專利名稱：光動力治療腫瘤藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術領域，具體涉及葉綠素a降解產(chǎn)物光動力治療腫瘤藥物。
目前臨床應用的光動力治療腫瘤藥物，如血卟啉衍生物(HematoporphyrinDerivative，HpD)、光敏素II或卟非姆鈉(Photofrin II，Sodium Pofimer)和癌光啉(Photocarcinorin，PsD-007)存在著三個共同的缺點，即(1)均為復雜的混合卟啉制劑，質(zhì)量難以控制；(2)紅光區(qū)吸收系數(shù)小，由此導致組織特別是靶病灶光動力效應低，限制了療效的提高；(3)對腫瘤組織無選擇性定位作用的光敏化卟啉含量高，造成正常組織光毒反應相對嚴重。上述缺點從安全、療效、質(zhì)量可控性三個方面限制了它們作為法定新藥的發(fā)展(許德余腫瘤光動力療法，中國醫(yī)藥科技出版社，1996年5月，北京；Kessel D and Dougherty TJPorphyrin Photosensitization.Plenun Press，New York，1983；Spinelli P et al.edPhotodynamic Therapy andBiomedical Lasers.Amsterdam-London，New York-Tokyo，Excerpta Medica，1992)。
因此，本發(fā)明的目的在于提供更加安全有效的光動力治療腫瘤藥物。
葉綠素a穩(wěn)定降解產(chǎn)物在紅光區(qū)的吸收系數(shù)高于上述混合卟啉制劑約一個數(shù)量級，腫瘤光生物活性遠高于后者，且不含其他對腫瘤無定位作用的光敏化物質(zhì)。毒性也明顯低于上述混合卟啉制劑。本發(fā)明者將其開發(fā)成光動力治療腫瘤藥物。
本發(fā)明的光動力治療腫瘤藥物組合物包含a.單位劑量的葉綠素a穩(wěn)定降解產(chǎn)物；b.藥學上可接受的載體。
以下對本發(fā)明作詳細描述。
本發(fā)明的光動力治療腫瘤藥物組合物中，葉綠素a穩(wěn)定降解產(chǎn)物包括脫鎂葉綠酸a、焦脫鎂葉綠酸a、二氫卟吩e4、紫紅素18/二氫卟吩p6，以紫紅素18/二氫卟吩p6和二氫卟吩e4為佳。
本發(fā)明中所述的“單位劑量”指一次靜脈注射的劑量，在注射該劑量后3-6小時進行光輻照。一般采用的單位劑量為25-250mg，較佳為50-150mg，約相當于1-2mg/kg體重。光輻照劑量為150-180J/cm2(用670-690nm波長的光)。
本發(fā)明所述的“藥學上可接受的載體”指適合于靜脈注射的任何物質(zhì)，較佳為注射用水。
本發(fā)明以我國豐富的廉價資源家蠶糞葉綠素初提物為基始原料，經(jīng)酸降解得到中間體脫鎂葉綠酸a和焦脫鎂葉綠酸a混合物，并由此中間體混合物制備得到葉綠素a穩(wěn)定降解產(chǎn)物脫鎂葉綠酸a、焦脫鎂葉綠酸a、二氫卟吩e4和紫紅素18/二氫卟吩p6。
本發(fā)明對作為光動力治療腫瘤藥物的紫紅素18和二氫卟吩e4的光敏化效應、對體外培養(yǎng)人癌細胞的光滅活作用和對動物移植瘤的光動力療效進行了研究。
(1)葉綠素a穩(wěn)定降解產(chǎn)物紫紅素18/二氫卟吩p6和二氫卟吩e4在非細胞體系內(nèi)的光敏化效應光動力治癌的基礎是某些化合物在惡性組織內(nèi)通過對可見光入射光子的能量轉遞使周圍介質(zhì)中的分子氧成為單線態(tài)氧(1O2)、氫氧自由基(OH)、超氧陰離子(O-2)和過氧化氫等活性氧物質(zhì)。它們可使生物分子的敏感基團氧化失活，并由此導致細胞器損傷和最終引起腫瘤細胞死亡而達到治愈腫瘤的目的。已知單線態(tài)氧在活性氧物質(zhì)中占有較大的比例，它在重水(D2O)中的壽命較長。通常以重水中的光敏化力作用來初步預測一種物質(zhì)作為光動力治癌藥物的可能發(fā)展前景。為了比較葉綠素a降解產(chǎn)物與目前臨床使用的光動力治癌藥物HpD在非細胞體系內(nèi)光敏化作用的強弱，按Juri G et alMed Biol Eviron1980，8139；李益新等生物物理學報1985，1(4)257；Bodaness RS et alJ Biol Chem1977，2528554；許德余等第二軍醫(yī)大學學報1988，9(5)435報道的方法，對比測定了葉綠素a穩(wěn)定降解產(chǎn)物紫紅素18/二氫卟吩p6和二氫卟吩e4在重水中對NADPH光氧化作用的敏化效應。結果如下表
表中所列數(shù)據(jù)表明，兩種葉綠素a穩(wěn)定降解產(chǎn)物不同濃度下(1μmol/L-5μmol/L)對NADPH在重水中的光氧化作用均明顯較HpD為強。
(2)葉綠素a穩(wěn)定降解產(chǎn)物紫紅素18/二氫卟吩p6和二氫卟吩e4對體外培養(yǎng)人癌細胞的光滅活作用參照文獻方法(彭遷，等第二軍醫(yī)大學學報1986，7280)測定了葉綠素a穩(wěn)定降解產(chǎn)物紫紅素18/二氫卟吩p6和二氫卟吩e4對體外培養(yǎng)人大腸癌細胞SW-1116系和人紅白血病細胞K-562系的光滅活作用，結果見下表
表中數(shù)據(jù)表明，兩種葉綠素a穩(wěn)定降解產(chǎn)物對兩種體外培養(yǎng)人癌細胞的光滅活作用均明顯較HpD為強。單純用同劑量激光輻照或單加受試化合物與空白對照一樣均對體外培養(yǎng)人癌細胞無作用，表明葉綠素a穩(wěn)定降解產(chǎn)物是頗有前景的腫瘤光動力敏化劑。其所致體外人癌細胞的光滅活作用是由其導致的光動力損傷效應的結果。
(3)三種葉綠素a穩(wěn)定降解產(chǎn)物對動物移植瘤的光動力療效參照文獻方法(陳文暉，等第二軍醫(yī)大學學報1986，7253)測定了紫紅素18/二氫卟吩6、二氫卟吩e4對小鼠S-180肉瘤、Lews肺癌和U-14宮頸癌(均為實體瘤)的光動力療效，結果如下表。
光動力治療條件受試化合物劑量5mg/kg；光劑量270J/cm2，波長630nm；療效指標以荷瘤小鼠激光輻照后，腫瘤消失，經(jīng)45天未見復發(fā)為治愈。
上表結果表明，兩種葉綠素a穩(wěn)定降解產(chǎn)物對不同動物移植瘤的光動力治療效果均明顯優(yōu)于臨床治癌用的HpD，提示它們是理想的光動力治癌新藥。
急性毒性試驗用常規(guī)方法測定葉綠素a穩(wěn)定降解產(chǎn)物紫紅素18/二氫卟吩p6和二氫卟吩e4對小鼠靜脈注射的半數(shù)致死量(LD50)，并與HpD進行比較。結果見下表紫紅素18/二氫卟吩p6280±12.43mg/kg二氫卟吩e4 252±9.65mg/kgHpD175±21.20mg/kg以上結果表明，紫紅素18/二氫卟吩p6和二氫卟吩e4的毒性低于HpD。
以下用實施例對本發(fā)明進行舉例說明，這些實施例旨在闡述本發(fā)明的最佳實施方案。本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明的啟示，結合本領域的常識所做的各種變更，均落在本申請權利要求的范圍內(nèi)。
實施例1 中間體粗品脫鎂葉綠酸a和焦脫鎂葉綠酸a的制備取市售蠶沙葉綠素初提物500g，加入乙醚2L，充分攪勻后，緩緩加入濃鹽酸(12N)2L，繼續(xù)攪拌反應0.5-1小時，室溫放冷，待分層后，分取酸層，用強堿調(diào)節(jié)pH至5-6，濾集析出的沉淀，后者用水洗凈、抽干，置真空干燥器中，P2O5減壓干燥。所得粗品脫鎂葉綠酸a和焦脫鎂葉綠酸a收率按蠶沙葉綠素初提物計算為20％。毋須分離純化即可直接用于下步反應。
實施例2紫紅素18的制備將脫鎂葉綠酸a和焦脫鎂葉綠酸a粗品混合物50g溶于2L乙醚，加入200mL25％氫氧化鉀正丙醇溶液，室溫下通空氣反應4小時，反應混合物加2倍量水稀釋后，用醋酸調(diào)節(jié)pH至2-3，上述酸性水溶液用氯仿萃取(400mL/次，3次)，合并氯仿萃取液，加無水硫酸鎂干燥過夜，濾除干燥劑，在旋轉蒸發(fā)器上蒸餾回收氯仿，殘存物即為紫紅素18粗品重10g。收率按粗品脫鎂葉綠酸a計算20％。5g紫紅素18粗品與適量硅膠H研勻，過200g硅膠H柱，展開劑氯仿-丙酮-甲醇-甲酸(70∶20∶10∶1v/v/v/v)；洗脫液經(jīng)薄層色譜檢測，收集TLC上呈單一斑點的流份，水洗、無水硫酸鈉干燥過夜，濾除干燥劑，然后在旋轉蒸發(fā)器上蒸餾回收溶劑，殘存物即為紫紅素18，分離回收率為粗品的60％。HPLC分析保留時間14.55min；相對峰面積≥95％(色譜條件Whatman ODS柱(0.46×25cm)；流動相60％(V/V)四氫呋喃水溶液+10％0.2mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液；流速0.75mL/min；柱溫25℃；柱壓3500psi；檢測波長400nm。)。紫紅素18在減性水溶液中其六元內(nèi)酸酐環(huán)即自動裂開而定量轉變成二氫卟吩p6，二氫卟吩p6水溶液抽干后，則其13-和15-位上的羧基脫去一分子水定量轉變成紫紅素18。因此，無法直接得到二氫卟吩p6固體，同樣也得不到紫紅素18的水溶液。
紫紅素18的理化性質(zhì)紫紅色粉末狀固體，不溶于水，溶于氯仿、四氫呋喃等有機溶劑；因分子中同時存在可質(zhì)子化氮原子和游離羧基，故呈兩性，在強酸或強減溶液中分別成鹽而溶解。在堿性水溶液中，內(nèi)酸酐環(huán)自動裂開轉變成二氫卟吩p6鹽；后者抽干后13-和15-位上的兩個羧基脫去一分子水形成內(nèi)酸酐而恢復紫紅素18結構(I)；對熱穩(wěn)定，300℃以上不熔；2-位乙烯基可發(fā)生雙鍵加成反應。
紫紅素18分子的結構特征如下1H-NMR(CDCl3，TMS，δppm)1.65(3H，t，4b-CH3)，1.76(3H，d，8-CH3)2.10-2.51(4H，m，7-CH2CH2)，3.17(3H，s，3-CH3)，3.34(3H，s，1-CH3)，3.62(2H，q，4a-CH2)，3.77(3H，s，5CH3)，4.42(1H，q，8-CH)，5.24(1H，m，7-CH)，6.20(1H，d，2b’-CH)，6.29(1H，d，2bCH)，7.87(1H，dd，2a-H)，8.63(1H，s，δ-CH)，9.40(1H，s，α-CH)，9.63(1H，s，β-CH)；FABMS m/z566(M+2)，565(M+1)，564(M+)，491(M-CH2CH2COOH)；IR(KBr)，υcm-13360(N-H)，3000-2800(C-H)，1740，1710(C＝O)，1600(C＝C)，1530(二氫卟吩骨架)，1300(CN)，990(CH＝)；UV/VIS λmax(CHCl3)nm412，478，510，547，645，701；Flu(THF)λexnm405，λemnm705。
實施例3二氫卟吩e4的制備取實施例1所述方法制得的脫鎂葉綠酸a和焦脫鎂葉綠酸a粗品混合物40g，加入300mL 39％KOH乙醇溶液，回流反應1小時，冷卻后用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至4，加水稀釋，濾集析出的沉淀，水洗后，減壓干燥，所得為粗品二氫卟吩e6，經(jīng)硅膠柱色譜分離得黑色粉末狀純二氫卟吩e614g。
取上述二氫卟吩e610g與200mL吡啶混合加熱回流1小時，放冷，加入反應液2倍體積的水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5-6，濾集析出的沉淀，水洗、吸干，置真空干燥器中P2O5減壓干燥，粗品重6.5g(收率65％)。所得粗品經(jīng)硅膠柱色譜分離得純二氫卟吩4，為黑色粉末狀固體，分離回收率75％。分離純化條件同(2)。HPLC分析保留時間9.0分鐘；相對峰面積≥95％，色譜條件同(2)。
二氫卟吩e4分子的結構特征如下1H-NMR(CDCl3，TMS，δppm)1.61(3H，t，4b-CH3)，2.27-2.68(4H，m，7a，7b-CH2)，3.20(3H，s，3a_CH3)，3.43(3H，s，1a-CH3)，3.56(3H，s，5a-CH3)，3.39(3H，s，10CH3)，4.524.63(2H，m，7，8-CH)，6.05-6.09(1H，dd，2b-Ha)，6.30-6.36(1H，dd，2b-Hb)，8.10-8.20(2H，m，2a-H)，9.04(1H，s，δ-H)，9.52(1H，s，α-H)，9.65(1H，s，β-H)；FABMS9m/z)509(M+)；IR(KBr)υ cm-13350(NH)，2960-2870(CH)，1715(C＝O)，1620(C＝C)，1450二氫卟吩骨架)，1230(CN)；UV/VIS(CDCl3)λmaxnm402，498，534，559，608，664；Flu(THF)λexnm398，λemnm670。
實施例4紫紅素18(二氫卟吩p6)鈉鹽靜脈注射液的配制精密稱取50g新鮮經(jīng)硅膠柱色譜分離得到的干燥紫紅素18，加入用注射用水配制的0.2N NaOH 1.5L，充分攪拌使紫紅素分子中的酸酐環(huán)完全裂開形成二氫卟吩p6鈉鹽溶解。上述二氫卟吩p6溶液用注射用水配制的0.2N HCl調(diào)節(jié)pH至7-7.5，記錄中和所消耗的酸體積，加生理鹽水稀釋至溶液總體積為5L(相當于濃度為1％的二氫卟吩p6溶液)。然后加壓濾菌，所得濾液分裝于10mL玻璃安瓿中，熔封后經(jīng)抽樣熱源試驗結果陰性并經(jīng)高效液相色譜分析結果制劑中的二氫卟吩p6含量與標示一致，即得1％二氫卟吩p6鈉鹽靜脈注射液。
所有上述配制步驟均在無菌操作條件下進行(許德余，等中國醫(yī)院藥學雜志1986，6(9)29)。
實施例5二氫卟吩e4鈉鹽靜脈注射液的配制以二氫卟吩e4代替紫紅素18如實施例4所述方法配制得1％二氫卟吩e4鈉鹽靜脈注射液。
權利要求
1.光動力治療腫瘤藥物組合物，所述組合物包含a.單位劑量的葉綠素a穩(wěn)定降解產(chǎn)物；b.藥學上可接受的載體。
2.如權利要求1所述的組合物，其中所述葉綠素a穩(wěn)定降解產(chǎn)物為紫紅素18/二氫卟吩p6或二氫卟吩e4。
3.如權利要求1所述的組合物，其中所述單位劑量為25-250mg。
4.如權利要求3所述的組合物，其中所述單位劑量為50-150mg。
5.如權利要求1所述的組合物，其中所述載體為注射用水。
6.如權利要求1-5中任何一項所述的組合物，其中所述組合物為1％二氫卟吩p6鈉鹽靜脈注射液。
7.如權利要求1-5中任何一項所述的組合物，其中所述組合物為1％二氫卟吩e4鈉鹽靜脈注射液。
全文摘要
本發(fā)明提供光動力治療腫瘤藥物組合物。所述組合物包含:a、單位劑量的葉綠素a穩(wěn)定降解產(chǎn)物;b、藥學上可接受的載體。所述葉綠素a穩(wěn)定降解產(chǎn)物包括脫鎂葉綠酸a、焦脫鎂葉綠酸a、二氫卟吩e4、紫紅素18/二氫卟吩P6。本發(fā)明的光動力治療腫瘤藥物在非細胞體系內(nèi)的光動力敏化效應、對人癌細胞的光滅活作用和對動物移植瘤的光動力療效均優(yōu)于臨床用的光動力治療腫瘤藥物血卟啉衍生物(HpD)。
文檔編號A61K31/409GK1256126SQ99119879
公開日2000年6月14日 申請日期1999年10月28日 優(yōu)先權日1999年10月28日
發(fā)明者許德余 申請人:許德余