專利名稱：調(diào)節(jié)生理反應(yīng)或誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的組合物的制作方法
背景技術(shù)：
(a)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種組合物和生理活性產(chǎn)物的口服給藥及其腸內(nèi)傳遞方法。通過根據(jù)本發(fā)明方法施用的生理活性產(chǎn)物使得可以實(shí)現(xiàn)更好的系統(tǒng)傳遞和免疫誘導(dǎo)，并且已經(jīng)展示出改善的營養(yǎng)、營養(yǎng)治療和治療能力。
(b)現(xiàn)有技術(shù)描述養(yǎng)魚業(yè)的擴(kuò)大以及養(yǎng)殖密度的增加伴隨著巨大壓力，其如其它圈養(yǎng)牲畜中的一樣，已經(jīng)導(dǎo)致惡性疾病的爆發(fā)和相關(guān)的死亡。因此，這導(dǎo)致作為預(yù)防性和治療措施的抗生素的廣泛使用。然而，抗生素抗性細(xì)菌的發(fā)展和環(huán)境和魚肉中抗生素的積累加強(qiáng)了疫苗備選方案的必要性。實(shí)際上，近幾年在疫苗開發(fā)方面已經(jīng)作了大量努力并且疫苗在養(yǎng)魚業(yè)中的使用已經(jīng)普及。由于在所有脊椎動(dòng)物中，魚中特異免疫應(yīng)答由體液免疫和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫組成。在暴露于抗原時(shí)，B淋巴細(xì)胞分化成產(chǎn)生特異性抗體的漿細(xì)胞，和記憶細(xì)胞。T細(xì)胞分化成長命的輔助記憶細(xì)胞。與高等脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)相比，魚似乎產(chǎn)生單個(gè)優(yōu)勢類別的免疫球蛋白，類似于哺乳動(dòng)物的IgM。
T淋巴細(xì)胞負(fù)責(zé)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。在初次抗原刺激時(shí)，它們分化成殺傷細(xì)胞、產(chǎn)淋巴因子細(xì)胞和抑制細(xì)胞。魚中細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答也包含巨噬細(xì)胞，其是魚的非特異性防御的主要防線。與陸地的牲畜相比，魚中的接種由于它們的水生環(huán)境而變得復(fù)雜。分別注射疫苗是勞動(dòng)密集的和壓力大的，因?yàn)樽⑸淝氨仨殞Ⅳ~從水中移走并麻醉。已經(jīng)表明某些抗原當(dāng)被導(dǎo)入含有魚的水中時(shí)可在魚中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(即浸沒接種)。然而，通過浸沒誘導(dǎo)的免疫保護(hù)的程度和持續(xù)時(shí)間是多變的?；【∫呙鐝乃邢蚝琪V魚的吸收是低的，并且限于初始疫苗浴濃度的0.01-0.2％。類似地，浸在高濃度癤病疫苗中的虹鱒魚甚至當(dāng)浸沒時(shí)間長達(dá)4小時(shí)也僅僅吸收非常小比例的抗原。當(dāng)魚被注射疫苗時(shí)，保護(hù)性抗原可定位于脾臟和腎臟，它們是噬菌細(xì)胞過濾的主要器官和保護(hù)性免疫的主要位點(diǎn)。然而，將魚浸在疫苗后，抗原幾乎只位于外表面、皮膚和鰓。實(shí)際上，盡管疫苗注射誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫應(yīng)答(脾臟和腎臟中)，但是據(jù)認(rèn)為浸沒技術(shù)主要誘導(dǎo)外皮免疫應(yīng)答(在皮膚、鰓和內(nèi)臟的粘膜中)。這解釋了以下發(fā)現(xiàn)對(duì)于所有研究的疫苗，抗原的注射比浸沒方案提供了好得多的免疫保護(hù)。然而，考慮到與注射相比浸沒方法的相對(duì)簡單性，在工業(yè)中考慮將魚浸沒于含有高濃度疫苗的溶液中導(dǎo)致抗某些疾病(例如，腸紅嘴疾病和某些種類中的弧菌病)的足夠保護(hù)。然而，對(duì)于其它疾病(例如癤病和某些種類中的弧菌病)，必須對(duì)每條魚注射疫苗。然而對(duì)于其它嚴(yán)重疾病，如細(xì)菌性腎病(BKD)，開發(fā)疫苗的努力是不成功的。近些年已經(jīng)廣泛研究了疫苗的口服給藥。然而，盡管該方法最初有希望(即，對(duì)魚完全無脅迫)，但是發(fā)現(xiàn)口服疫苗僅僅產(chǎn)生非常有限水平的免疫保護(hù)。在一些情況下，抗原的口服給藥甚至導(dǎo)致免疫應(yīng)答的抑制。
在魚中疫苗的所有情況中，免疫保護(hù)的長期性是主要關(guān)心的。單次接種誘導(dǎo)的保護(hù)的時(shí)間長于1年的情況是很少的，而在多數(shù)養(yǎng)殖的魚中到達(dá)收獲的養(yǎng)殖時(shí)間長得多，超過2年。因此，許多可得到的魚疫苗效率有限。需要通常通過注射對(duì)大魚加強(qiáng)接種以提高保護(hù)的持續(xù)時(shí)間。這包括大量勞動(dòng)、處理以及對(duì)魚的導(dǎo)致死亡的脅迫?，F(xiàn)今在魚中沒有使用傳遞系統(tǒng)以延長抗原的生物利用度。此外，許多已經(jīng)增加免疫保護(hù)程度的潛在佐劑不能在商業(yè)實(shí)踐中使用，因?yàn)樗鼈儗?dǎo)致嚴(yán)重感染或者是有毒的。
和在人中的情況一樣，妨礙最佳免疫所有魚抗常規(guī)疾病的主要問題是需要傳遞多劑疫苗以維持保護(hù)性?，F(xiàn)在的免疫方案對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生短暫的刺激，因?yàn)橐呙绲姆磸?fù)應(yīng)用是傳遞疫苗的僅有的實(shí)用方法。結(jié)果，最近在哺乳動(dòng)物中進(jìn)行了深入的研究，以期開發(fā)將誘導(dǎo)長時(shí)間的保護(hù)性初次應(yīng)答的單劑量、控釋制劑?；诰酆衔镌O(shè)計(jì)，抗原的釋放模式或者為連續(xù)的或者包括旨在引發(fā)免疫應(yīng)答的抗原的初始延長釋放，和加強(qiáng)免疫應(yīng)答的延遲釋放。載體聚合物是無毒且是生物相容的，除了它們作為傳遞系統(tǒng)在得到最佳釋放速率方面的作用，還已知它們對(duì)防御機(jī)制具有強(qiáng)輔助性、非特異刺激作用。
盡管已經(jīng)建議應(yīng)用類似系統(tǒng)以允許對(duì)家畜動(dòng)物和魚的更有效接種，但是幾乎沒有相關(guān)工作評(píng)價(jià)該策略在水生種類的效果。盡管將魚疫苗摻入聚合物系統(tǒng)中將可能提供持續(xù)的疫苗釋放和改善的保護(hù)，物種之間的重要生理差異以及不同條件(例如水溫)將可能影響聚合物功能，并且將需要物種和培養(yǎng)條件之間的詳細(xì)鑒定。此外，聚合物介導(dǎo)的持續(xù)疫苗釋放需要注射，因此，在實(shí)際水平上，該策略可提供比水生物種的非密封(non-encapsulated)的疫苗相對(duì)有限的益處。
盡管魚缺少哺乳動(dòng)物的內(nèi)臟相關(guān)淋巴組織(GALT)的專門的細(xì)胞和組織部分，但是有大量證據(jù)證明腸上皮細(xì)胞，特別是后腸部分的腸上皮細(xì)胞能夠攝取抗原并將它們轉(zhuǎn)移到固有層中的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，并且在一定條件下，轉(zhuǎn)移到系統(tǒng)淋巴器官，即腎和脾。來自鯉魚的現(xiàn)有證據(jù)表明抗原的口服傳遞刺激在內(nèi)臟、鰓和皮膚中但不在腎臟和血液中產(chǎn)生抗體，而抗原的腸胃外注射刺激系統(tǒng)隔室但不刺激粘膜隔室。
然而，在鮭魚中，有人提出口服免疫僅僅在鰓、內(nèi)臟和皮膚中刺激低應(yīng)答，而注射刺激系統(tǒng)性和粘膜應(yīng)答并且刺激粘膜免疫比口服免疫更有效。
從而，盡管證明在魚中有共同粘膜免疫系統(tǒng)，但是似乎在其區(qū)室化的程度中存在一些物種差異。在被腸上皮細(xì)胞抗原攝取性質(zhì)中也有物種差異。在鯉魚(Cyprinus carpio)中，只有可溶抗原被吸收(通過胞飲)，而在鮭魚中，完整細(xì)菌細(xì)胞以及可溶抗原都可以被吸收。此外，抗原暴露于前面的內(nèi)臟中條件，盡管不一定防止后面內(nèi)臟腸上皮細(xì)胞的吸收，但是也可以影響抗原轉(zhuǎn)移到系統(tǒng)隔室中。本信息盡管仍然非常不完全，但是仍然表明口服傳遞的抗原必須受到保護(hù)防止被消化和前段小腸中其它形式的修飾和被傳遞到后面內(nèi)臟腸上皮細(xì)胞，該抗原為可以被這些細(xì)胞吸收并以強(qiáng)免疫原性形式被轉(zhuǎn)移到系統(tǒng)免疫隔室的形式。
因此，迫切需要將含有營養(yǎng)和治療劑，尤其是肽(否則不適于口服給藥)施用于人和動(dòng)物的新的、有效的、節(jié)省成本的和非侵入性的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供口服給藥后調(diào)節(jié)人或動(dòng)物(包括哺乳動(dòng)物、鳥類、昆蟲、甲殼類、兩棲類、爬行類和魚類)中至少一種生理反應(yīng)或者誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，以腸內(nèi)傳遞生理活性劑的組合物，該組合物含有增加動(dòng)物消化系統(tǒng)中pH以防止化學(xué)變性的中和劑、防止活性劑的酶促消化的消化酶抑制劑和增加生理活性劑的腸內(nèi)吸收的吸收促進(jìn)劑。本發(fā)明還基于以下發(fā)現(xiàn)三種藥劑的組合當(dāng)同時(shí)使用時(shí)提供了加和的和協(xié)同的腸內(nèi)傳遞和吸收。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供治療動(dòng)物中腸內(nèi)微生物感染的方法，該方法包括施用足量的本發(fā)明組合物，其中生理活性劑為抗微生物劑。
根據(jù)本發(fā)明，提供了口服給藥于動(dòng)物以腸內(nèi)傳遞生理活性劑或抗原的組合物，本發(fā)明組合物含有至少一種濃度為約1％到60％w/w的中和劑，濃度約1％到50％w/w的酶抑制劑和濃度約0.1％到50％w/w的吸收促進(jìn)劑。
根據(jù)本發(fā)明的組合物也可以含有選自但不限于治療劑、營養(yǎng)品、粘多糖、脂質(zhì)、糖類、類固醇、激素、生長激素(GH)、生長激素釋放激素(GHRH)、表皮生長因子、血管內(nèi)皮生長和滲透因子(VEGPF)、神經(jīng)生長因子、細(xì)胞因子、白介素、干擾素、GMCSF、類激素產(chǎn)品、神經(jīng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)、酶、抗體、肽、蛋白片段、疫苗、佐劑、抗原、免疫刺激或抑制因子、造血因子、抗癌產(chǎn)品、抗炎藥、抗寄生蟲化合物、抗微生物劑、核酸片段、質(zhì)粒DNA載體、細(xì)胞增殖抑制劑或活化劑、細(xì)胞分化因子、凝血因子、免疫球蛋白、負(fù)選擇性標(biāo)記或“自殺”劑、毒性化合物、抗血管生成劑、多肽、抗癌劑、產(chǎn)酸藥物，和組胺H2-受體拮抗劑的生理活性劑。
本發(fā)明組合物可含有用量足夠中和宿主動(dòng)物消化系統(tǒng)的酸降解并允許傳遞生理活性劑到動(dòng)物腸內(nèi)的中和劑，其中中和劑可選自抗酸藥(anti-acid)、碳酸氫鈉、碳酸鈉、檸檬酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸鈣、碳酸鈣、鎂鹽、碳酸鎂、三硅酸鎂、氫氧化鎂、磷酸鎂、氧化鎂、堿式碳酸鉍，以及它們的組合。
此外，本發(fā)明的組合物可含有由濃度為組合物的10％到20％w/w的碳酸鈉和濃度為組合物的10％到20％w/w的碳酸鈣中的至少一種組成的中和劑。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種組合物，其含有至少一種用量足夠抑制人或動(dòng)物消化系統(tǒng)中消化酶對(duì)生理活性劑的降解并允許傳遞該生理活性劑進(jìn)入人或動(dòng)物的腸內(nèi)的酶抑制劑。
消化酶抑制劑可選自但不限于，抗蛋白酶，卵清蛋白，來自油籽、大豆、四季豆、蠶豆、米糠、麥麩的植物來源的抑制劑，乙二胺四乙酸，α-1-抗胰蛋白酶，白蛋白，卵清蛋白和蛋白酶體。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可含有濃度為1％到20％w/w的胃蛋白酶抑制劑、腸肽酶抑制劑和/或白蛋白。
本發(fā)明組合物可含有可由膽汁鹽、皂苷、脫氧膽酸鹽、水楊酸鈉、十二烷基硫酸鈉、油酸、亞油酸、油酸單甘油酯、卵磷脂、溶血卵磷脂、聚氧乙烯山梨糖醇酐酯、對(duì)叔辛基苯氧基聚氧乙烯、N-月桂基-β-D-麥芽吡喃糖苷、1-十二烷基氮雜環(huán)庚烷-2-氮酮(azone)，和磷脂。
吸收促進(jìn)劑可以是濃度為0.01％到10％的脫氧膽酸鈉。
本發(fā)明的組合物可以還含有至少一種選自乙二胺四乙酸、防腐劑、抗氧化劑、著色劑、粘合劑、示蹤劑、一種或多種甜味劑、表面活性劑、除霉劑、調(diào)味劑、谷物的粗粉、豆類、酵母、釀酒酵母、礦物油、植物油、動(dòng)物油、潤滑劑、軟膏劑、以及它們的組合的附加成分。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是生理活性劑當(dāng)被傳遞到人或動(dòng)物腸內(nèi)時(shí)可被腸吸收以系統(tǒng)地傳遞，或者對(duì)腸壁具有有效生理學(xué)作用。
而且，本發(fā)明的組合物可允許生理活性劑當(dāng)被傳遞到人或動(dòng)物腸內(nèi)時(shí)對(duì)腸的內(nèi)容物具有生理學(xué)作用。該應(yīng)用可進(jìn)一步用于刺激食物穿過內(nèi)臟，或者治療傳染病。
根據(jù)本發(fā)明，生理活性劑能夠在宿主人或動(dòng)物中誘導(dǎo)抗粘膜傳染病的粘膜免疫或系統(tǒng)免疫反應(yīng)。提供了免疫宿主抗粘膜微生物的方法，該方法包括對(duì)宿主施用免疫量的、形式為被殺死的完整微生物、微生物裂解物或分離的抗原或其免疫性片段的微生物表面蛋白。
本發(fā)明還提供了口服給藥于宿主，優(yōu)選施用于宿主的內(nèi)臟(胃、消化道)以賦予抗微生物感染的保護(hù)或引發(fā)抗微生物感染的免疫應(yīng)答的組合物。
根據(jù)本發(fā)明，提供了治療動(dòng)物中腸內(nèi)微生物感染的方法，該方法包括施用含有足夠治療有效量的抗微生物劑的本發(fā)明組合物。
微生物感染可由選自但不限于下面的微生物導(dǎo)致細(xì)菌、真菌、蘑菇、酵母、病毒、葡萄球菌屬(Staphylococci)、鏈球菌屬(Streptococci)、微球菌屬(Micrococci)、消化球菌屬(Peptococci)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococci)、腸球菌屬(Enterococci)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、李斯特氏菌菌(Listeria)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、原粘桿菌屬(Propionibacterium)、真桿菌屬(Eubacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、支原體屬(Mycoplasma)、尿枝原體屬(Ureaplasma)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)，奈瑟氏菌屬(Neisseria)、艾肯氏菌屬(Eikenellus)，穆爾氏菌屬(Moraxellus)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、擬桿菌屬(Bacteroides)、梭桿菌屬(Fusobacteria)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)、韋榮氏球菌屬(Veillonella)、密螺旋體屬(Treponema)、光崗菌屬(Mitsuokella)、二氧化碳嗜纖維菌屬(Capnocytophaga)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、衣原體屬(Chlamydia)、Furonculosis，和大腸菌(coliforms)。
用于治療微生物感染的抗微生物劑可選自但不限于，抗生素、細(xì)菌素、羊毛硫抗生素、益生菌、抗真菌劑、抗霉菌劑、抗寄生蟲劑、氨基糖苷類、萬古霉素、利福平、林可霉素、氯霉素、氟喹諾(fluoroquinol)、青霉素、β-內(nèi)酰胺、阿莫西林、氨芐西林、阿洛西林、羧芐西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、哌拉西林、替卡西林、頭孢他啶、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢氨芐、頭孢噻吩、亞胺培南、氨曲南、慶大霉素、奈替米星、妥布霉素、四環(huán)素、磺胺類藥物、大環(huán)內(nèi)酯、紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素、多粘菌素B、克林霉素抗生素及其組合。
本發(fā)明還提供了系統(tǒng)傳遞方法，其包括對(duì)動(dòng)物口服給藥治療該動(dòng)物的健康疾病的治療劑，其可以還含有藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明組合物可以用于生產(chǎn)藥物或食品。
根據(jù)本發(fā)明還提供了增強(qiáng)人或動(dòng)物中腸吸收的方法，其包括口服給藥生理學(xué)有效量的生理活性劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供調(diào)節(jié)人或動(dòng)物中生理學(xué)反應(yīng)或誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括口服給藥有效量的此處定義的本發(fā)明組合物。
為了本發(fā)明的目的定義下面的術(shù)語。
術(shù)語“治療劑”以一般意義使用，包括治療劑、預(yù)防劑、替代劑和抗微生物劑。
術(shù)語“共同粘膜免疫系統(tǒng)”指在任何粘膜位置免疫可引起所有其它粘膜位置的免疫應(yīng)答這一事實(shí)。
術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“肽”和“多肽”指天然存在的化學(xué)實(shí)體和衍生自內(nèi)源、外源或合成來源的結(jié)構(gòu)上類似的生物活性等價(jià)物并用于指通過稱為肽鍵的酰胺型鍵連接的氨基酸的聚合物。
術(shù)語“結(jié)構(gòu)上類似的生物活性等價(jià)物”指氨基酸結(jié)構(gòu)盡管與天然存在的肽不同但是在結(jié)構(gòu)上足夠類似以致對(duì)受試者產(chǎn)生與天然存在的肽自身產(chǎn)生的治療效果基本等價(jià)的治療效果的多肽。
術(shù)語藥物的“治療有效量”指以可應(yīng)用于任何藥物治療的合理的利益/風(fēng)險(xiǎn)比，得到想要的治療益處的足夠量的化合物。然而，應(yīng)該理解本發(fā)明的藥物和組合物的總?cè)談┝繉⒂芍髦吾t(yī)師在正確的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)確定。任何特定患者的特定治療有效量水平將隨著各種因素而變，這些因素包括所治療的疾病和該疾病的嚴(yán)重性；使用的化合物的活性；所使用的特定組合物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；給藥時(shí)間、給藥途徑和所用的特定化合物的排泄速率、治療的持續(xù)時(shí)間；與所使用的特定化合物聯(lián)合使用或共同使用的藥物；以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中熟知的類似因素。例如，本領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知以低于需要達(dá)到想要的治療效果的劑量開始并逐步增加劑量直到實(shí)現(xiàn)想要的效果。
附圖簡述

圖1闡明了增加脫氧膽酸鈉(g脫氧膽酸鈉/kg回避混合物(bypasscocktail)對(duì)所有儲(chǔ)水池中虹鱒魚重量增加的影響；圖2闡明了增加脫氧膽酸鈉(g脫氧膽酸鈉/kg回避混合物)對(duì)extreme儲(chǔ)水池中虹鱒魚重量增加的影響；圖3闡明了隨著脫氧膽酸鈉水平的增加補(bǔ)加bST的回避混合物中溪紅點(diǎn)鮭重量增加的百分?jǐn)?shù)；
圖4闡明了對(duì)照和被注射的魚的重量的增加；圖5闡明了本發(fā)明組合物的冰凍干燥的卵清蛋白的抑制曲線；圖6闡明了本發(fā)明組合物的紅四季豆的抑制曲線；圖7闡明了本發(fā)明組合物的大豆的抑制曲線；圖8闡明了本發(fā)明組合物的蠶豆的抑制曲線；圖9闡明了本發(fā)明組合物的EDTA的抑制曲線；圖10闡明了本發(fā)明組合物的小麥麩的抑制曲線；圖11闡明了本發(fā)明組合物的噴霧干燥的卵清蛋白的抑制曲線；圖12闡明了本發(fā)明組合物的組合成分的抑制曲線；圖13闡明了虹鱒魚血漿中HRP的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖14闡明了本發(fā)明組合物對(duì)HRP吸收的影響；圖15闡明了被吸收到魚的周身循環(huán)中的完整HRP；圖16闡明了魚的口服免疫后抗體水平；圖17闡明了不同類型的疫苗給藥后魚的存活；圖18闡明了不同類型的疫苗給藥后魚的死亡率；圖19闡明了口服免疫后被強(qiáng)化的魚的抗體水平。
發(fā)明詳述本發(fā)明證明通過使用創(chuàng)新的疫苗組合物，可能運(yùn)輸生物活性蛋白穿過魚(例如但不限于虹鱒魚)的胃，由此該蛋白被吸收(圖1)。
使用該疫苗組合物以口服傳遞疫苗以便克服當(dāng)前水產(chǎn)工業(yè)所面臨的生產(chǎn)約束的有效性在此處被清楚地闡明。本發(fā)明涉及口服劑型的治療性蛋白和多肽的施用。本發(fā)明提供了與現(xiàn)有文獻(xiàn)制劑相比穿過胃腸道增加的吸收和蛋白/肽的極大提高的生物利用度。本發(fā)明可用于人和獸醫(yī)營養(yǎng)、治療和處理。如在此處和后附的權(quán)利要求書中所用的，術(shù)語“多肽”在其范圍內(nèi)包括蛋白質(zhì)和肽以及多肽。
主題發(fā)明的化合物和組合物可用于將生物活性或化學(xué)活性劑施用于任何動(dòng)物如鳥、魚、甲殼類、兩棲類、爬行類、哺乳動(dòng)物(如靈長類，尤其是人類)，以及昆蟲。該系統(tǒng)尤其利于傳遞生理、生物或化學(xué)活性劑，該活性劑否則將被該活性劑到達(dá)它們所施用的動(dòng)物體內(nèi)該活性劑的目標(biāo)區(qū)(即傳遞組合物的活性劑將被釋放的區(qū)域)之前被降解或者使得有效性降低。具體地，本發(fā)明的化合物和組合物用于口服給藥活性劑，特別是不通常口服傳遞的那些活性劑。
本發(fā)明尤其用于施用多肽，包括蛋白質(zhì)如，但不限于，治療劑、營養(yǎng)品、粘多糖、類脂、糖類、類固醇、激素、生長激素(GH)、生長激素釋放激素(GHRH)、表皮生長因子、血管內(nèi)皮生長和滲透因子(VEGPF)、神經(jīng)生長因子、細(xì)胞因子、白介素、干擾素、GMCSF、類激素產(chǎn)品、神經(jīng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)、酶、抗體、肽、蛋白片段、疫苗、佐劑、抗原、免疫刺激或抑制因子、造血因子、抗癌產(chǎn)品、抗炎藥、抗寄生蟲化合物、抗微生物劑、核酸片段、質(zhì)粒DNA載體、細(xì)胞增殖抑制劑或活化劑、細(xì)胞分化因子、凝血因子、免疫球蛋白、抗血管生成產(chǎn)品、負(fù)選擇性標(biāo)記或“自殺”劑、毒性化合物、抗血管生成劑、多肽、抗癌劑、核苷酸，等等，以及它們結(jié)構(gòu)上類似的生物活性等價(jià)物。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了口服給藥和腸內(nèi)傳遞營養(yǎng)化合物或治療性多肽的組合物，該營養(yǎng)化合物或治療性多肽可以與(但是對(duì)此處描述的產(chǎn)品沒有限制)一定比例的脫氧膽酸鹽和皂苷配制以提供宿主的腸對(duì)該肽的增加的吸收和系統(tǒng)性生物利用度。該組合物還含有pH中和劑，例如但不限于碳酸鈉和碳酸鈣，和至少一種消化酶抑制劑，如但不限于卵清蛋白或豆類。技術(shù)人員將理解中和劑、消化酶抑制劑和吸收促進(jìn)劑的性質(zhì)、數(shù)目和數(shù)量可以被修改以達(dá)到希望的傳遞性質(zhì)。該組合物優(yōu)選為固態(tài)以容易在制備口服組合物形式中操作。pH的中和旨在指增加消化道中的pH到與大多數(shù)已知的有活性的天然的或合成的生物產(chǎn)品相容的酸堿平衡。消化道的pH可以是但不限于5到9，優(yōu)選約6.5到7.5。
應(yīng)該理解上面列舉的藥物僅用于闡明的目的而不是作為可使用本發(fā)明的口服傳遞組合物優(yōu)選配制或再配制的所有藥物的包括一切的列表?？煞庋b到本發(fā)明組合物中的其它生理活性化合物包括生物學(xué)活性化合物，如蛋白質(zhì)、酶、抗酶、肽、兒茶酚胺、抗組胺類、鎮(zhèn)痛劑，等等。為了本發(fā)明的目的，“生物學(xué)的”被定義為指來自生物來源的任何營養(yǎng)學(xué)或醫(yī)學(xué)上有用的組合物和/或其合成的藥學(xué)等價(jià)物，如胰島素、血紅素、血紅蛋白(牛的、人的或合成的)，和激素；“酶”或“酶系統(tǒng)”被定義為指通過生物學(xué)產(chǎn)生的或合成的并且作為生物催化劑的任何蛋白或偶聯(lián)的蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它醫(yī)學(xué)上有用的組合物，例如，球蛋白，一種或多種糖蛋白，例如紅血球生成素，也可以被摻入到本發(fā)明的組合物中。
治療性多肽的量將變化較大，取決于各種因素如被傳遞的特定肽、所要治療的適應(yīng)癥、單個(gè)患者，等等。用量將是治療有效量，即，將提供治療效果的量，其將按照成熟的醫(yī)學(xué)實(shí)踐確定。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是腸溶衣的使用，腸溶衣可用于片劑和膠囊。腸溶衣將在胃中保持完整但是一旦它們到達(dá)小腸就快速溶解，之后在腸的下游位置(例如回腸和結(jié)腸)釋放藥物。腸溶衣是本領(lǐng)域中熟知的。備選地，控釋的口服傳遞載體可用于傳遞本發(fā)明的制劑，該載體被設(shè)計(jì)以經(jīng)過預(yù)定的時(shí)間后釋放，從而在該載體進(jìn)入回腸或結(jié)腸后釋放。這些載體包括CHRONSETTM傳遞裝置(ALZA Corporation，Palo Alto，Calif.)和PulsincapTM傳遞裝置(R.P.Scherer Co.)。
該組合物可以還含有離子對(duì)形成試劑，其中離子對(duì)形成試劑與藥物的摩爾比為約2∶1到約10∶1。加入離子對(duì)形成試劑以增加溶解的生理學(xué)活性劑或藥物的親油性，從而增加其膜滲透性。增加藥物的親油性也可以提供對(duì)藥物的保護(hù)以防止酶促失活，因?yàn)轶w內(nèi)發(fā)生的多數(shù)肽降解在胃腸道的水性環(huán)境中被酶促失活。代表性的離子對(duì)形成試劑包括十烷基磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉和苯甲酸鈉。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物可任選含有基于組合物總體積的約0.01％到約10％的腸粘膜運(yùn)輸增強(qiáng)劑，如脫氧膽酸。這種試劑促進(jìn)治療劑被吸收穿過腸粘膜中的粘膜組織并直接進(jìn)入受試者的血流中。同樣，適于用在本組合物中的組織運(yùn)輸增強(qiáng)劑選自香精油或揮發(fā)油，或者選自無毒的藥學(xué)上可接受的有機(jī)和無機(jī)酸或其鹽或酯?？捎糜诒窘M合物的香精油或揮發(fā)油選自大豆油、蠶豆油、米糠油、魚油。優(yōu)選的香精油為魚油。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物可含有附加試劑如防腐劑或抗氧化劑。典型的防腐劑包括但不限于苯甲酸鈉、山梨酸和對(duì)羥基苯甲酸的甲酯或丙酯(對(duì)羥基苯甲酸酯)。代表性抗氧化劑包括丁基化羥基苯甲醚、丁基化羥基甲苯、去甲二氫愈創(chuàng)木酸、沒食子酸酯如沒食子酸丙酯、氫醌、丙烯基甲基guaethol和硫代丙酸烷基酯，或水溶性試劑如鏈烷醇胺、醇和丙二醇。最優(yōu)選的抗氧化劑為TenoxTMGT1(1∶1維生素E-大豆油)，其以基于一滴的總體積的約5％到約25％的濃度存在。
重組人GH當(dāng)與脫氧膽酸鹽一起傳遞時(shí)，鯉魚的口服吸收增加到高達(dá)1000倍。
為了制備本發(fā)明的藥物制劑，將各成分一起干燥混合，之后加入少量油。這些材料一起混合直到得到成分的均勻混合物。所得固體制劑可壓制成片劑，然后可將其用合適的腸溶衣包衣。備選地，固體制劑可置于明膠等形成的膠囊中并用腸溶化合物包衣，或者置于控釋傳遞裝置如CHRONSETTM中。固體制劑提供了簡單而方便地制作劑型的方法。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是提供將激素和藥物傳遞到動(dòng)物或人宿主的方法。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域中，重點(diǎn)指出了魚的不同種類的生產(chǎn)。繁殖生理學(xué)的控制尤其重要。通過喂飼生物活性材料以操縱水生動(dòng)物的繁殖的發(fā)明的首先啟示由使用哺乳動(dòng)物和兩棲動(dòng)物垂體的研究提供。從而，已經(jīng)觀察到使用垂體制劑的食物替代或補(bǔ)加可誘導(dǎo)苦魚Acheilognathus inter-medium交配顯色，部分成熟，和增加卵直徑，在泥鰍Misgurnus anguillicaudatus中，導(dǎo)致排卵和在劍尾魚Xiphophorus helleri中每窩間隔縮短10-15天，并導(dǎo)致卵變大和誘導(dǎo)雌性湖紅點(diǎn)鮭早熟。類似地，對(duì)金魚C.auratus口服給藥鮭魚垂體提取物誘導(dǎo)排卵和排精增加。這些數(shù)據(jù)的重要性涉及血漿中鮭魚促性腺激素(sGtH)、睪酮和17-α-20β-diphydroxy-4-孕-3-酮的伴隨提高，這提供了對(duì)早期研究中其它垂體制劑的觀察結(jié)果的類似的基于內(nèi)分泌的解釋(即GtH的吸收)。
由于使用垂體制劑和部分純化的激素的內(nèi)在問題，似乎這些制劑不可能使用口服途徑對(duì)養(yǎng)殖的種類的繁殖控制提供任何主要的益處，除非這些制劑被配制在本發(fā)明的組合物中。成熟控制中一個(gè)相對(duì)最近的創(chuàng)新是促性腺激素釋放激素的應(yīng)用。GnRH的許多類似形式在誘導(dǎo)排卵方面比天然形式有效50-100倍，并且包括那些摻入D氨基酸并且末端殘基被乙酰胺替代的GnRH的類似形式。這些操作具有增強(qiáng)分子對(duì)蛋白裂解的抗性的作用。GnRH刺激GtH的天然釋放，顯示出廣泛的物種潛能，相對(duì)易于生產(chǎn)并因此是經(jīng)濟(jì)的。此外，這些肽在寬的溫度范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，并且表現(xiàn)出不變的效力。重要的是，這些肽如果保存在溫度低于-20℃的無菌條件下那么可無限期地穩(wěn)定。由于這種GnRHA提供了用于控制繁殖的口服途徑的優(yōu)秀的候選分子。實(shí)際上，已經(jīng)積累了足夠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，從而有或沒有多巴胺拮抗劑的GnRHA的食物傳遞現(xiàn)在表現(xiàn)為控制魚中成熟的最后階段的方法。盡管比傳統(tǒng)方法(注射、移植)更昂貴，但是食物傳遞提供了無脅迫這一優(yōu)點(diǎn)。在繁殖生物技術(shù)中的該進(jìn)步尤其用于易受處理傷害和/或太小而不能安全注射的物種(即觀賞物種)。此外，用GnRHA的慢性處理提供了誘導(dǎo)早熟的方法，認(rèn)為該方法對(duì)在魚卵產(chǎn)生時(shí)是有利的，或者用于性別逆轉(zhuǎn)的孵卵動(dòng)物。
類似于繁殖控制，使用飼料補(bǔ)充劑的研究也提供了使用口服傳遞技術(shù)可能操縱硬骨魚生長的早期啟示。從而，已經(jīng)觀察到使用前垂體粉劑喂養(yǎng)孔雀魚Lebistes reticulatus于對(duì)照相比生長能力顯著增強(qiáng)。而且，對(duì)于從生長后僅用干燥的前垂體喂養(yǎng)的劍尾魚觀察到長度增加50％，而其它實(shí)驗(yàn)觀察到每周兩次用前垂體喂養(yǎng)的湖紅點(diǎn)鮭體重增倍和長度為原來的三倍。對(duì)養(yǎng)殖的孔雀魚用生長激素(GH)和相關(guān)肽處理提供了許多潛在的好處，并且一些研究已經(jīng)證實(shí)口服傳遞的GH不僅進(jìn)入血流，而且加速魚的生長速度。重組GH的供應(yīng)現(xiàn)在是穩(wěn)定的并且隨著需求增加產(chǎn)量將增加許多倍。而且，這種重組蛋白當(dāng)在工業(yè)水平上生產(chǎn)時(shí)，是劃算的并且可容易地?fù)饺氲缴虡I(yè)飲食中。盡管GH分子的結(jié)構(gòu)完整性作為翻譯后修飾形式的前體是重要的，但是增強(qiáng)分子結(jié)構(gòu)完整性或潛能的方法從口服給藥的觀點(diǎn)看可提供益處。GH分子的生長促進(jìn)片段的描述也可以提供表達(dá)在腔降解下更大穩(wěn)定性的產(chǎn)品。
本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案是提供組合物和允許使用口服途徑接種的方法，該方法提供了顯著的益處，因?yàn)槠錅p少了勞動(dòng)成本，節(jié)約時(shí)間，減少了針頭交叉污染的可能性并且不包括存貨處理或者需要處理水的處置。
粘膜表面特異免疫性的主要抗原決定簇是分泌性IgA(S-IgA)，其在生理上和功能上與循環(huán)免疫系統(tǒng)的組分分開?？赏ㄟ^在特定粘膜位點(diǎn)施用適當(dāng)?shù)拿庖咴植空T導(dǎo)S-IgA抗體應(yīng)答。然而，粘膜S-IgA應(yīng)答的大小是通過共同粘膜免疫系統(tǒng)(CMIS)產(chǎn)生的免疫性的結(jié)果，其中免疫原被特化的淋巴-上皮結(jié)構(gòu)吸收，這些結(jié)構(gòu)總稱為粘膜相關(guān)淋巴組織(MALT)。最好的免疫淋巴表皮結(jié)構(gòu)為內(nèi)臟相關(guān)的淋巴組織(GALT)，如腸派爾斑。其它結(jié)構(gòu)上和功能上類似的淋巴濾泡在其它粘膜表面出現(xiàn)，如呼吸道的粘膜表面。
根據(jù)本發(fā)明，可通過口服給藥優(yōu)選與佐劑如霍亂毒素(CT)混合的細(xì)菌蛋白免疫原免疫宿主。當(dāng)然，作為佐劑，使用的霍亂毒素的量對(duì)宿主是無毒的。
如此處提供的疫苗保護(hù)不受微生物定居的能力指活性組分不僅可保護(hù)以抵抗受免疫的宿主中的疾病，而且通過消除免疫的個(gè)體中的攜帶，病原以及其導(dǎo)致的疾病可從作為一個(gè)整體的群體中消滅。
口服給藥也可以防止施用微生物引起的敗血癥，從而疫苗可保護(hù)不受微生物定居和敗血癥(系統(tǒng)性感染)。
例如，PspA是肺粘膜感染的優(yōu)選的抗原。在出版的國際專利申請(qǐng)WO92/14488中，其完整內(nèi)容在此處被并入作為參考，其中描述了來自S.pneumoniae Rx1的PspA基因的DNA序列，通過基因工程生產(chǎn)截短形式的PspA并闡明了這種截短形式的PspA在小鼠中賦予抵抗活肺炎雙球菌的保護(hù)性。
從PspA基因的序列表明，PspA蛋白的大小是可變的(約70kDa)。該分子的C末端37％大部分由20個(gè)氨基酸重復(fù)(repeat)組成，這些重復(fù)形成結(jié)合位點(diǎn)而允許PspA吸附到肺炎雙球菌脂磷壁質(zhì)酸的磷酸膽堿殘基。PspA的中心區(qū)富含脯氨酸并被懷疑是穿過細(xì)胞壁的分子的一部分。該分子的N末端80％序列大部分是β螺旋并含有PspA區(qū)，其可引起抗敗血癥的抗體。雖然各PspA幾乎總是至少相互間稍微不同，但是它們之間有足夠的交叉反應(yīng)性，抗體或者對(duì)一種PspA檢測的免疫應(yīng)答或者關(guān)于對(duì)于所有肺炎雙球菌是有效的。此外，用一種PspA免疫可以或者保護(hù)抵抗死亡或者延遲用幾乎所有不同攻擊株系導(dǎo)致的死亡。因此，少數(shù)PspA的混合物可提供抗多數(shù)肺炎雙球菌的有效免疫性。
在WO 92/1448中描述的免疫保護(hù)性截短的PspA可用于本發(fā)明中作為口服給藥的上述PspA片段。
體外和體內(nèi)表達(dá)重組蛋白的不同載體系統(tǒng)是已知的；例如細(xì)菌系統(tǒng)如E.coli；和病毒系統(tǒng)如細(xì)菌病毒、痘病毒(牛痘、鳥痘病毒，例如金絲雀痘病毒、雞痘病毒)、桿狀病毒、皰疹病毒、酵母，等等；并且，這些系統(tǒng)可用于使用其編碼基因產(chǎn)生重組PspA。
如果抗原與佐劑(通常用作磷酸鹽緩沖鹽水中的0.001％到50％溶液)共同施用，那么可提高免疫原性。佐劑增強(qiáng)抗原的免疫原性但是本身不一定是免疫原性的。佐劑可通過將抗原局部保持在施用部位附近以產(chǎn)生儲(chǔ)存(depot)作用而促進(jìn)抗原向免疫系統(tǒng)細(xì)胞的緩慢的、持續(xù)的釋放。佐劑也可以吸引免疫系統(tǒng)的細(xì)胞到達(dá)抗原儲(chǔ)存處并刺激這些細(xì)胞而引起免疫應(yīng)答。
免疫調(diào)節(jié)劑或佐劑已被使用多年以提高宿主對(duì)例如疫苗的免疫應(yīng)答。內(nèi)在佐劑，如脂多糖，通常是用作疫苗的被殺死的、減毒的或無毒的細(xì)菌的成分。外在佐劑是免疫調(diào)節(jié)劑，它們通常與抗原非共價(jià)相連并且被制備用以增強(qiáng)宿主免疫應(yīng)答。氫氧化鋁和磷酸鋁(統(tǒng)稱為alum)通常用作人和獸疫苗的佐劑。Alum在增強(qiáng)對(duì)白喉和破傷風(fēng)類毒素的抗體應(yīng)答的功效是成熟的，并且最近，alum已經(jīng)作為HBsAg疫苗的佐劑。
各種外在佐劑可激起對(duì)抗原的強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。這些外在佐劑包括與膜蛋白抗原復(fù)合的皂甙(免疫刺激復(fù)合體)、與礦物油的pluronic聚合物、礦物油中殺死的分歧桿菌、弗氏完全佐劑、細(xì)菌產(chǎn)物，如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)、毒素以及脂質(zhì)A、脂質(zhì)體和核酸。為了有效誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答(HIR)和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性(CMI)，免疫原優(yōu)選在佐劑中乳化。
本發(fā)明的組合物(特別是用于口服給藥)可作為液體制劑，例如等滲水性溶液、混懸劑、乳劑或可緩沖到選擇的pH的粘性組合物方便地提供。然而，因?yàn)閮?yōu)選傳遞到消化道，本發(fā)明組合物可以是“固體”形式的丸劑、片劑、膠囊劑等等，包括“固體”制劑，其隨時(shí)間釋放或者具有液體填充劑，例如明膠包被的液體，由此明膠在胃和/或小腸中溶解以傳遞到內(nèi)臟和/或消化系統(tǒng)中。
本發(fā)明組合物也可以含有藥學(xué)上可接受的調(diào)味劑和/或著色劑以使得它們更有吸引力。粘性組合物可以是凝膠劑、軟膏劑、霜?jiǎng)┑刃问讲⑼ǔ：凶懔康脑龀韯?，從而粘性為約2500到6500cps，盡管可以使用更粘稠的，甚至高達(dá)10,000cps的組合物。粘性組合物具有優(yōu)選2500到5000cps的粘度，因?yàn)楦哂谠摲秶?，它們將更難于施用。然而，高于該范圍，組合物可以接近固體或明膠形式，其然后可容易地作為口服攝入的可吞入的丸劑施用。
液體制劑通常比凝膠劑和其它粘性組合物和固體組合物更容易制備。此外，液體組合物稍微更方便施用于特別是動(dòng)物、小孩，尤其是小孩，以及吞入丸劑、片劑、膠囊劑等等有困難的其它個(gè)體，或者在多劑量情況下。另一方面，粘性組合物可在適當(dāng)?shù)恼扯确秶鷥?nèi)配制以提供與粘膜，如胃或腸內(nèi)層更長的接觸時(shí)間。
適宜的非毒性藥學(xué)上可接受的載體，尤其是口服載體，對(duì)于制藥，特別是口服或口服的藥物制劑領(lǐng)域中的技術(shù)人員將是顯而易見的。顯然，適宜的載體的選擇將依賴于特定劑型，例如液體劑型的確切性質(zhì)(例如，組合物將被配制入溶液、混懸劑、凝膠劑或另一種液體形式，或者固體劑型，或者例如，組合物將被配制到丸劑、片劑、膠囊劑、囊片、延時(shí)釋放形式或液體填充的形式)。
溶液劑、混懸劑和凝膠劑除了抗原外通常還含有大量的水(優(yōu)選純化水)。也可存在少量其它成分，如pH調(diào)節(jié)劑(例如堿如NaOH)、乳化劑或分散劑、緩沖劑、防腐劑、濕潤劑、膠凝劑(例如，甲基纖維素)、著色劑和/或調(diào)味劑。組合物可以是等滲的，即，其可以具有和血液和淚液相同的滲透壓。
本發(fā)明組合物的期望的等滲性可使用氯化鈉或者其它藥學(xué)上可接受的試劑如葡萄糖、硼酸、酒石酸鈉、丙二醇或其它無機(jī)或有機(jī)溶質(zhì)來實(shí)現(xiàn)。對(duì)于含有鈉離子的緩沖液尤其優(yōu)選氯化鈉。
使用藥學(xué)上可接受的增稠劑可以使組合物的粘度保持在所選擇的水平。優(yōu)選甲基纖維素因?yàn)槠淙菀椎玫讲⑶医?jīng)濟(jì)，并且易于使用。其它適宜的增稠劑包括，例如，黃原膠、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、卡波姆等等。增稠劑的優(yōu)選濃度將依賴于所選的試劑。重要的是使用將實(shí)現(xiàn)所選粘度的量。通常通過加入這種增稠劑從溶液制備粘性組合物。
可以使用藥學(xué)上可接受的防腐劑增加組合物的貯存期限。苯甲醇是適宜的，盡管也可以使用包括，例如對(duì)羥基苯甲酸酯、硫柳汞、氯代丁醇或苯扎氯銨的各種防腐劑。防腐劑的適宜的濃度將基于總重量為0.02％到2％，盡管根據(jù)所選擇的試劑可以有明顯的變化。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到所選擇的本組合物的組分必須對(duì)于微生物抗原是化學(xué)惰性的。這不會(huì)給化學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員帶來問題，或者可通過參考標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)或者通過簡單實(shí)驗(yàn)(不包括過度實(shí)驗(yàn))輕易地避免來自本公開的問題。
按照通常接受的方法通過混合物各成分制備本發(fā)明的免疫學(xué)有效組合物。例如，所選的組分可在混料機(jī)或其它標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備中簡單混合以得到濃縮的混合物，其然后可被調(diào)節(jié)到終濃度和粘度，這可通過加入水或增稠劑和可能地控制pH的緩沖劑或控制張力的其它溶質(zhì)來實(shí)現(xiàn)。通常pH可以為約3到7.5。組合物可以以劑量施用并且可通過醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的技術(shù)，考慮特定病人或動(dòng)物的年齡、性別、體重和狀況，以及用于給藥的組合物的形式(例如固體vs液體)進(jìn)行施用。人或其它哺乳動(dòng)物的劑量可通過技術(shù)人員不用過度實(shí)驗(yàn)即可確定。
當(dāng)CT被用作口服免疫的佐劑時(shí)，在分泌物中誘導(dǎo)特異IgA抗體。也可以誘導(dǎo)強(qiáng)循環(huán)免疫應(yīng)答，在血清中存在IgG和IgA，在脾臟的抗體分泌細(xì)胞中存在IgG和IgA。通過口(口服、胃內(nèi))施用微生物抗原與CT引起的循環(huán)(或系統(tǒng))免疫應(yīng)答可以與通過胃內(nèi)途徑施用類似抗原引起的應(yīng)答相比或者更強(qiáng)。因此，似乎口服免疫是刺激共同粘膜應(yīng)答以及循環(huán)抗體應(yīng)答的有效途徑并且比其它免疫途徑需要更少的抗原。
大多數(shù)可溶或非復(fù)制抗原是弱抗原(特別是通過口服途徑)，可能是因?yàn)樗鼈儽幌附到獠⑶覍?duì)GALT的向性很少或沒有。一個(gè)顯著的例外是CT，其是強(qiáng)粘膜抗原，可能是因?yàn)樵摻Y(jié)合亞單位CTB的G.sub.M1神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合性質(zhì)使得其被派爾斑的M細(xì)胞吸收并穿過免疫感受態(tài)細(xì)胞。除了是良好的粘膜抗原，CT還是強(qiáng)力佐劑。當(dāng)以微克劑量施用時(shí)，CT極大地與其共同施用的其它可溶抗原的免疫原性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明，提供了通過口服施用后對(duì)宿主傳遞治療劑以治療宿主的疾病或病癥(disorder)的方法。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以按照本發(fā)明治療的癌細(xì)胞包括惡性腫瘤。可以被治療的惡性(包括原發(fā)性和轉(zhuǎn)移的)腫瘤包括但不限于，發(fā)生在腎上腺、膀胱、骨、乳腺、子宮頸、內(nèi)分泌腺(包括甲狀腺、垂體腺和胰臟)、結(jié)腸、直腸、心臟、造血組織、腎、肝、肺、肌肉、神經(jīng)系統(tǒng)、腦、眼、口腔、咽、喉、卵巢、前列腺、皮膚(包括黑素瘤)、睪丸、胸腺和子宮中的腫瘤。然而，應(yīng)該理解本發(fā)明的范圍不被任何特定腫瘤限制。
然而，應(yīng)該理解本發(fā)明的范圍不被特定生物學(xué)活性成分，如治療劑所限制。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，在傳遞藥劑時(shí)能夠抑制、防止或破壞癌細(xì)胞的該藥劑是負(fù)選擇標(biāo)記；即，與化學(xué)治療劑或相互作用劑聯(lián)合抑制、防止或破壞癌腫瘤細(xì)胞的生長的物質(zhì)。
從而，在系統(tǒng)性傳遞負(fù)選擇標(biāo)記時(shí)，將相互作用劑施用于動(dòng)物或人宿主。相互作用劑與負(fù)選擇標(biāo)記相互作用以防止、抑制或破壞癌的生長。可使用的負(fù)選擇標(biāo)記為例如，但不限于胸苷激酶和胞嘧啶脫氨酶。
相互作用劑以抑制、防止或破壞癌細(xì)胞的生長有效的量被施用。例如，根據(jù)對(duì)患者的總毒性，相互作用劑可以以約5mg到約15mg/kg體重，優(yōu)選約10mg/kg施用。
通過參考下面的實(shí)施例將更容易理解本發(fā)明，這些實(shí)施例用于闡明本發(fā)明而不是限制其范圍。
實(shí)施例1虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss)和溪紅點(diǎn)鮭(Salvelinus fontinalis)的生長加強(qiáng)世界范圍的水產(chǎn)工業(yè)在過去20年里已經(jīng)經(jīng)歷了快速擴(kuò)張，并且現(xiàn)在代表最快增長的農(nóng)業(yè)部分。該部分自從1984年已經(jīng)以年百分?jǐn)?shù)速度10.9增長，相比陸地牲畜肉產(chǎn)量為3.1。在相同期間內(nèi)最快的牲畜增長部分為雞肉生長，其APR為5.3，然后是豬肉3.4，羊和小羊肉1.4，以及牛和小牛肉0.9。水產(chǎn)對(duì)世界總的食用魚起貨(landing)的貢獻(xiàn)從1984年的11.5％到1995年的25.6％(按重量計(jì))增加了2倍多。對(duì)海產(chǎn)品需求的計(jì)劃的增加以及從野生儲(chǔ)備的漁業(yè)起貨的減少，已經(jīng)并將繼續(xù)促使水產(chǎn)工業(yè)的增長。
水產(chǎn)工業(yè)，像農(nóng)業(yè)的其它部分，面臨著伴隨著傳統(tǒng)牲畜生產(chǎn)的許多生產(chǎn)挑戰(zhàn)。鮭亞目生產(chǎn)成本的40％到50％用于喂養(yǎng)。飼料含有高百分含量的昂貴的魚蛋白并且鮭亞目的魚需要相對(duì)長的飼養(yǎng)期以達(dá)到上市重量。在快速生長的魚中，過多脂肪積累是生產(chǎn)者和消費(fèi)者都關(guān)心的。
食用動(dòng)物工業(yè)的目標(biāo)是通過最小化飼料、勞力和資本投資的投入而最大化高質(zhì)量蛋白質(zhì)的產(chǎn)出來優(yōu)化生產(chǎn)效率。過去，已經(jīng)通過遺傳選擇或營養(yǎng)更改改變了經(jīng)濟(jì)學(xué)重要的參數(shù)。最近，已經(jīng)出現(xiàn)了包括內(nèi)分泌系統(tǒng)操縱的各種方法以影響家畜的生長和身體組成。外源化合物能夠成功地改變家畜的生長性能并潛在地節(jié)約生產(chǎn)成本，已經(jīng)促使研究這些化合物在魚中的用途。
來自各種來源的生長激素(GH)的施用證明該激素在刺激魚中肉的生長和減少脂肪沉積起著關(guān)鍵作用。天然的和重組的魚GH已經(jīng)被應(yīng)用于幾種魚類并且是當(dāng)注射到完整鮭亞目中時(shí)等效的。而且，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)來自哺乳動(dòng)物和鳥類來源的GH在改變幼年鮭亞目的生長性能方面是有效的。對(duì)鮭亞目施用牛GH(bGH)導(dǎo)致生長速度增加2-3倍，胃口和飼養(yǎng)效率增加以及脂肪組織減少。外源GH對(duì)較大(接近成體)的魚也有效，并且在低水溫(此時(shí)生長速度被抑制)時(shí)也有效。
口服施用GH是一種實(shí)用的方法。對(duì)于口服施用后將完整蛋白運(yùn)輸?shù)接补囚~循環(huán)系統(tǒng)中的機(jī)理提供了組織化學(xué)和生物學(xué)證據(jù)。現(xiàn)在表明口服給藥的辣根過氧化物酶在1h內(nèi)被運(yùn)輸?shù)窖h(huán)系統(tǒng)中。
據(jù)報(bào)導(dǎo)在bGH被導(dǎo)入消化道的內(nèi)腔后，該激素被運(yùn)輸?shù)揭粴q虹鱒魚的循環(huán)系統(tǒng)中。類似地表明口服施用的重組鮭魚生長激素(rsGH)顯著提高了血漿rsGH濃度。該同樣的結(jié)果表明與對(duì)照魚相比每周胃內(nèi)施用rsGH導(dǎo)致重量和魚的長度增加50％。
上面的研究支持口服給藥的來自各種來源的GH通過被保護(hù)而不被胃腸消化從而其保持完整和生物學(xué)活性而可以影響幾種硬骨魚的生長性能。這已經(jīng)引起了對(duì)開發(fā)保護(hù)生物活性蛋白(生長激素、抗原，等)防止胃的酸性環(huán)境的系統(tǒng)的嘗試。魚的口服或直腸插管法是傳遞生物活性蛋白穿過胃的有效方法，然而，它們對(duì)于商業(yè)應(yīng)用是不可行的。已經(jīng)嘗試將生物活性蛋白與去污劑和抗酸物質(zhì)共同施用以降低胃中的酸性環(huán)境。然而，這些研究已經(jīng)表明減少蛋白質(zhì)降解，但是使用的治療可影響其它重要食物因子的吸收。另一個(gè)選擇是使用pH敏感的聚合物，其包被并保護(hù)肽防止胃中的酸分解并允許在小腸中一次釋放。
從本發(fā)明的方法清楚地表明化合物(激素、疫苗、抗體等)被口服傳遞經(jīng)過單胃動(dòng)物(包括人)的胃以便繞過胃消化而到達(dá)小腸和/或大腸中的吸收位點(diǎn)。到此為止，該工作的大部分集中在使用各種制劑和目的形式開發(fā)封裝策略。這些制劑和形式可簡單地調(diào)節(jié)特定化合物以預(yù)定方式釋放，或者可使用特定生理決定因素(例如pH、溫度等)以引發(fā)被封裝材料的傳遞。
在其它形式的傳遞系統(tǒng)中使用的復(fù)雜聚合物有時(shí)難于表征。而且，一般不認(rèn)為安全(GRAS)的某些聚合物的應(yīng)用使得這些系統(tǒng)的規(guī)章性批準(zhǔn)稱為漫長而危險(xiǎn)的過程。而且，許多聚合物系統(tǒng)相對(duì)昂貴，使得大規(guī)模應(yīng)用不現(xiàn)實(shí)。
當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)著重于允許生物活性肽(在該情況中為bST)的口服傳遞的新策略。通過對(duì)目標(biāo)生物活性化合物添加暫時(shí)抑制消化酶功能的各種抗?fàn)I養(yǎng)因子和增加腸吸收的產(chǎn)品的混合物(稱為“回避混合物”)。我們已經(jīng)表明我們可有效繞過酶促過程，并增強(qiáng)上面提到的化合物的腸吸收以實(shí)現(xiàn)想要的生物學(xué)效果。
材料和方法回避混合物制劑回避混合物的配制如表1所示。未處理的油籽和種子成分從本地供應(yīng)商得到并機(jī)械去殼。魚粉、米糠、釀酒酵母、碳酸鈉、碳酸鈣和EDTA都是飼料級(jí)并購自本地供應(yīng)商。脫氧膽酸鈉和粗卵清蛋白從Sigma ChemicalCo.(St Louis MO)購買。如所示混合食物并用1mm篩目碾磨。
表1 回避混合物配方
1濃度在實(shí)驗(yàn)中可變，見材料和方法部分魚和飼料采取使用兩個(gè)鮭亞目種的一系列實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)1虹鱒魚；實(shí)驗(yàn)2溪紅點(diǎn)鮭)。之所以選擇這些種是因?yàn)樗鼈兇硌芯枯^多的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵约敖?jīng)濟(jì)上重要的養(yǎng)殖種類。
對(duì)于實(shí)驗(yàn)1，開始實(shí)驗(yàn)前將虹鱒魚(n＝20；最初重量＝52g)存放在封閉水再循環(huán)系統(tǒng)中的6-60升圓筒-圓錐形儲(chǔ)水池中。水溫保持在15℃，光周期設(shè)為12hL:12hD周期。在實(shí)驗(yàn)2中，開始實(shí)驗(yàn)前將溪紅點(diǎn)鮭(n＝400；最初重量＝38g)存放在封閉水再循環(huán)系統(tǒng)中的8-800升圓筒-圓錐形儲(chǔ)水池中。在實(shí)驗(yàn)中水溫保持在11℃。魚處于天然光周期(約14hL:10hD)中。在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中每周監(jiān)視水質(zhì)量(氨、亞硝酸鹽)并每天測量氧濃度。魚在適應(yīng)期和非處理期用商業(yè)飼料(Corey Feed Mills Ltd.Fredericton，NB)飼養(yǎng)。
實(shí)驗(yàn)操作在實(shí)驗(yàn)1中，包含重組牛生長激素((rbST；Monsanto Co.St Louis MO)以為魚提供20μg/g魚。對(duì)三個(gè)一式兩份的組喂養(yǎng)不同水平的0(對(duì)照)、4或40g脫氧膽酸鈉/kg回避混合物。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，4個(gè)一式兩份處理組接受補(bǔ)加0、1、5或10mg脫氧膽酸鈉/kg回避混合物的食物，每g魚20μg rbST。
在實(shí)驗(yàn)1和2中，每周監(jiān)控魚的重量和飼料消耗。在含有bST的回避混合物給食前對(duì)魚稱重并禁食36小時(shí)。給食后，抑制給食12小時(shí)。從這點(diǎn)開始，每天喂魚兩次到接近飽足。
結(jié)果在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，沒有觀察到處理相關(guān)的死亡，表明bST或回避混合物對(duì)虹鱒魚和溪紅點(diǎn)鮭沒有不利的健康影響。和對(duì)照相比用回避混合物中的bST喂養(yǎng)的魚顯著提高了生長速度。在實(shí)驗(yàn)1中，處理的魚的生長速度平均增加25％；最快的生長儲(chǔ)水池生長比對(duì)照大40％以上(圖1和2)。在實(shí)驗(yàn)2中，bST處理的組顯示出與對(duì)照相比增加的生長速度，然而用含有5g/kg脫氧膽酸鹽的回避混合物喂養(yǎng)的魚顯示出最高的生長速度，其與對(duì)照相比生長速度增加90％(圖3)。
實(shí)施例II虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss)的生長加強(qiáng)方法每條魚每周的腹膜內(nèi)(IP)施用劑量為20μg bST/g活體重，施用6周。
結(jié)果圖4表明腹膜內(nèi)注射的重組bST明顯誘導(dǎo)了虹鱒魚體重增長的增加。
實(shí)施例III飼料成分中存在的蛋白裂解酶抑制劑的評(píng)定提取酶方案材料1.離心Sorvall型2.Bench-top攪拌機(jī)3.解剖材料(剪刀)4.離心瓶5.分光光度計(jì)的一次性比色皿6.微離心管1.5ml7.分光光度計(jì)8.Vortexer9.來自Biorad的微板讀出器10.50mM Tris-HCl pH＝7.511.考馬斯藍(lán)染色溶液12.BSA(1mg\ml)標(biāo)準(zhǔn)溶液13.TCA20％14.虹鱒魚胰腺和十二指腸組織15.溶于50mM Tris-HCl pH＝9的5％酪蛋白
16.50mM Tris-HCl+CaCl210mM pH＝7.5酶提取物1.將虹鱒魚稱重并處死。
2.進(jìn)行解剖以除去魚的近端小腸。
3.稱重后，將組織在50mM Tris-HCl ph＝7.5中勻漿(1∶10w\v)。
4.4℃下以16000×g離心30分鐘。
5.保留上清液，等分并將它們?cè)?20℃保存?zhèn)溆谩?br> 6.進(jìn)行考馬斯分析以測量酶提取物中蛋白的量。
考馬斯亮藍(lán)染色方案1.稱量160mg BSA溶于10ml 50ml Tris-HCl pH＝7.5。
2.制備BSA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(0μg/ml到1600μg/ml)。
3.在96孔板的每孔加入4μl BSA、酶提取物和稀釋(1∶1)提取酶。
4.加入200μl考馬斯藍(lán)。
5.用來自Biorad的微板讀出器在655nm讀數(shù)。
酶促方案實(shí)驗(yàn)以一式兩份進(jìn)行。
空白1.向500μl 50mM Tris-HCl+10mM CaCl2pH＝7.5溶液。
2.加入500μl TCA 20％(蒸餾水)溶液。
3.加入20μl酶提取物。
4.加入500μl酪蛋白0.5％(50mM Tris-HCl pH＝9)溶液。
5.在4℃(冰)溫育15分鐘。12000×g離心5分鐘并在280nm讀數(shù)。
試驗(yàn)1.向500μl 50mM Tris-HCl+10mM CaCl2pH＝7.5溶液。
2.加入20μl酶提取物。
3.加入500μl酪蛋白0.5％(50mM Tris-HCl pH＝9)溶液。
4.室溫下溫育0、5、10、15和30分鐘。
5.通過加入500μl TCA 20％中止反應(yīng)。4℃(冰)溫育15分鐘。12000×g離心5分鐘并在280nm讀數(shù)。
抑制劑提取1.用工業(yè)粉碎機(jī)將商業(yè)途徑買到的食物碾磨成細(xì)粉。
2.稱取250mg粉末并置于10ml 50mM Tris-HCl pH＝7.5(終濃度應(yīng)該是25mg/ml)中。
3.用手動(dòng)組織粉碎機(jī)將溶液勻漿。
4.室溫下*以2000×g離心10分鐘。
5.保留上清液。其將是酶促方案的抑制劑提取物。
酶促方案實(shí)驗(yàn)以一式兩份進(jìn)行。
空白1.向500μl 50mM Tris-HCl+10mM CaCl2pH＝7.5溶液。
2.加入500μl TCA 20％(蒸餾水)溶液。
3.加入可變體積的抑制劑提取物或者50mM Tris-HCl pH＝7.5溶液。
4.加入10μl酶提取物。
5.加入500μl酪蛋白0.5％(50mM Tris-HCl pH＝9)溶液。
6.在4℃(冰)溫育15分鐘。12000×g離心5分鐘并在280nm讀數(shù)。
對(duì)照1.向500μl 50mM Tris-HCl+10mM CaCl2pH＝7.5溶液。
2.加入可變體積的50mM Tris-HCl pH＝7.5溶液。
3.加入10μl酶提取物。
4.室溫下溫育60分鐘。
5.加入500μl酪蛋白0.5％(50mM Tris-HCl pH＝9)溶液。
6.室溫下溫育30分鐘。
7.通過加入500μl TCA20％中止反應(yīng)。在4℃(冰)溫育15分鐘。12000×g離心5分鐘并在280nm讀數(shù)。
試驗(yàn)1.向500μl 50mM Tris-HCl+10mM CaCl2pH＝7.5溶液。
2.加入可變體積的抑制劑提取物。
3.加入10μl酶提取物。
4.室溫下溫育60分鐘。
5.加入500μl TCA 20％(蒸餾水)溶液。
6.加入500μl酪蛋白0.5％(50mM Tris-HCl pH＝9)溶液。
7.通過加入500μl TCA20％中止反應(yīng)。在4℃(冰)溫育15分鐘。
8.12000×g離心5分鐘并在280nm讀數(shù)。
結(jié)果圖5-12闡明了OraljectTM混合物的各種蛋白酶抑制劑組分體外對(duì)蛋白裂解抑制的效果，以及OraljectTM混合物的總抑制。這些數(shù)據(jù)以蛋白裂解酶抑制的程度對(duì)抑制劑內(nèi)含物增加的水平給出。該數(shù)據(jù)揭示OrajectTM混合物的各種組分(圖5-12分別為凍干的卵清蛋白、紅四季豆、大豆、蠶豆、EDTA、小麥麩、噴霧干燥的卵清蛋白)影響體外蛋白裂解酶活性的不同程度的抑制。此外，總混合物對(duì)誘導(dǎo)總的蛋白裂解酶抑制有效。最后，使用圖5到12產(chǎn)生的曲線，外推了最大抑制點(diǎn)以及提供50％最大抑制的抑制劑濃度。
實(shí)施例IV虹鱒魚血液中辣根過氧化物酶的定量的酶學(xué)分析材料1.96孔板(來自VWR的ImmulonTMII)2.來自BioradTM的微板讀出器3. 1.5ml微離心管4. 15ml或50ml離心管5.TMB片劑6. 1型辣根過氧化物酶(Sigma)7.來自山羊IgG(ICN)的抗辣根過氧化物酶
8. 0.1M碳酸氫鈉pH＝9.6緩沖液9. 0.1M磷酸-檸檬酸pH＝5緩沖液10.PBS 1X+BSA 1％+0.5％吐溫20緩沖液11.PBS 1X pH＝7.4緩沖液12.過氧化氫30％13.Saran包裝14.37℃培養(yǎng)箱15.蒸餾水16.虹鱒魚(血漿)方法用抗原包被板1.將200μl來自山羊IgG 1∶1000稀釋的抗HRP溶液(0.1M碳酸鹽-碳酸氫鹽pH＝9.6緩沖液中)分裝于96孔板中。
2.將包被的板封裝于saranTM包裝中并密封，在4℃溫育過夜或者37℃2小時(shí)。
3.用PBS 1X pH＝7.4漂洗包被的板3次。每次將磷酸鹽緩沖鹽水輕彈入水槽中并用蒸餾水再漂洗3次。
4.將板抖干并在4℃保存?zhèn)溆谩?br> 封閉板的殘留結(jié)合能力1.用200μl PBS 1X+BSA 1％+0.5％吐溫20緩沖液填充每孔。
2.在室溫下溫育30分鐘。
3.在一些孔中加入100μl 1∶10稀釋的含有HRP的樣品。
4.在另一些孔中加入100μl標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿。
5.將板在saran包裝中包裝并在37℃下溫育1小時(shí)。
6.用PBS 1X+BSA 1％+0.5％吐溫20緩沖液洗滌3次。
標(biāo)準(zhǔn)曲線方法1.用PBS 1X pH＝7.4將虹鱒魚血漿以1∶10稀釋。
2.加入HRP以得到終濃度0.5到8ng/ml。
酶測定法1.在每個(gè)管中加入200μl TMB(50mM檸檬酸鹽-磷酸鹽pH＝5緩沖液+30％過氧化氫)。
2.等待30分鐘并加入50μl硫酸以固定顯色。
3.用來自BioradTM的微板讀出器在415nm讀數(shù)。
結(jié)果為辣根過氧化物酶(HRP)進(jìn)行ELISA顯色，允許其作為口服給藥后血漿吸收研究的追蹤劑。該方法提供了記錄HRP吸收的非常靈敏的方法，其較低檢測范圍為約2.5ng HRP/ml血漿，并且線性部分高達(dá)8ng/ml(圖13)。
使用該方法跟蹤HRP吸收，對(duì)虹鱒魚強(qiáng)飼基于魚粉的對(duì)照基質(zhì)和含有HRP(2.5ng/g)的OraljectTM混合物并在施用后選擇的時(shí)間點(diǎn)采集血樣。如在圖14中所闡明的，本發(fā)明組合物中口服傳遞的HRP的血漿吸收顯著高于魚粉對(duì)照的血漿吸收。此外，施用后6小時(shí)檢測HRP的循環(huán)濃度。
實(shí)施例V口服疫苗傳遞材料和方法對(duì)于每種疫苗，將虹鱒魚(n＝50；關(guān)在12℃再循環(huán)水系統(tǒng)中)分成5組。兩組魚接受Oralject制劑1(A.salmonicida40mg/魚)中的疫苗每兩周一次持續(xù)6周，或者每兩周連續(xù)3天持續(xù)6周。Oralject制劑2的處理類似。對(duì)V.salmonicida使用相同的方案，只是魚以10mg/魚口服喂養(yǎng)。對(duì)于每種疫苗，額外組包括注射對(duì)照(對(duì)于A.salmonicida和V.salmonicida為200μl/魚0.6×1010細(xì)胞/ml)。實(shí)驗(yàn)開始后再2、4和6周取血并收集血漿并保存在-80℃直到需要分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案如下
OraljectTM制劑1->每兩周施用1次(0、2、4周)OraljectTM制劑1->每兩周施用3次(0、2、4周) OrajectTM制劑2->每周施用1次(0、2、4周)OrajectTM制劑2->每周施用3次(0、2、4周)ELISA分析使用ALPharmaTM提供的ELISA方案測定抗體水平。該方法使用小鼠抗鮭魚IG單克隆抗體(4C10)和適當(dāng)稀釋的過氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠二抗。將魚血清樣品以1∶2連續(xù)稀釋(6倍；最初稀釋1∶10)，雖然為了比較，來自口服接種的魚的所得光密度表達(dá)為從選擇的高滴定度、注射的對(duì)照魚第6組收集的魚血清(都以1∶100稀釋)的合并血清的百分OD。
結(jié)果HRP的口服施用圖15揭示完整HRP在處理后30分鐘內(nèi)被吸收到周身循環(huán)，HRP濃度在1小時(shí)處達(dá)到最大，之后下降。在基于魚粉的對(duì)照食物中有可忽略的HRP吸收，表明OraljectTM誘導(dǎo)了完整生物活性蛋白吸收的增加。
口服疫苗傳遞圖16表明OraljectTM制劑型和應(yīng)用頻率對(duì)抗體水平的影響(表達(dá)為OD的百分?jǐn)?shù)對(duì)選自高滴定注射對(duì)照的血清庫)。沒有OraljectTM制劑類型的影響，然而，應(yīng)用頻率顯著影響抗體水平，多次施用提供了增加的抗體水平。
在圖16中所示為在虹鱒魚中使用不同(a，b在施用頻率內(nèi)，不同上標(biāo)顯著不同(P＜0.05)，x，y在Oralject制劑內(nèi)，不同上標(biāo)顯著不同(P＜0.05))口服施用A.salmonicida疫苗開始實(shí)驗(yàn)后4周相對(duì)抗體水平(在1∶100的血清稀釋液的注射對(duì)照的％OD)。
實(shí)施例VI大規(guī)?？诜呙鐐鬟f材料和方法在資源和生產(chǎn)力委員會(huì)(弗雷德里克頓NB)，使用表1中描述的回避混合物的改進(jìn)進(jìn)行外部口服疫苗研究。將溪紅點(diǎn)鮭(Salvelinus fontinalis；n＝1600，平均質(zhì)量65g)分到8個(gè)儲(chǔ)水池(使用脫氯城市用水的流動(dòng)系統(tǒng)，11℃)。對(duì)一式兩份組飼以O(shè)raljectTM系統(tǒng)(OR)或商業(yè)喂飼基質(zhì)(FA)中的凍干的商業(yè)癤病疫苗(ALPharma)。陽性對(duì)照魚用疫苗(0.2ml；ip)注射，而陰性對(duì)照不作處理。最初接種后250度-天時(shí)重復(fù)口服處理(加強(qiáng)施用)。每兩周收集血清并在最初接種后450度-天時(shí)啟動(dòng)體內(nèi)同居攻擊(cohabitationchallenge)。
結(jié)果圖17清除地表明用OraljectTM-疫苗口服處理的魚對(duì)保護(hù)動(dòng)物抵抗Aeromonas salmonicida的感染與注射處理一樣有效。而且，在OraljectTM組中的抗體滴定度比在未處理組中或者用含有相同濃度疫苗的商業(yè)飼料喂養(yǎng)的魚中觀察到的抗體滴定度高(結(jié)果未顯示)。
實(shí)施例VII大規(guī)?？诜呙鐐鬟f在該研究中，我們?cè)u(píng)價(jià)了使用口服傳遞系統(tǒng)OraljectTM施用癤病疫苗的效率，該傳遞系統(tǒng)是對(duì)表1中描述的回避混合物的改進(jìn)。從而，丸狀OrajectTM系統(tǒng)施用疫苗，并監(jiān)控體液應(yīng)答和抗Aeromonas salmonicida的保護(hù)，并與注射疫苗比較。
材料和方法溪紅點(diǎn)鮭，最初質(zhì)量88g，185條魚/組。
INJAS疫苗腹膜內(nèi)注射OR8OrajectTM+AS疫苗(8％w∶w)(一劑)
CTRL未處理在第28天，所有處理組接受疫苗的加強(qiáng)(B)劑量處理。
接種步驟如供應(yīng)商所推薦的，第一次注射和加強(qiáng)注射時(shí)注射的魚(INJ)都接受0.2ml含有1.25％(w/v)癤病疫苗(Alpharma，Oslo，挪威)的PBS。加強(qiáng)注射在第28天施用。
對(duì)于第一次免疫，來自魚組或Oralject組的魚接受口服給藥的其凈重的1％。第二次接種在第一次接種后28天以相同方式進(jìn)行。來自對(duì)照組(CTRL)的魚未被處理。
時(shí)間表第0天 第一次免疫第14天 抗體劑量第28天 再次免疫(加強(qiáng)；所有組)，抗體劑量第42天 抗體劑量第70天 抗體劑量，攻擊(同居)第84天 報(bào)導(dǎo)抗體應(yīng)答劑量通過ELISA分析抗體應(yīng)答，ELISA是我們實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的。
攻擊試驗(yàn)對(duì)于體內(nèi)攻擊方法，通過同居攻擊魚。該方法為將以前感染的魚和處理的魚放置在一起，并跟蹤死亡率到預(yù)定的范圍一對(duì)照魚死亡率的給定百分?jǐn)?shù)(根據(jù)文獻(xiàn)30-40％)。
結(jié)果抗體應(yīng)答在所有處理中第一次免疫后6周抗體應(yīng)答達(dá)到峰值。
攻擊攻擊時(shí)，通過同居攻擊魚。雖然除了注射處理的，抗體水平和未處理的水平基本相同，但是發(fā)生了抵抗保護(hù)。
表2同居攻擊結(jié)果
存活的相對(duì)百分?jǐn)?shù)，RPS(1-％處理的死亡率/％未處理的死亡率)×100圖18清楚地表明用OraljectTM疫苗對(duì)魚口服處理對(duì)于保護(hù)魚免受同居攻擊后Aeromonas salmonicida的感染和注射處理一樣有效。
此外，在OraljectTM組中的抗體滴定度比在未處理組中或者用含有相同濃度疫苗的商業(yè)飼料喂養(yǎng)的魚中觀察到的抗體滴定度高(圖19)。
結(jié)論使用OrajectTM系統(tǒng)，生物活性蛋白(在該情況下，HRP)可口服傳遞到虹鱒魚，隨后在周身循環(huán)中出現(xiàn)完整蛋白。使用該策略，對(duì)基于魚粉制劑中口服傳遞測得循環(huán)HRP增加約18倍。用OrajectTM系統(tǒng)中A.salmonidicida喂養(yǎng)的虹鱒魚的水平高達(dá)注射的對(duì)照魚的75％。而且，這些結(jié)果表明OraljectTM處理提供了類似注射方法學(xué)的保護(hù)。
盡管本發(fā)明本發(fā)明根據(jù)其具體實(shí)施方案描述，但應(yīng)該理解可以進(jìn)一步修改并且該應(yīng)用旨在覆蓋一般按照本發(fā)明的原理的任何改變、使用或?qū)Ρ景l(fā)明的修改并且包括如通過本發(fā)明所述領(lǐng)域中的公知或常規(guī)操作得到和可應(yīng)用于前面提出的基本特征，以及依照所附權(quán)利要求書范圍內(nèi)的對(duì)本公開的背離。
權(quán)利要求
1.口服給藥后在人或動(dòng)物中調(diào)節(jié)生理反應(yīng)或誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的組合物，所述組合物含有a)至少一種生理活性劑；b)至少一種有效增加所述人或動(dòng)物的消化系統(tǒng)中pH以防止所述生理活性劑變性的中和劑；c)至少一種防止所述生理活性劑酶促消化的消化酶抑制劑，所述抑制劑選自勻漿的豆類、油籽或豆粉；和d)至少一種能夠增加所述生理活性劑的腸吸收的吸收促進(jìn)劑。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述中和劑濃度為約1％到60％w/w，所述抑制劑濃度約1％到50％w/w，所述吸收促進(jìn)劑濃度約0.1％到50％w/w。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述生理活性劑選自治療劑、營養(yǎng)品、粘多糖、脂質(zhì)、糖類、類固醇、激素、生長激素(GH)、生長激素釋放激素(GHRH)、表皮生長因子、血管內(nèi)皮生長和滲透因子(VEGPF)、神經(jīng)生長因子、細(xì)胞因子、白介素、干擾素、GMCSF、類激素產(chǎn)品、神經(jīng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)、酶、抗體、肽、蛋白片段、疫苗、佐劑、抗原、免疫刺激或抑制因子、造血因子、抗癌產(chǎn)品、抗炎藥、抗寄生蟲化合物、抗微生物劑、核酸片段、質(zhì)粒DNA載體、細(xì)胞增殖抑制劑或活化劑、細(xì)胞分化因子、凝血因子、免疫球蛋白、負(fù)選擇性標(biāo)記或“自殺”劑、毒性化合物、抗血管生成劑、多肽、抗癌劑、產(chǎn)酸藥物，和組胺H2-受體拮抗劑。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述中和劑用量足夠中和所述人或動(dòng)物消化系統(tǒng)中的酸降解并允許傳遞所述生理活性劑到所述人或動(dòng)物的腸內(nèi)。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述中和劑選自抗酸、碳酸氫鈉、碳酸鈉、檸檬酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸鈣、碳酸鈣、鎂鹽、碳酸鎂、三硅酸鎂、氫氧化鎂、磷酸鎂、氧化鎂、堿式碳酸鉍，以及它們的組合。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述中和劑是濃度為組合物的10％到20％w/w的碳酸鈉和濃度為組合物的10％到20％w/w的碳酸鈣中的至少一種。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述抑制劑用量足夠抑制所述人或動(dòng)物消化系統(tǒng)中消化酶對(duì)所述生理活性劑的降解并允許傳遞所述生理活性劑到所述人或動(dòng)物的腸內(nèi)。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中所述消化酶的抑制劑選自抗蛋白酶，卵清蛋白，來自油籽、大豆、四季豆、蠶豆、米糠、麥麩的植物來源的抑制劑，乙二胺四乙酸，α-1-抗胰蛋白酶，白蛋白，卵清蛋白和蛋白酶體。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中所述抑制劑含有至少一種胃蛋白酶抑制劑和一種腸肽酶抑制劑。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中所述抑制劑為濃度為1％到20％w/w的白蛋白。
11.權(quán)利要求1的組合物，其中所述吸收促進(jìn)劑選自膽汁鹽、皂苷、脫氧膽酸鹽、水楊酸鈉、十二烷基硫酸鈉、油酸、亞油酸、油酸單甘油酯、卵磷脂、溶血卵磷脂、聚氧乙烯山梨糖醇酐酯、對(duì)叔辛基苯氧基聚氧乙烯、N-月桂基-β-D-麥芽吡喃糖苷、1-十二烷基氮雜環(huán)庚烷-2-氮酮，和磷脂。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述吸收促進(jìn)劑為濃度為0.01％到10％的脫氧膽酸鹽。
13.權(quán)利要求1的組合物，其含有至少一種選自乙二胺四乙酸、防腐劑、抗氧化劑、著色劑、粘合劑、示蹤劑、甜味劑、表面活性劑、除霉劑、調(diào)味劑、谷物的粗粉、豆類、酵母、釀酒酵母、礦物油、植物油、動(dòng)物油、潤滑劑、軟膏劑、以及它們的組合的附加成分。
14.權(quán)利要求1的組合物，其中所述生理活性劑當(dāng)被傳遞到所述人或動(dòng)物的腸內(nèi)時(shí)被所述腸吸收以系統(tǒng)傳遞。
15.權(quán)利要求1的組合物，其中所述生理活性劑當(dāng)被傳遞到所述人或動(dòng)物的腸內(nèi)時(shí)對(duì)腸壁具有有效生理作用。
16.權(quán)利要求1的組合物，其中所述生理活性劑當(dāng)被傳遞到所述人或動(dòng)物的腸內(nèi)時(shí)對(duì)腸的內(nèi)容物具有生理作用。
17.權(quán)利要求1的組合物，其中所述動(dòng)物為鳥、哺乳動(dòng)物、昆蟲、甲殼類、兩棲類、爬行類或魚類。
18.權(quán)利要求1的組合物，其中所述生理活性劑在所述人或動(dòng)物中能夠誘導(dǎo)抗粘膜傳染病的免疫應(yīng)答。
19.權(quán)利要求1的組合物，其中所述調(diào)節(jié)包括增加或減少生理反應(yīng)速率。
20.一種調(diào)節(jié)人或動(dòng)物中生理反應(yīng)或誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括對(duì)所述人或動(dòng)物口服給藥足量的如權(quán)利要求1中定義的組合物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述生理反應(yīng)為身體生長、免疫反應(yīng)、脂肪代謝或肌肉合成中的至少一種。
22.一種系統(tǒng)傳遞生理活性劑到人或動(dòng)物的方法，所述方法包括對(duì)所述人或動(dòng)物口服給藥如權(quán)利要求1中定義的組合物。
23.一種增強(qiáng)人或動(dòng)物中生理活性劑或抗原的身體吸收的方法，該方法包括對(duì)所述人或動(dòng)物口服給藥生理學(xué)有效量的如權(quán)利要求1中定義的組合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物在制備用于調(diào)節(jié)人或動(dòng)物中生理反應(yīng)或誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的藥物或食物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)動(dòng)物或人口服給藥后調(diào)節(jié)生理反應(yīng)或誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的新的組合物、其用途和方法，該組合物含有至少一種增加消化系統(tǒng)中pH以防止變性的生理活性劑，一種基本防止酶促消化的消化酶抑制劑和至少一種增加生理活性劑、藥物和/或營養(yǎng)物的吸收的吸收促進(jìn)劑。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1658767SQ03813272
公開日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2003年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月8日
發(fā)明者G·W·范登堡 申請(qǐng)人:皮爾羅斯系統(tǒng)技術(shù)公司