專利名稱：控制對(duì)抗生素耐藥的革蘭氏陽性細(xì)菌的方法和治療感染的方法
背景技術(shù)：
乳鏈菌肽(nisin)是一種由食品級(jí)微生物產(chǎn)生的細(xì)菌素，為抗微生物物質(zhì)，屬于被稱為羊毛硫抗生素(lantibiotics.或lanthocin)的一組類似物質(zhì)，其中還包括枯草菌素、表皮素、gallidermin、pep5、肉桂霉素、耐久霉素和血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制肽。
乳鏈菌肽由屬于藍(lán)斯菲爾德血清學(xué)N組的乳酸乳球菌乳亞種(Lactococcuslactis subsp.lactis)產(chǎn)生(Mattick，A.T.R.和A，Hirsh，1947《柳葉刀》(Lancet)2，5)。乳鏈菌肽是一種包含34個(gè)氨基酸殘基的肽，其中包含由構(gòu)成羊毛硫氨酸或β-甲基羊毛硫氨酸的硫醚橋交聯(lián)的5個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)。這些硫醚由半胱氨酸的巰基與絲氨酸或蘇氨酸形成的脫氫側(cè)鏈縮合而成，是乳鏈菌肽前體肽翻譯后經(jīng)修飾的結(jié)果。
據(jù)報(bào)道，乳鏈菌肽起著陽離子表面活性劑的作用，其活性可以被陰離子去垢劑中和(Ramseier，H.R.1960 Arch.Mikrobiol，37.57)，在分子水平上，乳鏈菌肽作用于細(xì)胞質(zhì)膜而且抑制肽聚糖的生物合成(Ramseier，等.1980 Arch.Mikrobiol，127，187)。乳鏈菌肽抗?fàn)I養(yǎng)期細(xì)菌的作用很可能是因?yàn)殡牟迦胫|(zhì)雙層后對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的電壓依賴性去極化作用，這可能是通過相鄰乳鏈菌肽分子的相互作用形成一個(gè)臨時(shí)性的孔或通道。乳鏈菌肽的分子特性及其生物合成的機(jī)制已成為目前廣泛評(píng)論的主題(Jung，G.和H.G.Sahl 1991《乳鏈菌肽和新的羊毛硫抗生素》(Nisinand Novel Lantibiotics)ESCOM Science Publishers，Leiden)。
乳鏈菌肽被認(rèn)為只有窄譜活性而且通常只有抗革蘭氏陽性菌的活性，但在與螯合劑組合時(shí)能出乎意料地抗革蘭氏陰性菌并且表現(xiàn)出抗革蘭氏陽性菌的活性增強(qiáng)(Blackburn等的美國專利5,135,910，5,217,950和5,260,271)。乳鏈菌肽目前被用作抗微生物食品防腐劑并被JEFCA及包括美國、英國和歐洲經(jīng)濟(jì)共同體在內(nèi)的各國食品添加劑管理當(dāng)局認(rèn)為是安全的。
本發(fā)明綜述本發(fā)明涉及預(yù)防和治療由對(duì)抗生素耐藥的病原體感染而引起的疾病的方法。這些方法使用乳鏈菌肽和其它含羊毛硫氨酸的細(xì)菌素(羊毛硫抗生素)，以及由遺傳工程或半合成化學(xué)產(chǎn)生的其結(jié)構(gòu)變體。本發(fā)明的方法適用于抗葡萄球菌屬、鏈球菌屬和腸球菌屬對(duì)抗生素耐藥的菌株及其它。
本發(fā)明的詳細(xì)說明細(xì)菌感染，尤其是在醫(yī)院中獲得的感染，部分由于對(duì)目前用于治療的抗生素耐藥的臨床分離株的選擇而更難治療。特別是對(duì)甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌(MRSA)和對(duì)甲氧西林耐藥的凝固酶陰性葡萄球菌(MRSE)已經(jīng)變得對(duì)除糖肽類抗生素萬古霉素和替考拉寧之外的大多數(shù)目前使用的抗生素具有耐藥。雖然萬古霉素被選作這類感染的首選藥物，但它并不總是臨床有效的(Karchmer，A.W.1991《內(nèi)科紀(jì)事》(Annals of Internal Medicine)115739)。腸球菌感染一直很難治療，部分是因?yàn)樗鼈儗?duì)許多抗菌藥具有固有的耐藥性，部分是因?yàn)樗鼈儗?duì)于通常能夠殺滅其它菌種的藥物所具有的耐受性(難于殺滅)(Murray，B.E.1990《臨床微生物學(xué)評(píng)論》(Clin.Microbio.Rev.)346)。目前，腸球菌已獲得了對(duì)萬古霉素的耐藥性，而且由腸球菌屬耐萬古霉素分離株引起的感染正以驚人的速度增加，尤其是在重癥監(jiān)護(hù)病房中(Emori，T.G.和R.P.Gaynes 1993《臨床微生物學(xué)評(píng)論》6428)。腸球菌和葡萄球菌之間可以進(jìn)行遺傳信息的接合轉(zhuǎn)移，在實(shí)驗(yàn)室中已經(jīng)出現(xiàn)了對(duì)萬古霉素耐藥性的轉(zhuǎn)移(Noble，W.C.等，1992，F(xiàn)EMS Microbil，Lett.721995)；所以，在醫(yī)院內(nèi)獲得的感染中出現(xiàn)對(duì)萬古霉素耐藥的葡萄球菌似乎只是一個(gè)時(shí)間問題。在社會(huì)獲得性感染中，在鏈球菌中出現(xiàn)耐藥性是擔(dān)心的一個(gè)原因，特別是在肺炎球菌中(Thornsberry.C.等1993《醫(yī)學(xué)中的感染第10卷增刊D》15(Infection in Medicine 10 Suppl.D)15；Stutman，H.R.1993《醫(yī)學(xué)中的感染第10卷增刊D》51)。A組鏈球菌(患病率及死亡率周報(bào)43401，1994，作者不詳)和葡萄球菌(引起壞死性筋膜炎和中毒性休克樣綜合征之類的問題)高度產(chǎn)毒的菌株很難治療，經(jīng)常導(dǎo)致病人的迅速死亡。顯然，需要新的更有效而且作用更迅速的抗微生物藥來對(duì)付這類感染。
雖然在原則上可以考慮將乳鏈菌肽用在需要抗微生物劑的某些情況中，而且該細(xì)菌素已經(jīng)在動(dòng)物模型的初步研究中被證明是有效的(Mattick，A.T.R和A.Hirsch，1947《柳葉刀》25；Bavin.E.M.等，1952《柳葉刀》1127；Gowans，J.L.等，1952《英國藥理學(xué)雜志》(Brit.J.Pharmacol.)7438；Hiesch，A和A.T.R.Mattick 1949《柳葉刀》ii190)，但是乳鏈菌肽被發(fā)現(xiàn)不夠有效以適于人或獸醫(yī)治療上的開發(fā)。阿肽加定和mersacidin是目前已被評(píng)價(jià)的較新的含羊毛硫氨酸的抗微生物肽，但被發(fā)現(xiàn)與目前使用的治療藥物相比對(duì)葡萄球菌和腸球菌只有中等活性(Arioli，V.等，1976《抗生素雜志》(J.Antibiotics)29511；Somma，S.等，1977，Antimicob.Ag.Chemother；Barrett，M.S等，1992(Diagn.Microbiol.Infect.Dis.)15641)，因而未必具有治療價(jià)值。
但是，我們發(fā)現(xiàn)乳鏈菌肽是抗革蘭氏陽性細(xì)菌病原株的強(qiáng)殺菌劑。具體地說，我們發(fā)現(xiàn)乳鏈菌肽對(duì)目前對(duì)多藥耐藥的金黃色葡萄球菌、對(duì)甲氧西林耐藥的凝固酶陰性葡萄球菌、A組鏈球菌的某種致壞死菌株和對(duì)多藥耐藥的肺炎球菌具有殺菌作用。而且，我們發(fā)現(xiàn)乳鏈菌肽是對(duì)包括對(duì)萬古霉素耐藥的腸球菌在內(nèi)的腸球菌的有效殺菌劑。由于腸球菌眾所周知地對(duì)抗微生物劑具有耐性，以上結(jié)果是出乎意料的，而且有力地揭示乳鏈菌肽可能具有特殊的治療價(jià)值?，F(xiàn)已承認(rèn)，廣泛使用廣譜抗微生物劑，尤其是低劑量口服將導(dǎo)致對(duì)多藥耐藥病原體的大量出現(xiàn)，所以，既然乳鏈菌肽是以低劑量隨食物攝取的卻沒有出現(xiàn)對(duì)乳鏈菌肽的耐藥性和對(duì)其它抗微生物劑的交叉耐藥性是出人意料的。雖然在乳鏈菌肽作為抗微生物食品防腐劑的早期開發(fā)中沒有篩選對(duì)當(dāng)時(shí)各種抗生素的交叉耐藥性[Hossack DJN，1988年4月6日聯(lián)邦記事，vol.53，No.66.Szybalskiw，1988年4月6日，聯(lián)邦記事，vol.53，No.66]，但是直到現(xiàn)在，在乳鏈菌肽被任意用于食品中許多年以后，才對(duì)其對(duì)目前多藥耐藥的病原體的作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
以上發(fā)現(xiàn)表明不僅乳鏈菌肽，而且羊毛硫抗生素類抗微生物肽的其它相關(guān)成員，其中包括枯草菌素、表皮素、gallidermin、pep5、肉桂霉素、耐久霉素和血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制肽，以及由遺傳工程或半合成化學(xué)產(chǎn)生的此類分子的結(jié)構(gòu)變體也應(yīng)該可用于預(yù)防或治療由對(duì)抗生素耐藥的細(xì)菌在人和動(dòng)物中引起的感染。
這類肽的有效藥物配方包括適合活性藥物胃腸外給藥的單純的水溶液，即通過靜脈(i.v.)、肌內(nèi)(i.m.)、皮下(s.c.)或腹腔內(nèi)(i.p.)途徑使活性藥物在血液和組織內(nèi)的水平超過其最低抑菌濃度(MIC)，由此降低細(xì)菌的滴度以預(yù)防、治療、治愈或緩解感染。據(jù)估計(jì)，羊毛硫抗生素類抗微生物藥可以同時(shí)或先后與其它抗微生物藥聯(lián)用，以更有效地提供更廣譜的治療，尤其是在開始治療前缺乏特異性診斷時(shí)。據(jù)估計(jì)，約每日2-200mg/kg的劑量范圍能夠有效地降低細(xì)菌的滴度。而且預(yù)計(jì)適合局部使用于皮膚和/或粘膜的藥物配方例如水性或石油基軟膏、洗劑、乳劑或凝膠劑也可用于控制對(duì)抗生素耐藥的微生物。例如，某種以羊毛硫抗生素為基礎(chǔ)的適合前鼻孔給藥的局部配方，其中包含超過其MIC的活性藥物濃度，因而足以降低細(xì)菌滴度，可以預(yù)計(jì)它能特別有效地控制MRSA在病人和護(hù)理人員體內(nèi)的定居，由此降低獲得潛在的威脅生命的對(duì)抗生素耐藥的感染的危險(xiǎn)。
實(shí)施例菌株。對(duì)甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌(MRSA)和表皮葡萄球菌(MRSE)是不同的歐洲醫(yī)院提供的臨床分離株，而高度產(chǎn)毒的化膿鏈球菌和對(duì)萬古霉素耐藥的糞腸球菌(Enterococcus faecalis)株則是美國的臨床分離株。其它被測的MRSA、MRSE和對(duì)萬古霉素耐藥的屎腸球菌(Enterococcus faecium)樣本都是美國的臨床分離體。在各組實(shí)驗(yàn)中，測試了來自4個(gè)不同國家的MRSA株，來自西班牙的MRSE株，來自6個(gè)不同國家的對(duì)青霉素耐藥的肺炎鏈球菌和來自紐約兩家醫(yī)院的對(duì)萬古霉素耐藥的腸球菌。還有其它分離株來自培養(yǎng)物保藏中心。
最低抑菌濃度(MIC)。主要用NCCLS(臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)國家委員會(huì))肉湯微量稀釋法來測定MIC。在使用MRSA和MRSE和對(duì)萬古霉素耐藥的屎腸球菌的美國分離株進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，使用的是未補(bǔ)充的Mueller-Hinton肉湯。在用來自不同的歐洲醫(yī)院的MRSA和MRSE分離株和化膿鏈球菌及對(duì)萬古霉素耐藥的糞腸球菌美國臨床分離株進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中使用的是胰蛋白酶大豆肉湯。在后者中，在稀釋劑中使用0.02％牛血清白蛋白(最終濃度為0.01％)來防止乳鏈菌肽粘著于塑料微量滴定板的孔上。
最低殺菌濃度(MBC)。在測定了MIC后，采取沒有細(xì)菌生長的測試孔的樣品，并進(jìn)行平板培養(yǎng)以計(jì)數(shù)菌落。MBC定義為接觸24小時(shí)內(nèi)殺死最初接種物99.9％的最低濃度。
細(xì)菌培養(yǎng)物的裂解和快速殺菌活性。使用的培養(yǎng)基包括用于肺炎鏈球菌的’C+Y’肉湯，用于葡萄球菌的胰蛋白酶大豆肉湯和用于腸球菌的腦心浸汁肉湯。根據(jù)后文表中所述，不同種類的細(xì)菌用不同濃度的乳鏈菌肽在37℃培養(yǎng)不同的時(shí)間。測定600nm處的光密度，與接觸乳鏈菌肽之前培養(yǎng)物的該值相比，以百分比的降低作為裂解率。此外，在某些實(shí)驗(yàn)中，基本上如在MBC中所述取樣并測定活菌數(shù)。
小鼠腹腔內(nèi)感染模型。將金黃色葡萄球菌NCTC8325培養(yǎng)在小牛肉浸汁肉湯中，每個(gè)小鼠用稀釋在肉湯+10％(w/v)Difco細(xì)菌粘蛋白中的103菌落形成單位(CFU)進(jìn)行腹腔內(nèi)感染。以5鼠為一組，或不進(jìn)行治療，或在感染10分鐘內(nèi)靜脈給藥10mg/kg乳鏈菌肽(通過尾靜脈，以pH5.0的0.5ml水溶液形式)。對(duì)小鼠觀察48小時(shí)，以記錄死亡率或不良反應(yīng)實(shí)施例1.乳鏈菌肽抗目前對(duì)多藥耐藥的病原體的MIC和MBC測定如表1所示，乳鏈菌肽對(duì)不同種葡萄球菌、腸球菌和鏈球菌的實(shí)驗(yàn)室ATCC菌株和臨床分離株都表現(xiàn)出優(yōu)良的抑菌活性(MIC)，但是對(duì)革蘭氏陰性菌(大腸桿菌和綠膿桿菌)作用較弱。臨床分離株包括對(duì)甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌(MRSA)和表皮葡萄球菌(MRSE)，對(duì)莫匹羅星耐藥的(mup-r)金黃色葡萄球菌和MRSA，以及對(duì)萬古霉素耐藥的(van-r)糞腸球菌和屎腸球菌。對(duì)所有被測微生物的MBC(24小時(shí)內(nèi)殺死至少99.9％細(xì)菌的濃度)都等于或在少數(shù)實(shí)驗(yàn)中兩倍于MIC，這表明乳鏈菌肽對(duì)這些細(xì)菌具有高度的殺菌性。乳鏈菌肽對(duì)腸球菌包括對(duì)萬古霉素耐藥的菌株具有殺菌性是意料之外的，因?yàn)槟c球菌對(duì)大多數(shù)抗菌藥物的殺菌活性具有耐受性。
實(shí)施例2.乳鏈菌肽對(duì)于對(duì)多藥耐藥的病原體的殺菌活性的測定在其它實(shí)驗(yàn)中，實(shí)施例1的結(jié)果得到了證實(shí)并被擴(kuò)展，在這些實(shí)驗(yàn)中，大量葡萄球菌和腸球菌的對(duì)多藥耐藥的臨床分離株以及對(duì)多藥耐藥的肺炎球菌與一定濃度的乳鏈菌肽接觸20分鐘至240分鐘。在以上短時(shí)間接觸后，測定兩項(xiàng)參數(shù)細(xì)胞存活率(測定一個(gè)實(shí)驗(yàn)組的)和細(xì)胞裂解率(測定兩實(shí)驗(yàn)組的)。如表2所示，根據(jù)培養(yǎng)物在600nm處的濁度降低測得，大多數(shù)分離株的裂解率大于50％；其余許多菌株表現(xiàn)出可測出但低于50％的裂解。此外，還如表2所示測定了乳鏈菌肽處理的分離株的存活率。我們觀察到，活菌計(jì)數(shù)的下降百分比超過了濁度的下降百分比。某些分離株的濁度顯示出較小的降低，但顯示出存活率的明顯下降。所以，乳鏈菌肽對(duì)這些細(xì)菌的殺菌作用不需要細(xì)胞的裂解，而細(xì)胞裂解被認(rèn)為在細(xì)菌對(duì)藥物反應(yīng)的后期發(fā)生。在較短的實(shí)驗(yàn)接觸時(shí)間內(nèi)，除兩種分離株(兩種都是與低濃度短暫接觸的肺炎鏈球菌)之外，其余都被大量殺滅。乳鏈菌肽對(duì)全部腸球菌分離株的快速殺菌作用(4小時(shí)內(nèi)大于或等于99％)實(shí)際上是一個(gè)值得注意的對(duì)此類微生物的作用。
實(shí)施例3.乳鏈菌肽對(duì)小鼠金黃色葡萄球菌腹腔感染的效果在小鼠感染模型中測定乳鏈菌肽的抗感染效果。在此模型中，腹腔內(nèi)感染造成未治療動(dòng)物在感染后18小時(shí)內(nèi)死亡。如表3所示，5個(gè)未治療動(dòng)物都死亡，而用10mg/kg乳鏈菌肽靜脈注射治療的5個(gè)被感染動(dòng)物都在感染后存活。該結(jié)果表明乳鏈菌肽在治療感染方面具有潛在效果。
表1乳鏈菌肽抗目前包括對(duì)多藥耐藥的病原菌的活性
表2.乳鏈菌肽對(duì)多藥耐藥的臨床分離株的裂解和快速殺菌作用
表3在小鼠中靜脈給藥的乳鏈菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌感染的效果
未治療的小鼠在18小時(shí)內(nèi)死亡。
權(quán)利要求
1.一種殺滅在人和動(dòng)物中引起疾病的對(duì)抗生素耐藥的病原細(xì)菌的方法，它包括給予超過其最低抑菌濃度的羊毛硫抗生素類抗微生物劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的羊毛硫抗生素選自乳鏈菌肽、枯草菌素、表皮素、gallidermin、pep5、肉桂霉素、耐久霉素和血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中的羊毛硫抗生素是乳鏈菌肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的羊毛硫抗生素是由位點(diǎn)特異性誘變產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變體或半合成類似物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的病原細(xì)菌是選自葡萄球菌、鏈球菌和腸球菌屬的對(duì)抗生素耐藥的菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及殺滅使人和動(dòng)物致病的對(duì)抗生素耐藥的病原細(xì)菌的方法。該方法使用羊毛硫抗生素(lanthocin)例如乳鏈菌肽作為殺菌劑。
文檔編號(hào)A61K38/16GK1188415SQ96194940
公開日1998年7月22日 申請(qǐng)日期1996年6月21日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月23日
發(fā)明者P·布萊克本, B·P·戈?duì)柎奶?申請(qǐng)人:Ambi股份有限公司