專利名稱：生長(zhǎng)抑素多肽類似物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生長(zhǎng)抑素多肽類似物及其在阿片依賴無(wú)痛苦戒斷治療和阿片依賴預(yù)防方面的應(yīng)用。
近年來(lái)，隨著多種嗎啡受體的發(fā)現(xiàn)，嗎啡激動(dòng)劑和拮抗劑的問(wèn)世，嗎啡類依賴性治療和預(yù)防的研究取得了很大進(jìn)展。目前，臨床上戒毒主要采取美沙酮等弱激動(dòng)劑進(jìn)行替代療法。這種替代療法治療周期長(zhǎng)，痛苦大，患者不易接受，而且，美沙酮也是我國(guó)藥政部門規(guī)定的毒品之一。近幾年，我國(guó)多家單位采用了中藥戒毒法，該法治療嗎啡軀體依賴病人有一定的療效，但也有副作用大、病人戒毒時(shí)由于痛苦大而難以接受等缺點(diǎn)。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，阿片產(chǎn)生依賴不但是直接通過(guò)mu阿片受體起作用，而且間接影響到神經(jīng)系統(tǒng)的多個(gè)環(huán)節(jié)。正在基礎(chǔ)研究階段的應(yīng)用谷氨酸等興奮性氨基酸來(lái)進(jìn)行嗎啡戒斷的研究，據(jù)稱業(yè)已取得可喜的藥效。但這些從非mu阿片受體入手，進(jìn)行嗎啡戒斷治療，只能是從側(cè)面緩解依賴發(fā)作時(shí)的癥狀，不能根本解決問(wèn)題。
生長(zhǎng)抑素(Somatostatin.SOM)是機(jī)體內(nèi)一種重要的神經(jīng)內(nèi)分泌活性物質(zhì)，具有重要的生理功能。1986年，Gulya K.Pelton J等(Gulya K.Pelton J，HrubyVJ，Yamamura HI.Cyclic somatostatin octapeptide analogues with high affinityand selectivity toward mu opiod receptor.Life Science 1986，38(24)2221-2229)對(duì)生長(zhǎng)抑素的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改造，發(fā)現(xiàn)用一個(gè)非氨基酸成分Penicillianin替代生長(zhǎng)抑素肽鏈第6位氨基酸Cys后所得到的多肽類似物能選擇性地與mu阿片受體結(jié)合，而與其他阿片受體不結(jié)合。90年代，在Gulya K.Pelton J研究的基礎(chǔ)上，人們對(duì)生長(zhǎng)抑素類似物進(jìn)行了進(jìn)一步的改造，先后又出現(xiàn)多種能與mu阿片受體結(jié)合的類似物(Bonner G.G.et al Opioid peptidesSimultaneousδagonism and μ antagonism in somatostatin analogues.Peptides 1893-100，1997，Perez J et al. Neuroscience 651087-1097，1995，Hofland LJ.Et alBiochemical Pharmacology 50287-297，1995)。上述文獻(xiàn)在此合并一起作為本發(fā)明的參考文獻(xiàn)。這些文獻(xiàn)僅公開(kāi)它們作為實(shí)驗(yàn)室鑒別mu阿片受體工具的應(yīng)用和用于抗傷害性刺激的研究，未報(bào)道任何有關(guān)用于阿片依賴戒斷治療研究的內(nèi)容。
本發(fā)明的目的在于提供一類新的生長(zhǎng)抑素多肽類似物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供本發(fā)明的生長(zhǎng)抑素多肽類似物在阿片依賴無(wú)痛苦戒斷治療和阿片依賴預(yù)防方面的應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，我們?cè)诂F(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上對(duì)一些生長(zhǎng)抑素多肽類似物進(jìn)行了系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)改造和功能研究，發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)為
的多肽類似物，其中，aa1代表Phe、CH3-Phe或Tyr，aa3代表Tyr或Phe，aa4代表Trp或His，aa5代表Ala、Arg或Gly，aa6代表Thr或Ser，aa8代表Thr或Ser。
優(yōu)選aa1為D-Phe、CH3-Phe或D-Tyr，aa3代表D-Tyr或D-Phe，aa4代表D-Trp或D-His，aa5代表D-Ala、D-Arg或D-Gly，aa6代表D-Thr或D-Ser，aa8代表D-Thr或D-Ser。
符合式(I)的多肽類似物例子有
其中，結(jié)構(gòu)E與1977年Hurby報(bào)告的結(jié)構(gòu)相同，但未有相關(guān)功能的報(bào)告。
本發(fā)明的多肽類似物可與本領(lǐng)域中的常用無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸，如鹽酸、枸櫞酸，形成鹽加以應(yīng)用。
本發(fā)明的多肽類似物可用合成儀自動(dòng)合成，亦可用手工固相或液相方法合成。本發(fā)明采用Fmoc保護(hù)氨基酸，連接在Rink酰胺化樹脂上，手工方法合成。
經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的多肽類似物能用于醫(yī)療或非醫(yī)療因素引起的機(jī)體對(duì)嗎啡、海洛因、可待因等依賴的無(wú)痛苦戒斷治療；與嗎啡及其他強(qiáng)鎮(zhèn)痛藥伍用于臨床頑固性痛疼的治療，可減低或完全阻斷嗎啡等強(qiáng)鎮(zhèn)痛藥造成的軀體依賴。
下面結(jié)合附圖，用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但這些實(shí)施例并不限制本發(fā)明。


圖1為合成多肽類似物HPLC分析舉例1。
圖2為合成多肽類似物質(zhì)譜分析舉例1。
圖3為合成多肽類似物HPLC分析舉例2。
圖4為合成多肽類似物質(zhì)譜分析舉例2。
圖5為合成多肽類似物HPLC分析舉例3。
圖6為合成多肽類似物質(zhì)譜分析舉例3。
圖7為合成多肽類似物HPLC分析舉例4。
圖8為合成多肽類似物質(zhì)譜分析舉例4。
實(shí)施例1.多肽類似物的合成和確認(rèn)本發(fā)明所用多肽采用Fmoc保護(hù)氨基酸，連接在Rink酰胺化樹脂上，手工方法合成。合成方法參照文獻(xiàn)Cai et al.Proc.Natl Acad Sci USA.831896-
1900，1986。常規(guī)脫鹽方法脫鹽，用高壓液相(HPLC)和質(zhì)譜檢測(cè)確認(rèn)。
冷凍干燥。
實(shí)施例2.多肽類似物的篩選方法篩選主要在小鼠(三次)和大鼠(一次)上進(jìn)行。篩選主要采用在體方法。
動(dòng)物嗎啡依賴模型的建立小鼠采用皮下注射鹽酸嗎啡，劑量為50μg/只/次，每天兩次，連續(xù)5天。大鼠采用梯度增量法皮下注射鹽酸嗎啡。第一天為1mg/只，第二天2mg/只，第三天4mg/只，第四天8mg/只，第五天15mg/只，第六天30mg/只。
根據(jù)上述方法建立嗎啡依賴動(dòng)物，在末次用藥后2-4小時(shí)之間給藥組動(dòng)物皮下(小鼠，20μg/只)或尾靜脈(大鼠，100μg/只)注射合成類似物，20分鐘后皮下注射納絡(luò)酮促斷，觀察動(dòng)物的癥狀表現(xiàn)。并參照Peachey、李密等報(bào)告的CINA量表及動(dòng)物戒斷癥狀評(píng)價(jià)量表，對(duì)動(dòng)物表現(xiàn)的跳躍、濕狗運(yùn)動(dòng)、扭體、搖頭、掃尾、打哈欠、激惹、齒顫、咀嚼、流淚、流涎、眼瞼下垂、豎毛、腹瀉及1小時(shí)后體重下降情況，進(jìn)行記錄、評(píng)估、記分，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。根據(jù)評(píng)分情況(小鼠主要參照其跳躍次數(shù))決定所合成類似物阻斷納絡(luò)酮對(duì)嗎啡依賴動(dòng)物的促斷效果。
結(jié)果根據(jù)上述方法記錄結(jié)果如下表。
表1.幾種類似物阻斷納絡(luò)酮促斷嗎啡依賴性效果組別 例數(shù) 平均值標(biāo)準(zhǔn)差A(yù) 10 3.460000**3.20685324B 10 4.460000**2.85643325C 10 4.4200000**2.28764436D 10 6.320000*2.26785433E 10 1.6000000***2.25864517F 10 5.780000**3.46332456G 10 5.540000**3.36578423H 10 5.640000**2.78654332I 10 6.680000*3.14657732J 10 1.4000000***1.83787317K 10 1.7400000***2.24457821L 10 2.4600000***2.44654321Control 10 8.7000000 2.49666444上述A-L分別代表合成的類似物。表中平均值越大，代表戒斷癥狀越明顯。*，代表差別明顯，P＜0.05；**，代表差別非常明顯，p＜0.01；***代表p＜0.0001以上。
J＞E＞K＞L＞A＞C＞B＞G＞H＞F＞D＞I實(shí)施例3藥理藥效作用研究經(jīng)過(guò)前述篩選，對(duì)其中三種類似物(e，j，k)進(jìn)行藥理學(xué)研究。除特殊說(shuō)明外，下述每項(xiàng)指標(biāo)均是在大鼠和小鼠兩種動(dòng)物上完成的，每項(xiàng)指標(biāo)重復(fù)研究三次。在下述研究結(jié)果中，僅列出其中一次結(jié)果。
1類似物能阻斷或減緩納絡(luò)酮對(duì)嗎啡依賴動(dòng)物的促斷反應(yīng)方法首先按標(biāo)準(zhǔn)給藥方法連續(xù)5天注射嗎啡制造動(dòng)物嗎啡依賴模型。在用納絡(luò)酮促斷前5分鐘(靜脈)或30分鐘(皮下)，分別經(jīng)靜脈或皮下注射這些種多肽類似物，然后按常規(guī)方法給大劑量的納絡(luò)酮(4-5mg)。記錄動(dòng)物的癥狀，量化處理。選取一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果記錄動(dòng)物各種戒斷癥狀，按照前述的Peachey、李密等報(bào)告的CINA量表及動(dòng)物戒斷癥狀評(píng)價(jià)。結(jié)論這些種多肽類似物能明顯地阻斷納絡(luò)酮對(duì)嗎啡依賴動(dòng)物造成的的促斷反應(yīng)，并且大部分動(dòng)物表現(xiàn)出安靜狀態(tài)；而對(duì)照組則表現(xiàn)明顯的嗎啡成癮癥狀。動(dòng)物癥狀評(píng)分方差分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差別明顯。P＜0.001。
表2 納絡(luò)酮引起的各組動(dòng)物促斷反應(yīng)癥狀量化表組別 例數(shù)平均值 標(biāo)準(zhǔn)差1 10 1.6000000***2.458545192 10 1.4000000***1.837873173 10 2.7000000***2.21359436Control 10 8.70000002.49666444表中1，2，3分別代表上述序列中的E，J，K.
2類似物能減緩納絡(luò)酮引起的嗎啡依賴動(dòng)物體重的減輕方法方法同實(shí)施例1.所述。結(jié)果記錄嗎啡依賴動(dòng)注射納絡(luò)酮前及注射后一小時(shí)時(shí)，動(dòng)物體重減輕百分比(％)。結(jié)論類似物能明顯阻斷納絡(luò)酮對(duì)嗎啡依賴動(dòng)物的促斷反應(yīng)。
表3.納絡(luò)酮引起的各組動(dòng)物體重減輕情況表組別 例數(shù) 平均值 標(biāo)準(zhǔn)差1 10 3.428000***2.423073352 10 3.948000***1.542060673 10 3.461000***1.780901464 10 16.7120004.859503405 85.1775000**1.55208385***P＜0.001
其中1，2，3，分別代表上述序列中的E，J，K組，4代表生理鹽水組，5為空白對(duì)照組。
3類似物能縮短機(jī)體對(duì)阿片依賴的解除時(shí)間方法用昆明種小鼠200只。首先制造嗎啡依賴動(dòng)物模型。造模方法同實(shí)施例4.1.。造模動(dòng)物又分為四組每組50只。第一組注射類似物J；第二組，注射類似物E；第三組，注射類似物K；第四組，注射生理鹽水。用不作任何處理的正常動(dòng)物40只。上述各組動(dòng)物又等量分為五組。將分別在造模后的第二天，第三天，第四天，第五天，第六天注射納絡(luò)酮，觀察并記錄促斷癥狀，量化處理。各組每天戒斷癥狀量化結(jié)果記錄見(jiàn)表4-8結(jié)果。
結(jié)論與自然戒斷相比，類似物能明顯縮短嗎啡依賴動(dòng)物的脫依賴時(shí)間，動(dòng)物又不表現(xiàn)任何痛苦。
表4.第二天納絡(luò)酮引起的各組動(dòng)物戒斷癥狀量化表組別例數(shù)平均值 標(biāo)準(zhǔn)差1 101.700000***0.823272602 102.000000***1.054092553 101.800000***1.316561184 107.000000 0.66666667組別例數(shù)平均值 標(biāo)準(zhǔn)差1 101.700000**0.823272602 102.000000**1.054092553 101.800000**1.316561185 8 1.222222 0.66666667組別例數(shù)平均值 標(biāo)準(zhǔn)差1 107.000000***0.666666675 8 1.222222 0.66666667表5.第三天納絡(luò)酮引起的各組動(dòng)物戒斷癥狀量化表組別 例數(shù) 平均值 標(biāo)準(zhǔn)差1 10 1.800000***0.632455532 10 1.700000***0.483045893 10 1.800000***0.632455534 10 5.1000001.10050493組別 例數(shù) 平均值標(biāo)準(zhǔn)差110 1.800000**0.63245553210 1.700000**0.48304589310 1.800000**0.63245553581.222222 0.44095855組別 例數(shù) 平均值標(biāo)準(zhǔn)差410 5.100000 1.10050493581.222222***0.44095855表6.第四天納絡(luò)酮引起的各組動(dòng)物戒斷癥狀量化表組別 例數(shù) 平均值標(biāo)準(zhǔn)差110 1.700000***0.82327260210 1.500000***0.70710678310 1.700000***0.48304589410 4.800000 1.22927259組別 例數(shù) 平均值標(biāo)準(zhǔn)差110 1.700000**0.82327260210 1.500000**0.70710678310 1.700000**0.48304589581.111111 0.6009222521組別 例數(shù) 平均值標(biāo)準(zhǔn)差410 4.800000 1.22927259581.111111***0.6009222521表7.第五天納絡(luò)酮引起的各組動(dòng)物戒斷癥狀量化表組別 例數(shù)平均值標(biāo)準(zhǔn)差1 101.5000***1.178511302 102.0000***1.054092553 101.70000***0.674948564 104.90000 1.10050493組別 例數(shù) 平均值 標(biāo)準(zhǔn)差1 10 1.5000*1.178511302 10 2.0000*1.054092553 10 1.70000*0.674948565 81.00000 0.70710678組別 例數(shù) 平均值 標(biāo)準(zhǔn)差4 10 4.90000 1.100504935 81.00000***0.70710678表8.第六天納絡(luò)酮引起的各組動(dòng)物戒斷癥狀量化表組別 例數(shù)平均值標(biāo)準(zhǔn)差110 0.900000***0.73786479210 1.100000***0.73786479310 1.500000***0.70710678410 3.900000 0.99442893組別 例數(shù) 平均值 標(biāo)準(zhǔn)差110 0.900000 0.73786479210 1.100000 0.73786479310 1.500000*0.7071067858 1.000000 0.70710678組別 例數(shù) 平均值 標(biāo)準(zhǔn)差410 3.900000 0.9944289358 1.000000***0.707106784多肽類似物能明顯地降低或防止動(dòng)物對(duì)嗎啡的依賴性方法動(dòng)物使用昆明種小鼠和Wister大鼠各49只。動(dòng)物分為5組1.SOMa1+嗎啡組，2.SOMa2+嗎啡組；3.SOMa3+嗎啡組；4.單純嗎啡組；5.正常對(duì)照組。先將這些類似物分別按10ug/只皮下(小鼠和大鼠)或靜脈(大鼠)分別注射于1，2，3組動(dòng)物；等量鹽水注射于4，5，組動(dòng)物。20分鐘后再注射嗎啡給1-4組動(dòng)物注射嗎啡劑量按制造依賴模型劑量注射鹽酸嗎啡(見(jiàn)實(shí)施例4.1.)。六天后，各組動(dòng)物分別注射納絡(luò)酮進(jìn)行依賴促斷，觀察動(dòng)物反應(yīng)。并記錄戒斷癥狀，量化結(jié)果見(jiàn)表9。
結(jié)論類似物能明顯降低動(dòng)物對(duì)嗎啡的依賴性。
表9.類似物與嗎啡伍用后，納絡(luò)酮引起動(dòng)物戒斷癥狀量化表組別 例數(shù) 平均值 標(biāo)準(zhǔn)差1 10 1.6000***1.897366602 10 1.9000***2.131770263 10 1.0000***1.054092554 10 7.7000 2.66874919組別 例數(shù) 平均值 標(biāo)準(zhǔn)差1 10 1.6000**1.897366602 10 1.9000**2.131770263 10 1.0000**1.054092555 9 0.2222 0.44095855組別 例數(shù) 平均值標(biāo)準(zhǔn)差4 10 7.7000 2.668749195 9 0.2222***0.440958555軀體依賴性研究方法小鼠大鼠各48只。動(dòng)物分為5組1.SOMa1組；2.SOMa2組；3.SOMa3；4.嗎啡組；5.生理鹽水組。這些種多肽類似物按每天兩次皮下大劑量(30ug/次)注射于1，2，3組動(dòng)物體內(nèi)，連續(xù)使用超過(guò)三星期。第4，5組動(dòng)物在注射納絡(luò)酮前6天，每天分別注射鹽酸嗎啡和生理鹽水。用鹽酸嗎啡劑量同實(shí)施例嗎啡模型建立所述。然后用納絡(luò)酮(5mg/kg小鼠，4mg/kg大鼠)作促斷實(shí)驗(yàn)。
結(jié)論全部類似物處理組動(dòng)物均不表現(xiàn)任何嗎啡依賴的戒斷癥狀。分析其原因，可能和這些種多肽類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。結(jié)果觀察其癥狀并進(jìn)行量化記錄。
表10.納絡(luò)酮對(duì)各組動(dòng)物戒斷癥狀量化表組別 例數(shù) 平均值 標(biāo)準(zhǔn)差1 101.0000 0.24564322 101.0000 0.34221343 101.2000 0.15632464 108.2000 2.67894235 8 1.1000 0.32874326鎮(zhèn)痛作用方法實(shí)驗(yàn)用昆明種小鼠48只。動(dòng)物分為5組1.SOMa1組；2.SOMa2組；3.SOMa3組；4.嗎啡組；5.生理鹽水組。先將類似物1.2.3.分別注射于動(dòng)物1-3組，嗎啡注射于第五組，第四組事先不做任何處理。20分鐘后，動(dòng)物分別腹腔注射稀醋酸(0.6％)1ml，觀察記錄動(dòng)物在5分鐘內(nèi)扭體次數(shù)，并記錄。結(jié)果如表11。
表11.醋酸疼痛實(shí)驗(yàn)動(dòng)物扭體次數(shù)組別 例數(shù) 平均值標(biāo)準(zhǔn)差110 8.2.00000**1.94280904210 6..000000**1.26666667310 6.740000**1.82327260410 0.32000 0.468225645818.50000 4.53452248結(jié)論這些多肽類似物的鎮(zhèn)痛作用明顯弱于嗎啡，其中以類似物j最弱。
權(quán)利要求
1.具有下式結(jié)構(gòu)的多肽類似物或其與酸形成的鹽，
其中，aa1代表Phe、CH3-Phe或Tyr，aa3代表Tyr或Phe，aa4代表Trp或His，aa5代表Ala、Arg或Gly，aa6代表Thr或Ser，aa8代表Thr或Ser，D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Arg-Thr-Pen-Thr-NH2除外。
2.按照權(quán)利要求1所述的多肽類似物或其與酸形成的鹽，其特征在于aa1代表D-Phe、CH3-D-Phe或D-Tyr，aa3代表D-Tyr或D-Phe，aa4代表D-Trp或D-His，aa5代表D-Ala、D-Arg或D-Gly，aa6代表D-Thr或D-Ser，aa8代表D-Thr或D-Ser。
3.按照權(quán)利要求1所述的多肽類似物或其與酸形成的鹽，結(jié)構(gòu)為
4.按照權(quán)利要求1所述的多肽類似物或其與酸形成的鹽，結(jié)構(gòu)為
5.按照權(quán)利要求1所述的多肽類似物或其與酸形成的鹽，結(jié)構(gòu)為
6.按照權(quán)利要求1所述的多肽類似物或其與酸形成的鹽，結(jié)構(gòu)為
7.按照權(quán)利要求1所述的多肽類似物或其與酸形成的鹽，結(jié)構(gòu)為
8.按照權(quán)利要求1所述的多肽類似物或其與酸形成的鹽，結(jié)構(gòu)為
9.按照權(quán)利要求1所述的多肽類似物或其與酸形成的鹽，結(jié)構(gòu)為
10.按照權(quán)利求1所述的多肽類似物或其與酸形成的鹽，結(jié)構(gòu)為
11.權(quán)利要求1所述的多肽類似物在制備預(yù)防或治療阿片類物質(zhì)依賴藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生長(zhǎng)抑素多肽類似物及其在阿片依賴無(wú)痛苦戒斷治療或阿片依賴預(yù)防方面的應(yīng)用。這種多肽類似物的結(jié)構(gòu)為aal-D-Cys-aa3-aa4-aa5-aa6-Pen-aa8,其中aa1代表Phe、CH
文檔編號(hào)A61P25/30GK1257871SQ9910074
公開(kāi)日2000年6月28日 申請(qǐng)日期1999年2月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月13日
發(fā)明者劉少君 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所