專利名稱：：酰化化合物脫酰用的選擇性方法
技術領域：
：本發(fā)明提出對從發(fā)酵液中回收洛伐他汀、康派定(compactin)或普伐地汀的改進。洛伐他汀是作為各類微生物如土曲霉(Aspergillusterreus)(US4231938)或紅色紅曲(Monascusruber)(US4323648)的次生代謝物而產(chǎn)生的。在發(fā)酵過程中還生成與洛伐他汀有關的副產(chǎn)物如4-乙酰基洛伐他汀?？捎貌煌椒◤陌l(fā)酵液中分離通常是酸的形式的洛伐他汀。第一步是通過純化而得粗結晶物，這些粗結晶物中仍含有如4-乙?；宸ニ〉南嚓P化合物。由于洛伐他汀屬于必須符合高的純度要求的藥物化合物，所以有必要進一步純化以除去洛伐他汀的相關雜質。該類與洛伐他汀相關的雜質一般是通過多次重結晶、通過如US專利4231938中所述的柱色譜法或制備HPLC法(WO92/16276)而得以除去的，其產(chǎn)率會顯著降低。采用本發(fā)明的方法可除去發(fā)酵液濾液中存在的雜質，這樣就避免通過額外的重結晶來除雜質，因而導致產(chǎn)率的提高。在將本發(fā)明的方法應用于由微生物如土曲霉生產(chǎn)抑制素的發(fā)酵液濾液時，令人驚奇的是4-乙?；宸ニ”贿x擇性地轉化為洛伐他汀而不象純的4-乙?；宸ニ∧菢油ㄟ^脫水作用而轉變?yōu)槊摎渎宸ニ?參見圖1)。另一個驚人的現(xiàn)象是在實施本發(fā)明時那個2-甲基丁酸酯基未被除去?，F(xiàn)有技術中既未述及亦未暗示本發(fā)明的方法。附圖簡述圖1是4-乙酰基洛伐他汀酸的脫?；兂陕宸ニ∷?a)及4-乙酰基洛伐他汀酸的脫水而變成脫氫洛伐他汀酸(b)的反應圖解。圖2顯示應用本發(fā)明的方法后使粗的洛伐他汀結晶物中雜質降低的薄層色譜(TLC)。洗脫液氯仿/甲醇＝9/1；檢測碘染色；一批產(chǎn)品2μl的溶液，是粗的洛伐他汀結晶物的甲苯溶液，濃度為50g/l。右邊得自未處理的發(fā)酵液濾液的粗結晶物；左邊得自已在50℃及pH12.5下攪拌2小時后的發(fā)酵液濾液的粗結晶物。本發(fā)明涉及改進從發(fā)酵液濾液中回收洛伐他汀、普伐他汀或康派定的方法，該方法包括-在培養(yǎng)液中生長微生物，該微生物能產(chǎn)生洛伐他汀、康派定或普伐他汀這類物質，得到一種產(chǎn)物培養(yǎng)液，-從產(chǎn)物培養(yǎng)液中除去生物量而得到澄清的發(fā)酵液濾液，-分別分離純化了的洛伐他汀、康派定或普伐他汀，其特點在于將澄清的發(fā)酵液濾液的pH值調節(jié)至高于約pH10。所述方法最好還包括將澄清的發(fā)酵液濾液加熱到高于約50℃。本發(fā)明的方法提出了在發(fā)酵液濾液中使4-?；囊种扑孛擋５暮啽愕?、選擇性方法，導致結晶物的產(chǎn)率及純度的改善。在高pH值下的處理中，4-?；囊种扑乇晦D變成相應的抑制素。轉化速率、例如在發(fā)酵液濾液中4-乙酰基洛伐他汀轉化為洛伐他汀的轉化速率依賴于pH值及反應溫度。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，該處理過程是在pH值高于pH＝10、最好是在pH＝10及pH＝13之間、最優(yōu)選是在pH＝11及pH＝12.5之間實施。而60℃-95℃之間的溫度是優(yōu)選的。采用更高的pH值及/或更高的溫度，則完成脫酰的反應時間縮短了。提高pH值的方法應用于可生產(chǎn)洛伐他汀、普伐他汀或康派定的任何微生物的發(fā)酵液濾液都會有益?？缮a(chǎn)抑制素的微生物可以是下列菌種之一青霉屬(Penicillium)、菌寄生屬(Hypomyces)、擬青霉屬(Paecilomyces)、正青霉屬(Eupenicillium)、木霉菌屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)、紅曲霉(Monascus)、莖點霉屬(Phoma)、Doratomyces、裸囊菌屬(Gymnoascus)或北風菌(Pleurotus)。由這些微生物發(fā)酵生產(chǎn)抑制素象生產(chǎn)其它發(fā)酵產(chǎn)品那樣在水介質中實施。這種介質中含可被微生物同化的碳源、氮源及無機鹽。一般地，如糖類的碳水化合物例如葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、甘露醇等等以及如谷類的淀粉例如燕麥、黑麥、玉米淀粉、玉米粉等等可單獨地或者結合地用作營養(yǎng)培養(yǎng)基中可同化的碳源。這些碳源可以單獨用，也可將數(shù)種上述碳源結合用于培養(yǎng)基中。通常地，許多蛋白質類原料可用作發(fā)酵工藝中的氮源。合適的氮源例如包括酵母水解物、初生酵母、酵母膏、大豆粉、棉籽餅粉、酪蛋白的水解物、玉米漿、酒糟廢液或蕃茄醬等等。這些氮源可單獨用，也可結合用。可摻入培養(yǎng)基的營養(yǎng)無機鹽是能產(chǎn)生鈉、鉀、銨、鈣、磷酸根、硫酸根、氯離子、碳酸根等離子的常用鹽。還包括痕量金屬如鈷、錳、鐵及鎂。應注意的是實施例中所述的培養(yǎng)基僅僅是舉例說明可運用的品種繁多的培養(yǎng)基，而不是限制性的。確切地說，應用于生產(chǎn)洛伐他汀的培養(yǎng)基中的碳源包括右旋糖、糊精、葡萄糖、蔗糖、燕麥粉、燕麥片、廢糖蜜、檸檬酸鹽、醋酸鹽、大豆油、甘油、麥芽浸出汁、鱈血肝油、淀粉、乙醇、無花果、抗壞血酸鹽、及豬脂油。氮源包括胨化乳、自溶酵母、酵母膏、酵母RNA、蕃茄醬、酪蛋白、初生酵母、花生餅粉、酒糟廢液、玉米漿、大豆粉、玉米粉、NZ胺、牛肉浸膏、天門冬酰胺、棉籽餅粉、氨及硫酸銨。還可加入較多的離子組分CaCO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O和NaCl，少量的CoCl2·6H2O以及痕量的Fe、Mn、Mo、B和Cu。營養(yǎng)物可以加入分批的培養(yǎng)基中，也可在發(fā)酵期間(部分地)投入。本發(fā)明的方法可被直接運用于除去生物量之后、而進一步純化之前的發(fā)酵液。例如，堿土金屬氫氧化物或氫氧化銨的水溶液適合用于這樣的反應。在高的pH值及最好是高溫下處理發(fā)酵液濾液。而且，在高pH值下的處理時，發(fā)酵液濾液中存在的蛋白質都被變性，有利于在后續(xù)的反應步驟中將其從產(chǎn)物中除去。進一步的純化步驟包括提取、吸附到疏水性樹脂上、離子交換、柱色譜等等。下述實施例將以舉例的方式而不是以限制的方式闡述本發(fā)明。實施例II-IV是在氮氣氣氛中實施的。實施例實施例I利用土曲霉菌株AD43的發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他汀土曲霉菌株AD43，theCentraelBureauvoorSchimmelcultures(CBS，Delft，TheNetherlands)的保藏號為28373，并獲得CBS編號CBS456.95。在無菌條件下開啟貯存于-80℃的甘油中的、裝有土曲霉菌株AD43的孢子懸浮液的1ml小瓶，使其中的物質懸浮于含500ml下列培養(yǎng)基的2升搖瓶中(在121℃的高壓滅菌器中加熱20分鐘)成分每kg的用量一水合葡萄糖10g燕麥片10g蕃茄醬40g玉米浸泡液的固形物5g痕量元素1g痕量元素溶液的組成(每100ml的蒸餾水中)FeSO4·7H2O1g；MnSO4·1H2O1g；CuCl2·2H2O0.025g；CaCl2·2H2O0.1g，H3BO40.056g；(NH4)6Mo7O24·4H2O0.019g；ZnSO4·7H2O0.2g。將搖瓶置于轉速為280rpm(擺幅為3.5cm)的旋轉式搖床中于28℃下保溫24小時。然后從搖瓶中取出20ml發(fā)酵液(用100ml生理鹽水稀釋)接種于裝有10kg發(fā)酵液的發(fā)酵罐中，該發(fā)酵液的組成如下成分每kg的含量一水合葡萄糖20g酵母膏33g聚丙二醇20002.5ml葡萄糖及酵母膏/聚丙二醇溶液已被分別滅菌(在121℃下滅菌20分鐘)。發(fā)酵條件如下用H2SO4和NaOH將pH值保持恒定于6.5，溫度為28℃空氣進入量為1vvm一旦葡萄糖消耗完，就開始按每小時每kg發(fā)酵液中加入1.2g葡萄糖的進料比率投入葡萄糖/酵母膏的補料，補料的組成如下成分每kg的含量一水合葡萄糖500g酵母膏17g聚丙二醇200014ml發(fā)酵192小時之后用NaOH將發(fā)酵液的pH提高到pH＝10，且用4升水稀釋發(fā)酵液。該發(fā)酵在稀釋前的每升發(fā)酵液中產(chǎn)生385mg洛伐他汀酸。稀釋后測得洛伐他汀酸含量為411mg/l。實施例II發(fā)酵液濾液的熱處理對洛伐他汀結晶物純度的影響在25℃下用2NNaOH將1000ml菌株AD43的發(fā)酵液濾液(洛伐他汀酸濃度為0.4g/l，按實施例I的方法生產(chǎn))的pH值調到12.5，接著將溫度升至50℃達2小時。2小時后，結束反應，將反應混合液冷卻至室溫。然后用硫酸將其pH降至pH＝4，再加入3000ml甲苯，并攪拌30分鐘。將甲苯層與水層分開，然后在40℃及真空下蒸發(fā)將甲苯層濃縮至80ml。將上述提取液加熱至90℃達3小時使其中的洛伐他汀酸轉化為內酯(轉化率為99.2％)。冷卻至室溫后，將該甲苯溶液與80ml水混合，并用NaOH將其pH調至pH＝10。分層后，再用80ml新鮮水與甲苯層混合，且用硫酸將pH調至pH＝4。分層后，用0.1g活性炭NoritSXultra處理甲苯層；接著將甲苯溶液過濾，并蒸發(fā)而進一步濃縮至15ml。冷卻至-10℃使之產(chǎn)生結晶。用5ml冷甲苯洗滌結晶物，再在室溫下真空干燥。用TLC及質子NMR均未從這些結晶物中檢出4-乙?；宸ニ　７粗?，從按上述方法、但未于pH＝12下對發(fā)酵液濾液進行熱處理制得的發(fā)酵液中獲得的結晶物，用TLC的確測定出含4-乙?；宸ニ?參見圖2)。質子NMR分析表明這些結晶物中存在1.1％的4-乙?；宸ニ?。實施例III比較發(fā)酵液濾液的不同熱處理條件對洛伐他汀結晶物純度的影響如表1中所示，在不同的pH值、溫度及不同的處理時間下處理各部分發(fā)酵液濾液。對于每組參數(shù)，各用到1000ml菌株AD43的發(fā)酵液濾液(洛伐他汀酸濃度為0.4g/l)。處理后，用硫酸將濾液的pH值調至pH＝4，并使濾液與1000ml甲苯混合，達30分鐘。接著使之分層，然后將甲苯層蒸發(fā)濃縮至體積為80ml，并在90℃下保持3小時。冷卻至室溫后，將該甲苯溶液與40ml水混合，并用NaOH將其pH調至pH＝10。分層后，再用40ml水與甲苯層混合，并用硫酸將其pH調至pH＝4。分層后，往甲苯溶液中加入0.1g活性炭NoritSXUltra。將該甲苯溶液過濾脫除活性炭，接著蒸發(fā)濃縮至15ml。冷卻至-10℃使之產(chǎn)生結晶。過濾出結晶物并用5ml冷甲苯洗滌，然后在室溫下真空干燥。用TCL對結晶物進行定量分析(Mercksilicagel60F，d＝0.25mm，art.nr.5715；流動相是比率為30/1的氯仿/甲醇)，用UV在254nm處測定(對0.1mg產(chǎn)品試樣的檢測靈敏度為0.3％)，并用碘染色法檢測(對0.1mg的產(chǎn)品試樣檢測靈敏度為0.1％)。將這些處理的測定結果列于表1。表1.不同的熱處理參數(shù)對洛伐他汀結晶物純度的影響。采用TLC進行定性分析并用UV檢測(對0.1mg產(chǎn)品試樣的檢測靈敏度為0.3％)及碘染色法檢測(對0.1mg產(chǎn)品試樣的檢測靈敏度為0.1％)</tables>-未檢出o弱光點+可檢測到實施例IV在高pH的水溶液中熱處理時純化合物4-乙?；宸ニ〉姆磻?a)4-乙?；宸ニ〉闹苽湓诘獨獗Ｗo下，將乙酸酐(7ml，0.073mol)一次性加入純洛伐他汀(25g，0.062mol)及4-二甲氨基吡啶(1.53g，0.013mol，20％)的無水吡啶(120ml，0℃)溶液。將上述混合液在0℃下攪拌6小時。對反應混合物的TLC分析(參見實施例3中對該方法的說明)表明所有的洛伐他汀都已消失，可能變成了4-乙?；宸ニ?。接著蒸發(fā)除去吡啶并加入乙酸乙酯(240ml)。用240mlNaCl飽和溶液洗滌上述溶液。分層，用無水硫酸鎂干燥有機層，再將有機層過濾，然后蒸發(fā)掉乙酸乙酯，得淺黃色油狀物。質子NMR檢定該油狀物是1/1混合的4-乙酰基洛伐他汀及脫氫洛伐他汀混合物。在氮氣中貯存的4-乙?；宸ニ★@得不穩(wěn)定，并發(fā)生由4-乙酰基洛伐他汀到脫氫洛伐他汀的進一步轉化。(b)色譜法對4-乙?；宸ニ〉募兓瘜?g1/1混合的4-乙?；宸ニ『兔摎渎宸ニ∪苡?ml的氯仿/甲醇(40/1)。然后用120g硅膠(Baker533)將此溶液吸收，反過來在壓力(0.3巴)下用氯仿/甲醇(比率為40/1)的混合液將其展開。收集4個級分，其中蒸發(fā)脫除了溶劑。第3個級分中含4-乙?；宸ニ〖昂哿康拿摎渎宸ニ?0.28g)，而第4個級分中只含4-乙?；宸ニ?0.3g)。(c)4-乙?；宸ニ≡诟遬H及較高溫度的水溶液中的反應將0.3g4-乙?；宸ニ?實施例IVb中的第4個級分)溶于2mlN，N-二甲基甲酰胺(DMF，Merck)及98ml軟化水的混合液，用NaOH將其pH調至12.5，然后在60℃下攪拌此溶液1小時。接著將該反應混合液冷卻至室溫，再用硫酸將其pH調至pH＝4，并用60ml甲苯與此水溶液混合達0.5小時以提取反應產(chǎn)物。待分層后，將甲苯溶液在90℃下加熱達6小時；然后蒸發(fā)除去甲苯，得少量產(chǎn)物。用質子NMR鑒定該產(chǎn)物主要是脫氫洛伐他汀，但其中一點也不合洛伐他汀。BUDAPESTTREATYONTHEINTERNATIONALRECOGNITIONOFTHEDEPOSITOFMICRCORCANISMSFORTHEPURPOSESOFPATENTPROCEDUREINTERNATIONALFORM<thedateoftheoriginaldepositor.whereanewdepositoratransferhasbeenmade，themostrecentrelevantdate(dateofthenewdepositordateofthetransfer).2InthecasesreferredtoinRule10.2(a)(ii)and(iii)，refertothemostrecontviabilitytest.3Markwitnacrosstheapplicablebox.4Filliniftheinformationhasbeenrequestedandiftheresultsofthetestwerenegative.BUDAPESTTREATYONTHEINTERNATIONALRECOGNITIONOFTHEDEPOSITOFMICROORGANISMSFORTHEPURPOSESOFPATENTPROCEDUREINTERNATIONALFORMRECEIPTINTHECASEOFANORIGINALDEPOSTTissuedpursuanttoRule7.1bytheINTERNATIQNALDEPOSITARYAUTHORTTYidentifiedatthebottcmofthispage1WhereRule6.4(d)applies，suthdateisthedateonwhichthestatusofinternationaldepositaryauthoritywasacquired.權利要求1.改進從發(fā)酵液濾液中回收洛伐他汀、普伐他汀或康派定的方法，它包括-在培養(yǎng)液中生長微生物，該微生物能產(chǎn)生洛伐他汀、康派定或普伐他汀這類物質，得到一種產(chǎn)物培養(yǎng)液，-從產(chǎn)物培養(yǎng)液中除去生物量而得到澄清的發(fā)酵液濾液，-分別分離純化了的洛伐他汀、康派定或普伐他汀，其特點在于將澄清的發(fā)酵液濾液的pH調節(jié)至高于約pH10。2.按權利要求1的方法，其中的pH在pH＝10和pH＝13之間。3.按權利要求2的方法，其中的pH在pH＝11和pH＝12.5之間。4.按權利要求1-3中任一項的方法，其特點在于將發(fā)酵液濾液加熱至高于約50℃。5.按權利要求4的方法，其中的溫度在60-90℃之間。全文摘要本發(fā)明提出了從發(fā)酵液生產(chǎn)抑制素時使4-?；囊种扑孛擋５暮啽愕倪x擇性方法，更確切地說，通過提高發(fā)酵液的pH值而減少該方法中的雜質。文檔編號A61K35/74GK1164851SQ96191024公開日1997年11月12日申請日期1996年8月5日優(yōu)先權日1995年8月3日發(fā)明者R·M·德·佩特,M·西賓申請人:吉斯特·布羅卡迪斯股份有限公司