專利名稱::液態(tài)免疫球蛋白制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及穩(wěn)定的免疫球蛋白制劑。已知有許多從人的血漿部分生產(chǎn)免疫球蛋白制劑,特別是生產(chǎn)靜脈注射型IgG(iv-IgG)的方法。為了使產(chǎn)品能用于靜脈注射,必須消除或避免凝聚物的生成,這些凝聚物具有抗補體活性,且如果用于靜脈注射,它們能引起包括過敏性休克在內(nèi)的嚴(yán)重副反應(yīng)??晒┡R床使用的大多數(shù)iv-IgG制劑都是凍干的,以便提高貯存的穩(wěn)定性,但在使用之前,這類制劑必須用稀釋劑例如無菌水或鹽水復(fù)原。其復(fù)原步驟既麻煩又費時,并造成污染產(chǎn)品的可能性。因此能生產(chǎn)以液態(tài)形式(水溶液)貯存和使用、且對貯存有必要穩(wěn)定程度的iv-IgG的藥用組合物是理想的。這類組合物在下文稱作iv-IgG液態(tài)制劑。這類制劑有些在市場上已經(jīng)可以買到。雖然用于靜脈注射的IgG產(chǎn)品只含有非常少量的凝聚物(IgG分子的三聚體或更高的聚合體),但可能含有數(shù)量相當(dāng)大的IgG二聚體,它們可采用例如高壓液體色譜法(HPLC)測定。這些二聚體不會引起過敏性休克,且一般不認(rèn)為它們是個問題。在許多產(chǎn)品說明書中確實都將單體和二聚體均列為例如“功能IgG”類。坦克斯利等人(分子免疫學(xué)25,41-48,1988)發(fā)現(xiàn),對用于制備IgG的混合血漿供血的人數(shù)越多,IgG制劑中的二聚體含量就越高。因此在由單個人的血漿制取的IgG中不可能檢測出二聚體,且在由幾百至幾千名對特定疾病抗原免疫的供血者的血漿制取的超免疫IgG中,二聚體的含量是相當(dāng)?shù)偷?,而在由萬名或萬名以上供血者的混合血漿制取的IgG中,二聚體的含量達(dá)到很高。作者們推斷,該IgG二聚體是遺傳型-抗遺傳型二聚體,它們是在一個供血者的抗體識別出不同供血者抗體中抗原結(jié)合部位并結(jié)合到該部位上生成的。二聚體與單體處在平衡狀態(tài)中,且二聚體的含量隨免疫球蛋白總濃度增高而增加。這些作者們還發(fā)現(xiàn),二聚體的生成隨貯存時間增長而增加,典型制劑的二聚體含量在第一周貯存期間可能增加一倍,此后繼續(xù)緩慢地增加。如果IgG制劑生產(chǎn)后馬上凍干,就可防止二聚體的增加。然而,如果要將制劑以液態(tài)形式貯存和使用,在貯存期間二聚體的濃度將會增加。在除IgG以外的免疫球蛋白例如IgA、IgD和IgE中,也可能生成同類免疫球蛋白的二聚體。此外,在單克隆抗體的制劑中也觀測到二聚體的生成,盡管在單克隆抗體中二聚體生成的機理可能與坦克斯利等人提出的機理不同。本發(fā)明者們現(xiàn)在發(fā)現(xiàn),盡管IgG二聚體與更高級的聚合體不同,它們不會引起過敏性休克,然而,二聚體含量高的IgG制劑,在靜脈注射時耐受性欠佳,且能引起所不希望的副作用,其中包括發(fā)燒,惡心,有時還會使血壓降低。布利克等人(VoxSanguinis52,281-290,1987),在大鼠模型中已檢測出使血壓降低的副作用,這也表明與二聚體的含量有明顯的關(guān)系。因此希望能使免疫球蛋白制劑穩(wěn)定,特別是使iv-IgG液態(tài)制劑穩(wěn)定,不生成二聚體。已經(jīng)使用許多種添加劑來使iv-IgG穩(wěn)定并提高靜脈注射時對它的耐受性。這些添加劑包括甘氨酸;雙糖類,例如麥芽糖和蔗糖;糖醇類,例如山梨醇;聚乙二醇;或少量的表面活性劑,例如PEG-20-山梨糖醇酐-油酸酯或PEG-10-壬氧基酚。不過已經(jīng)發(fā)現(xiàn),在這些常規(guī)穩(wěn)定劑中,沒有一種能在iv-IgG液態(tài)制劑中有效地抑制二聚體的生成。由于二聚體的含量是Ig濃度的函數(shù),通過液態(tài)IgG制劑的稀釋降低二聚體的含量自然是可能的。不過這種方法是不可行的,因為這需要把所不能接受的大量液體輸注入患者體內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明,這個問題是通過向免疫球蛋白配方中加入有效量的兩親性穩(wěn)定劑解決的。根據(jù)本發(fā)明采用的兩親性穩(wěn)定劑,是在分子中含有很強或中等的親水部分以及很強或中等的親脂部分的物質(zhì),但它們不是表面活性劑,即它們在水溶液中在使用濃度下并不形成膠束,而是仍然保持單體的形式。本發(fā)明的兩親性穩(wěn)定劑在分子內(nèi)含有一個或多個選自羧酸基、磺酸基、磷酸基(全部都是游離酸或藥物學(xué)上可接受的鹽形式),酮基、醛基、羥基、氨基或酰胺基的基團;以及一個或多個含3-12個碳原子的,優(yōu)選含4-10個碳原子并可任選地含一個氮原子或一個硫原子的親脂基。這些基團優(yōu)選自直鏈或支鏈烷基、直鏈或支鏈烯烴基以及芳環(huán)、雜芳環(huán)、脂環(huán)或雜脂環(huán)。如果在親脂基中有氮原子存在,則優(yōu)選叔胺型氮原子,例如在吡啶環(huán)中的氮原子型式。優(yōu)選的非環(huán)狀親脂基是含4-10個碳原子的支鏈烷基,優(yōu)選含4-6個碳原子。顯然,用作iv-IgG穩(wěn)定劑的任何化合物,其本身在使用濃度下用于靜脈注射時必須是藥物學(xué)上可接受的。還優(yōu)選在化學(xué)上不使IgG分子發(fā)生變化和在pH4-pH8沒有明顯緩沖能力的穩(wěn)定劑。優(yōu)選的兩親性穩(wěn)定劑是煙酸及其衍生物,例如煙酰胺、煙酰胺N-氧化物和N’-甲基煙酰胺,其中煙酰胺是特別優(yōu)選的。另一類優(yōu)選的兩親性穩(wěn)定劑是天然存在的含不帶電荷親脂性側(cè)鏈的α-氨基酸類,以及這類氨基酸的衍生物,即其中的羧酸基團被式-CONH2、-CONHR、-CH2OH或-COOR的基團所取代,式中R是C1-4烷基。這類氨基酸是苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸和纈氨酸,其中優(yōu)選的是苯丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸和異亮氨酸,特別優(yōu)選的是脯氨酸、亮氨酸和異亮氨酸,更優(yōu)選的是脯氨酸。日本專利公開第61-194035號公開了液態(tài)γ-球蛋白制劑,該制劑在穩(wěn)定劑和輔助穩(wěn)定劑存在下經(jīng)過熱處理,穩(wěn)定劑是單糖、雙糖或糖醇,其用量為10-100g/100ml,輔助穩(wěn)定劑可以是中性氨基酸,例如纈氨酸、亮氮酸或異亮氨酸,或羧酸鹽。本發(fā)明提供一種液態(tài)免疫球蛋白制劑,特別是用于靜脈注射的免疫球蛋白G的液態(tài)制劑,其中含有一種或多種本文規(guī)定的兩親性穩(wěn)定劑,其對每克免疫球蛋白的總用量為至少0.2mmol和總濃度為至少20mmol/l,但條件是如果該制劑含100g/l或更多的單糖、雙糖或糖醇,那么至少有一種兩親性穩(wěn)定劑不是中性氨基酸或羧酸鹽,該穩(wěn)定劑優(yōu)選自煙酸及其衍生物。優(yōu)選的穩(wěn)定劑是含有煙酰胺以及一種和多種上述的兩親性氨基酸或其衍生物的組合物。更優(yōu)選的穩(wěn)定劑組合物包含煙酰胺和脯氨酸,以及任選的一種或多種附加的兩親性氨基酸。特別優(yōu)選的組合物是(a)煙酰胺和脯氨酸的混合物;(b)煙酰胺、脯氨酸和異亮氨酸的混合物;和(c)煙酰胺、脯氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的混合物。在這類組合物中優(yōu)選煙酰胺與總的兩親性氨基酸的摩爾比為1∶1-1∶4。最優(yōu)選的組合物是煙酰胺、脯氨酸和異亮氨酸的混合物,優(yōu)選其摩爾比為1∶(0.8-2.0)∶(0.8-2.0)。根據(jù)本發(fā)明穩(wěn)定的免疫球蛋白可以是IgA、IgD、IgE或IgG的任何制劑,而不論是多克隆的還是單克隆的,是從人或動物的血漿中分離的還是用其它方法例如用雜交瘤技術(shù)或DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的。優(yōu)選從人的血漿提取的IgG制劑,為了用于靜脈注射,該制劑已經(jīng)經(jīng)過處理,并準(zhǔn)備以液態(tài)形式貯存和使用。更優(yōu)選的是尚未被酶切(例如含高濃度的胃蛋白酶)的多價、完整的免疫球蛋白,且它保持著7S-IgG抗體在結(jié)構(gòu)上和功能上的完整性,其中包括完整的Fc片段。優(yōu)選利用改性醇的冷沉淀作用,其中包括在pH4下用低濃度胃蛋白酶處理,從血清部分獲取的免疫球蛋白。液態(tài)制劑的IgG含量優(yōu)選為3%-16%,更優(yōu)選為6%-12%。溶液的pH優(yōu)選為pH4-pH8,更優(yōu)選為pH5-PH6,特別優(yōu)選為pH5.2-pH5.4。在這種偏酸性的pH值下,重要的是溶液具有低的緩沖能力,以防靜脈注射時使受者血液的pH明顯地降低。加入一種或多種非緩沖物質(zhì)例如氯化鈉、甘氨酸、蔗糖、麥芽糖和山梨醇,可將溶液的滲透性調(diào)節(jié)到生理值。這些液態(tài)制劑靜脈輸注的用藥量,例如每天每kg體重的劑量為0.2-1.0gIgG。本發(fā)明組合物中兩親性穩(wěn)定劑的量優(yōu)選為0.2-6mmol/gIgG,更優(yōu)選為1-3mmol/gIgG。免疫球蛋白制劑也可含有其它蛋白質(zhì),例如白蛋白。本發(fā)明的含有兩親性穩(wěn)定劑的iv-IgG液態(tài)制劑在溫度2°-25℃下可貯存最長達(dá)二年之久,而二聚體的含量并沒有增高到不能接受的程度,這類制劑在靜脈注射時耐受性好。準(zhǔn)備凍干且以凍干的固態(tài)形式銷售的iv-IgG溶液也可以根據(jù)本發(fā)明通過加兩親性穩(wěn)定劑使其穩(wěn)定,以便減少在制備和凍干期間二聚體的生成。以下述實施例說明本發(fā)明A.液態(tài)iv-IgG制劑的制備方法將由混合的人血漿的醇分級分離獲得的IgG粗糊劑在4℃下溶于無菌水中并過濾。將溶液酸化到pH4,并在pH4、37℃下用少量的胃蛋白酶培養(yǎng),然后中和。接著將產(chǎn)品透析過濾除去任何殘留的醇,隨后將pH調(diào)節(jié)到pH5.3并用超濾濃縮該溶液,所得成品的蛋白質(zhì)濃度為6%-15%(w/v)。這種產(chǎn)品也可按照瑞士專利第684164號所述的方法制備。B.二聚體含量的測定這種產(chǎn)品是采用在HewlettPackardHP1090上的HPLC分析的,所用TSKG3000SW-XL柱的尺寸為7.8×300mm,流動相為pH7.0的0.04M磷酸鹽緩沖劑和0.2M氯化鈉溶液。流速為0.7ml/min。取1.3μl的150mg/ml溶液作為樣品,且通過在280nm下的紫外(UV)吸收檢測蛋白質(zhì)。自動測定與凝聚物(典型的保留時間8-9分鐘)、二聚體(9-10.5分鐘)和單體(10.5-13.5分鐘)相應(yīng)的峰面積,并由下式求得二聚體的含量D%=ADAA+AD+AM×100]]>式中AA、AD和AM分別是凝聚物、二聚體和單體峰的面積。C.穩(wěn)定性試驗將液態(tài)的iv-IgG制劑在密封的容器中于環(huán)境溫度(20-25℃)下貯存80-90天,在貯存期結(jié)束時測定二聚體的含量。實施例1按上述A的方法制備1L標(biāo)準(zhǔn)的液態(tài)制劑,其蛋白質(zhì)含量為15%,pH為5.3,向該溶液中加入24.75g苯丙氨酸(150mmol/L,1mmol/g蛋白質(zhì))。根據(jù)本發(fā)明的實施例1和附加實施例2-16,以及不含任何添加劑或只含甘氨酸的對比例A-G的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)示于下表1及表2。下表3示出將含蛋白質(zhì)均為12%的四種液態(tài)制劑在室溫下貯存后,以布利克等人(VoxSanguinis52,281-290,1987)所述的方法,用大鼠低血壓模型的試驗結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明的制劑(實施例17-19)只使血壓下降5%-18%,而未經(jīng)穩(wěn)定的制劑卻使血壓下降近50%。表1在貯存80天后二聚體的含量<p>表2在貯存90天后二聚體的含量<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="847">實施例添加劑添加劑濃度(mmol/L)蛋白質(zhì)濃度(%w/v)二聚體含量C無--1518.0%D甘氨酸3001517.4%8甘氨酸苯丙氨酸2001401512.6%9甘氨酸煙酰胺2001501510.7%E無--611.4%F甘氨酸300611.2%10甘氨酸苯丙氨酸3006069.3%11甘氨酸煙酰胺3006068.7%12蛋氨酸亮氨酸606069.8%G無--1217.5%13脯氨酸煙酰胺2001001210.6%14脯氨酸亮氨酸異亮氨酸煙酰胺10060601001210.0%15脯氨酸亮氨酸異亮氨酸煙酰胺1208080801210.1%16脯氨酸異亮氨酸煙酰胺甘氨酸1001201004012僅70天9.4%</table></tables>表3二聚體含量和在大鼠模型中的血壓下降</tables>權(quán)利要求1.一種含一種或多種非表面活性劑的兩親性穩(wěn)定劑的液態(tài)免疫球蛋白制劑,該穩(wěn)定劑的特征在于它們在分子內(nèi)含有一個或多個選自羧酸基、磺酸基、磷酸基、酮基、醛基、羥基、氨基或酰胺基的基團;以及一個或多個含有3-12個碳原子和可任選的一個氮原子或一個硫原子的親脂基,對每克免疫球蛋白的總用量為至少0.2mmol,其總濃度至少為20mmol/l,但條件是如果該制劑含100g/l或更多的單糖、雙糖或糖醇,那么至少一種兩親性穩(wěn)定劑不是中性氨基酸或羧酸鹽。2.根據(jù)權(quán)利要求1的制劑,其中在任一兩親性穩(wěn)定劑的親脂基中的任何氮原子都是叔胺型的。3.根據(jù)權(quán)利要求1的制劑,該制劑是用于靜脈注射的免疫球蛋白G的液態(tài)制劑。4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的制劑,其中含有用作兩親性穩(wěn)定劑的煙酸或其衍生物。5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的制劑,其中至少一種兩親性穩(wěn)定劑選自苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、纈氨酸或它們的任何一種的衍生物,衍生物中的羧酸基被式-CONH2、-CONHR、-CH2OH或-COOR基團所取代,式中R為C1-4烷基。6.根據(jù)權(quán)利要求5的制劑,其中至少一種兩親性穩(wěn)定劑選自脯氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。7.根據(jù)權(quán)利要求6的制劑,其中含有脯氨酸和煙酰胺。8.根據(jù)權(quán)利要求7的制劑,其中含有煙酰胺、脯氨酸和異亮氨酸作為僅有的兩親性穩(wěn)定劑。9.根據(jù)權(quán)利要求3-8中任一項的液態(tài)制劑,其pH為pH5-pH6。10.一種使iv-IgG的液態(tài)制劑穩(wěn)定而在溫度2℃-25℃下貯存時不生成二聚體的方法,其中包括將至少20mmol/l的一種或多種非表面活性劑的兩親性穩(wěn)定劑加入該制劑的步驟,該穩(wěn)定劑的特征在于它們在分子內(nèi)含有一個或多個選自羧酸基、磺酸基、酮基、醛基、羥基、氨基或酰胺基的基團;以及一個和多個含有3-12個碳原子和可任選的一個氮原子或一個硫原子的親脂基,對每克免疫球蛋白的總用量至少為0.2mmol。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法,其中的制劑不經(jīng)過溫度高于50℃的任何熱處理步驟。12.一種制備二聚體含量低的凍干的iv-IgG制劑的方法,其中包括將采用權(quán)利要求10或11的方法穩(wěn)定的液態(tài)制劑凍干的步驟。全文摘要加入一種或多種兩親性穩(wěn)定劑能使免疫球蛋白制劑,特別是用于靜脈輸注的免疫球蛋白G的液態(tài)制劑穩(wěn)定,不生成二聚體。優(yōu)選的兩親性穩(wěn)定劑是煙酸的衍生物,特別是煙酰胺和天然存在的具有親脂側(cè)鏈的α-氨基酸類,例如苯丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。文檔編號A61K47/22GK1157572SQ95194957公開日1997年8月20日申請日期1995年9月7日優(yōu)先權(quán)日1994年9月8日發(fā)明者R·布呂格爾,K·真納利,G·豪德勒,B·維斯特申請人:紅十字基金會輸血服務(wù)中央實驗室