jié)晶法(片晶)用1M NaOH在4℃時(shí)將0.5ml在35mM乙酸鈉,pH5.0溶液中α-2b-IFN的濃度為40mg/ml的α-2b-IFN溶液調(diào)至pH6.0。所得懸浮液浸放于冷卻水浴/循環(huán)器(#RTE-110型,NeslabInstruments,Inc.,Newington,N.H.)中。水浴溫度以一線性梯度形式在4天內(nèi)升至22℃。用顯微鏡觀察4天后可見(jiàn)到大量的片形晶體。
實(shí)施例8結(jié)合使用蒸汽擴(kuò)散和溫度誘導(dǎo)法制備結(jié)晶的鋅-α-2b-IFN結(jié)合使用蒸汽擴(kuò)散和溫度誘導(dǎo)法生產(chǎn)單斜棱晶形的結(jié)晶鋅-α-2b-IFN。在該方法中,4℃時(shí)含有20mg/mlα-2b-IFN的40mM乙酸鋅,pH6.0溶液的10μl液滴被懸浮于一硅化蓋玻片上。結(jié)晶室內(nèi)含1ml 80mM乙酸鋅,pH6.0的溶液。在懸有小滴的蓋玻片處用高真空潤(rùn)滑脂密封,小滴懸于結(jié)晶室上方。將整個(gè)結(jié)晶室放置于一溫度為12℃的保溫箱中。12℃保溫后3-5天內(nèi)即有大的單斜晶產(chǎn)生。
實(shí)施例9-14性質(zhì)用物理生物化學(xué)的手段開(kāi)始測(cè)定鋅α-2b-IFN晶體的性質(zhì),以確定溶解后分子的完整性,蛋白鋅含量和保存的生物活性。
實(shí)施例9蛋白質(zhì)分析一等量樣份的由實(shí)施例3的方法制備的鋅-α-2b-IFN晶體被置于2升35mM乙酸鋅pH5.5的溶液中22℃時(shí)透析4天以移去未形成配合物的乙酸鋅。離心該懸浮液并用Pasteur移液管移去洗滌溶液。洗滌過(guò)的晶體重新溶于22℃8M鹽酸胍溶液中,用純凈的人α-2b-IFN作為參比標(biāo)準(zhǔn),采用改進(jìn)的Bradford分析法確定蛋白質(zhì)濃度。Bradford分析改進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)合分析以使吸光度直接與蛋白含量成正比。詳細(xì)情況見(jiàn)Bradford,M.,Anal.Biochem.72248(1976)。
實(shí)施例10HPLC對(duì)等量樣份的根據(jù)實(shí)施例3的方法制備的重新溶解的α-2b-IFN晶體進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)(Waters Ass.,Milford,MA)分析。樣品加于RAININ DYNAMAXC4300×10-10m()柱子(4.6×250mm)中,然后用27-72%乙腈的0.1%的三氟乙酸溶液在30分鐘時(shí)間內(nèi)進(jìn)行線性梯度洗脫,用Gilson可變波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)器在280nm處以靈敏性0.02個(gè)吸收光度來(lái)監(jiān)測(cè)洗脫。重新溶解的結(jié)晶溶液和結(jié)晶前原始α-2b-IFN制備液的保留時(shí)間和色譜圖形難以區(qū)分。
實(shí)施例11SDS-PAGE分析收集根據(jù)實(shí)施例1的蒸汽擴(kuò)散懸滴實(shí)驗(yàn)得到的晶體,將其離心并洗滌數(shù)次以移去任何可溶性α-IFN。被離心分離的晶體溶解于含十二烷基硫酸鈉的緩沖液中,所得溶液進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),Laemmli,U.K.Nature,227680(1970)。與樣品α-2b-IFN對(duì)比。溶解的晶體與對(duì)比樣品α-2b-IFN在分子量上沒(méi)有明顯變化?;谶@些結(jié)果可知在結(jié)晶過(guò)程或此后的溶解狀態(tài)中α-2b-IFN沒(méi)有化學(xué)或酶學(xué)性質(zhì)上的改變。
從上述實(shí)施例10和11的結(jié)果,可以得出結(jié)論在結(jié)晶或重新制備過(guò)程中蛋白質(zhì)不會(huì)產(chǎn)生化學(xué)變化或任何變性。
實(shí)施例12鋅-α-2b-IFN的物理性質(zhì)通過(guò)顯微鏡觀察由實(shí)施例1制備的晶體在37℃(體溫)和4℃時(shí)的穩(wěn)定性,以探測(cè)其是否適合用于控制釋放制劑中。還觀察晶體在不同pH值的無(wú)鋅緩沖液中18小時(shí)間的穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)晶體在37℃和4℃時(shí)穩(wěn)定存在24小時(shí),且在pH5.0-6.0時(shí)穩(wěn)定。這點(diǎn)明顯區(qū)別于初始的結(jié)晶α-2b-IFN制備液,尤其不同于Nagabhushan,等“Characterization of genetically Engineered alpha-2Interferon,在InterferonResearch,Clinical Applicationand Regulatory”中公開(kāi)的晶體,其在pH高于或低于6.0及4℃時(shí)在pH6.0時(shí)很快溶解。
實(shí)施例13配合的鋅與干擾素含量的摩爾比設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以確定配合的鋅與α-2b-IFN的摩爾比。等量樣份的根據(jù)實(shí)施例3制備的鋅-α-2b-IFN晶體溶液被置于2升35mM乙酸鈉,pH5.5的溶液中透析4天,移去未形成配合物的乙酸鋅。向洗過(guò)的懸浮液中加入8.0M的鹽酸胍溶液以溶解配合物。所得溶液以Bradford法分析蛋白含量。一份相同懸浮液樣品用于原子吸收光譜分析Z n含量、發(fā)現(xiàn)鋅離子與α-2b-IFN的摩爾比為3.1比1。隨后制備的鋅-α-2b-IFN樣品分析結(jié)果為鋅離子與α-2b-IFN的摩爾比為2至4。
實(shí)施例14細(xì)胞病變效應(yīng)抑制分析為確定結(jié)晶的α-2b-IFN是否仍保持其生物活性,進(jìn)行了細(xì)胞病變效應(yīng)抑制分析。所用病毒為腦心肌炎病毒(EMC),ATCC株VR-129B,該病毒生長(zhǎng)于Vero細(xì)胞的單層培養(yǎng)物中并在培養(yǎng)基A中凍干保存(培養(yǎng)基A含950ml帶Earle平衡鹽溶液的Minimum EssentialMedium Eagle(Gibco Inc.),100ml胎牛血清,36ml 7.5%碳酸氫鈉,20ml 1M HEPES緩沖鹽水,20ml 200mM的L-谷氨酰胺和10ml青霉素和鏈霉素(10000單位青霉素K/ml和10000μg硫酸鏈霉素/ml)。組織培養(yǎng)搖瓶中匯合在一起的FS-71細(xì)胞單層培養(yǎng)物以Hank平衡鹽溶液洗滌,并用2.5%的胰蛋白酶溶液在37℃保溫10分鐘。含有細(xì)胞的胰蛋白酶溶液以培養(yǎng)基A稀釋,使細(xì)胞濃度為3.5×105,用于下述分析方法中。
干擾素分析抗病毒生物分析的全部過(guò)程在一96孔微量滴定板上進(jìn)行。被測(cè)樣放于適當(dāng)?shù)目字胁⒁?∶2比例在整個(gè)板上進(jìn)行系列稀釋。每板24孔裝有培養(yǎng)基A作為病毒和細(xì)胞對(duì)照孔。此外,作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的600IU/mlα-2b-干擾素的溶液被稀釋至1IU/ml,此為對(duì)病毒細(xì)胞病變具有50%防護(hù)水平必需的濃度值,所有分析中都包括此標(biāo)準(zhǔn)樣,以便在分析中測(cè)定并比較樣品相對(duì)的抗病毒活性。然后,每一小孔中接種含約3.5×104細(xì)胞的0.1ml的培養(yǎng)基A。微量滴定板加蓋并在37℃,5%CO2中保溫4小時(shí)。除了細(xì)胞對(duì)照孔外所有的孔都感染有EMC病毒,病毒濃度為感染后16-18小時(shí)可導(dǎo)致90-100%的細(xì)胞病變,即約有1.54×104個(gè)斑形成單元。重新將該微量滴定板加蓋并于37℃,5%CO2條件下保溫,直至病毒對(duì)照孔顯示出至少90%的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。將培養(yǎng)基從每孔中吸出并將細(xì)胞單層培養(yǎng)物以0.1ml結(jié)晶紫液制劑染色約30分鐘。倒出結(jié)晶紫后,將微量滴定板輕輕用水洗滌并在空氣中涼干。使用和不使用顯微鏡觀察單層培養(yǎng)物,將病毒和細(xì)胞對(duì)照孔打分為1至4+(1=<10%CPE,4+=>90%CPE)。試驗(yàn)板上每一顯示出與對(duì)照孔相應(yīng)反應(yīng)的樣品被打分分級(jí)。每一樣品孔的級(jí)值由觀測(cè)結(jié)果和與標(biāo)準(zhǔn)孔對(duì)比結(jié)果組成。樣品的50%終點(diǎn)值是通過(guò)直接與標(biāo)準(zhǔn)樣50%終點(diǎn)對(duì)比而得,該標(biāo)準(zhǔn)樣與所選的樣品孔是最匹配的。樣品50%終點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)樣的50%終點(diǎn)相比的偏差得出相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的滴度值的估計(jì)值。由此,X孔偏差[X=(50%樣品孔號(hào))-(50%標(biāo)準(zhǔn)孔號(hào))]轉(zhuǎn)換的效力為2x倍的標(biāo)準(zhǔn)樣效力。
有關(guān)分析實(shí)驗(yàn)的調(diào)節(jié)描述于S.Rubinstein,P.C.Familettiand S.Petska,J.Virol,37755(1981)。
實(shí)施例15Zn-α-2b-干擾素在魚(yú)精蛋白賦形劑中的控制釋放能力設(shè)計(jì)出體內(nèi)實(shí)驗(yàn),以檢測(cè)結(jié)晶的懸浮液在適于皮下注射的GRAS制劑中的控制釋放能力。使用根據(jù)實(shí)施例7方法制備的α-2b-IFN,在10mM酸鈉、10mM乙酸鋅、0.4mM硫酸魚(yú)精蛋白,pH5.5的緩沖液中制備無(wú)菌鋅-α-2b-IFN結(jié)晶懸浮液(34×106IU/dose)。在兩只Cynomolgus猴子的腰背部皮下注射該懸浮液。用細(xì)胞病變效應(yīng)抑制分析(CPE),以在1、3、6、10、24、48和72小時(shí)監(jiān)測(cè)干擾素的血液血清水平作為對(duì)時(shí)間的函數(shù)作圖。
見(jiàn)圖1曲線12,其顯示了兩只猴子的α-IFN平均血清水平,由CPE分析值對(duì)時(shí)間的函數(shù)來(lái)測(cè)定。
實(shí)施例16對(duì)比實(shí)驗(yàn)實(shí)施例15得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同于使用在普通含鹽的磷酸鹽緩沖液中制備的非結(jié)晶α-2b-IFN進(jìn)行的此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在Cynomolgus猴的腰背部以50×106IU/針的劑量進(jìn)行皮下注射。在0、1、3、6、10、24、48和72小時(shí)測(cè)量血液血清中的干擾素水平。將數(shù)據(jù)做圖見(jiàn)圖1的曲線10,其通過(guò)以CPE分析值作為對(duì)時(shí)間的函數(shù)測(cè)定顯示出α-IFN的血清水平。
由實(shí)施例15和16可以得出結(jié)論,即在魚(yú)精蛋白載體中使用結(jié)晶的鋅-α-IFN,相對(duì)于實(shí)施例16所描述的現(xiàn)有技術(shù)的α-IFN制劑延長(zhǎng)了α-IFN在血液血清中可測(cè)水平。并且,這些數(shù)據(jù)表明Zn干擾素結(jié)晶懸浮液用作控制釋放制劑的實(shí)用性。該結(jié)晶配合物能通過(guò)液體透析法或溫度誘導(dǎo)法進(jìn)行大量生產(chǎn)。此大規(guī)模的工藝過(guò)程可生產(chǎn)出注射產(chǎn)品所需的1-200μm大小的結(jié)晶(可與結(jié)核菌素一同注射)。
表1猴體中結(jié)晶IFN懸浮液與非結(jié)晶IFN的藥物動(dòng)力學(xué)曲線圖1 圖1曲線10 曲線12Cmax 80001500Tmax3 3AUC(tf) 20225 16812tf 6 24Cmax IU/ml 最大血漿濃度Tmax hr.最大血漿濃度對(duì)應(yīng)的時(shí)間AUC(tf) IU.hr/ml 從時(shí)間0至最終可測(cè)樣品時(shí)間血漿濃度-時(shí)間曲線下的面積tf hr.最終可測(cè)樣品的時(shí)間表2相對(duì)于時(shí)間的血清水平(CPE)圖1圖1時(shí)間(小時(shí)) 曲線10 曲線12(平均值)0 0 01 0 6763800015006 150 90010 0 11424 0 048 0 072 0 0實(shí)施例17鈷-α-2b-IFN配合物結(jié)晶使用Kenyon等人在1992年1月17日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)No.07/822,504,1992年10月6日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)No.PCT/US 92/08296中所公開(kāi)的自動(dòng)結(jié)晶系統(tǒng),將含有20mg/ml的α-2b-干擾素的17mM乙酸鈉、22mM乙酸鈷,pH4.6溶液的6μl的液滴懸浮于硅化結(jié)晶室的上蓋上。此上蓋放置于結(jié)晶室的涂有潤(rùn)滑脂的下部結(jié)構(gòu)上,結(jié)晶室位于一含有1ml 35mM乙酸鈉、45mM乙酸鈷,pH4.6的小槽的正上方。22℃保溫后5-6天即可用顯微鏡觀察到晶體出現(xiàn)。
實(shí)施例18在結(jié)晶緩沖液中使用乙酸鋰制備結(jié)晶的鋅-α-2b-IFN將含有20mg/ml的α-2b-IFN的37.5mM乙酸鋅,pH6.1,2.5mM乙酸鋰溶液的10μl液滴懸浮于硅化蓋玻片下面。結(jié)晶室內(nèi)含有1ml 75mM乙酸鋅,pH6.1,5.0mM乙酸鋰,并以高真空潤(rùn)滑脂在蓋玻片處密封。12℃保溫后5~6天即出現(xiàn)單斜晶形晶體。
實(shí)施例19在結(jié)晶緩沖液中使用乙酸鉀制備結(jié)晶的鋅-α-2b-IFN將含有20mg/ml的α-2b-IFN的37.5mM乙酸鋅,pH6.1,2.5mM乙酸鉀溶液的10μl液滴懸浮于硅化蓋玻片下側(cè)。結(jié)晶室含有1ml 75mM的乙酸鋅,pH6.1,5.0mM的乙酸鉀,并以高真空潤(rùn)滑脂在蓋玻片處密封。12℃保溫后5~6天即可發(fā)現(xiàn)大的單斜晶形晶體。
盡管結(jié)合上述特定的實(shí)施方案,對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述,但許多針對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的替換、修改和變換對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。所有這樣的替換、修改和變換均屬本發(fā)明的思想和范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人Schering Corp.(ii)發(fā)明名稱結(jié)晶金屬-α-干擾素(iii)序列數(shù)1(iv)通信地址(A)地址Schering-Plough Corporation(B)街道One Giralda Farms(C)城市Madison(D)州New Jersey(E)國(guó)家USA(F)郵政編碼07940(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)Apple Macintosh(C)操作系統(tǒng)Macintosh 6.0.8(D)軟件Microsoft Word 5.1a(vi)現(xiàn)申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)柎o(B)申請(qǐng)日即日(C)分類(vii)優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?8/08/024,330(B)申請(qǐng)日1993.2.25(viii)代理機(jī)構(gòu)/代理人信息(A)姓名Lunn,Paul G.(B)登記號(hào)32,743(C)參考/檔案號(hào)JB0287K(ix)電信信息(A)電話201 822 7255(B)電報(bào)201 822 7039(C)電傳219165(2)序列ID NO1信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度165氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列ID NO1的序列描述Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met5 10 15Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Iie Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe50 55 60Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser145 150 155 160Leu Arg Ser Lys Glu16權(quán)利要求
1.單斜晶形態(tài)的結(jié)晶鋅-α-2-IFN。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)晶鋅-α-2-IFN,其中結(jié)晶鋅-α-2-IFN經(jīng)X-射線衍射分析,分辨率為大約3.0×10-10m()。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的結(jié)晶鋅-α-2-IFN,其中鋅-α-2-IFN是鋅-α-2b-IFN。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的結(jié)晶鋅-α-2-IFN,其中結(jié)晶鋅-α-2-IFN具有晶胞系數(shù)為a=151.4×10-10m(),b=76.6×10-10m(),c=63.1×10-10m(),α=90°,β=91.2°且Y=90°的空間群P21。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的結(jié)晶鋅-α-2-IFN,其中鋅-α-2-IFN是鋅-α-2b-IFN。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)晶鋅-α-2-IFN,其中結(jié)晶鋅-α-2-IFN在藥學(xué)上可接受的緩沖液中在37℃穩(wěn)定至少24小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)晶鋅-α-2-IFN,其中結(jié)晶鋅-α-2-IFN在pH5~6的藥學(xué)上可接受的緩沖液中在4℃至37℃之間的溫度下穩(wěn)定至少24個(gè)小時(shí)。
10.結(jié)晶α-2-IFN,其中所述結(jié)晶α-2-IFN在pH在5~6之間的藥學(xué)上可接受的緩沖液中在37℃下穩(wěn)定至少24個(gè)小時(shí)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的結(jié)晶α-2-IFN,其中所述結(jié)晶α-2-IFN在pH為5~6之間的藥學(xué)上可接受的緩沖液中在4℃至37℃之間的溫度下,穩(wěn)定至少24小時(shí)。
12.結(jié)晶鋅-α-2-IFN,其中鋅離子與α-2-IFN的摩爾比是每摩爾α-2-IFN2~4摩爾鋅。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的結(jié)晶鋅-α-2-IFN,其中結(jié)晶鋅α-2-IFN是結(jié)晶鋅-α-2b-IFN。
14.結(jié)晶鈷-α-2-IFN。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的結(jié)晶鈷-α-2-IFN,其中的結(jié)晶鈷-α-2-IFN是結(jié)晶鈷-α-2b-IFN。
16.當(dāng)給靈長(zhǎng)類皮下注射時(shí),血清半衰期至少是大約12小時(shí)的結(jié)晶-α-2-IFN。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的結(jié)晶-α-2-IFN,其中的結(jié)晶-α-2-IFN是結(jié)晶鋅-α-2-IFN。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的結(jié)晶鋅-α-2-IFN,其中的結(jié)晶鋅-α-2-IFN是結(jié)晶鋅-α-2b-IFN。
19.給一個(gè)體給藥α-2-IFN的方法,包括給個(gè)體注射結(jié)晶α-2-IFN,其中當(dāng)給靈長(zhǎng)類皮下注射時(shí),結(jié)晶α-2-IFN的血清半衰期至少為大約12個(gè)小時(shí)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法,其中的結(jié)晶α-2-IFN是結(jié)晶鋅-α-2-IFN。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法,其中的結(jié)晶鋅-α-2-IFN是結(jié)晶鋅-α-2b-IFN。
22.一種制備結(jié)晶金屬-α-2-IFN的方法,包括生成可溶性金屬-α-2-IFN配合物,在將使金屬-α-2-IFN溶液變?yōu)檫^(guò)飽和并生成結(jié)晶金屬-α-2-IFN的條件下,用一種該金屬的乙酸鹽平衡溶液中的可溶性金屬-α-2-IFN配合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法,其中的金屬選自鋅和鈷。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的方法,其特征在于通過(guò)蒸汽擴(kuò)散,液體擴(kuò)散或溫度誘導(dǎo)的方法或這些方法的結(jié)合實(shí)現(xiàn)平衡作用。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法,其中結(jié)晶點(diǎn)時(shí),存在于溶液中的金屬-α-2-IFN配合物的濃度是5至大約80mg/ml溶液。
26.片狀形態(tài)的鋅-α-2-IFN。
27.針狀形態(tài)的鋅-α-2-IFN。
全文摘要
本發(fā)明提供了結(jié)晶的鋅-α-2-干擾素(α-2-IFN)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了結(jié)晶的鈷-α-2-IFN,并且當(dāng)結(jié)晶α-2-IFN注射入靈長(zhǎng)類時(shí),其血清半衰期至少約12小時(shí)。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種生產(chǎn)結(jié)晶α-2-IFN的方法,包括形成可溶的金屬-α-2-IFN配合物,并且在將要引起金屬-α-2-IFN溶液過(guò)飽和并生成結(jié)晶金屬-α-2-IFN的條件下,在溶液中用一種該金屬的乙酸鹽平衡該可溶的金屬-α-2-IFN配合物。本發(fā)明也包括單斜晶形,片形和針形形態(tài)的結(jié)晶金屬-α干擾素。
文檔編號(hào)A61K38/21GK1120846SQ94191694
公開(kāi)日1996年4月17日 申請(qǐng)日期1994年2月24日 優(yōu)先權(quán)日1993年2月25日
發(fā)明者P·賴赫特, C·麥尼馬, N·納加布山, T·L·納加布山, S·廷多爾, A·盧扎 申請(qǐng)人:先靈公司
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