專利名稱：制備氣體填充的脂質(zhì)體的方法
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背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及制備氣體填充的脂質(zhì)體的新方法和設(shè)備。經(jīng)這些方法制備的脂質(zhì)體特別有用，例如用于超聲顯像及治療傳送系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
各種各樣的顯像技術(shù)已用于檢測(cè)和診斷動(dòng)物和人的疾病。X-射線是用于診斷顯像的首要技術(shù)之一。通過(guò)此技術(shù)獲得的影像反映了被顯像物體的電子密度。過(guò)去造影劑，如鋇或碘已用于增強(qiáng)或阻斷X-射線，由此增加不同結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度。然而，已知X-射線有一定的危害性，因?yàn)橛糜赬-射線的輻射正在電離，電離輻射的不同危害作用是可以累積的。
另一重要的顯像技術(shù)是磁共振顯像(MRI)。然而，此技術(shù)有許多的缺陷，例如費(fèi)用和不便于移動(dòng)檢查。此外，在許多醫(yī)療中心，MRI不適用。
用于核醫(yī)學(xué)的放射性核素，提供了另一種顯像技術(shù)。用此技術(shù)，核素，如锝標(biāo)記的化合物，給患者注射，用γ照相機(jī)獲取影像。然而，核醫(yī)學(xué)技術(shù)不能看到立體圖像并使動(dòng)物或患者遭受輻射的不良作用。而且核素的操作與處理也成問(wèn)題。
超聲是另一種用于診斷的影像技術(shù)，它不象核醫(yī)學(xué)和X-射線，因?yàn)樗皇够颊弑┞队陔婋x輻射的有害作用之下。而且不象磁共振顯像，超聲相對(duì)廉價(jià)并能移動(dòng)檢查。使用超聲技術(shù)，通過(guò)傳感器使聲傳送進(jìn)患者或動(dòng)物體內(nèi)。當(dāng)聲波在體內(nèi)傳播時(shí)，在組織和組織液的界面間相遇。超聲波依賴體內(nèi)組織和組織液的聲學(xué)特性，部分或全部反射或吸收。當(dāng)聲波通過(guò)界面反射時(shí)，通過(guò)傳感器的接收器測(cè)定和處理，形成影像。體內(nèi)組織和組織液的聲學(xué)特性確定了在所形成的顯像中出現(xiàn)的對(duì)比。
近年來(lái)，超聲技術(shù)取得了進(jìn)步。然而，盡管有這些不同的技術(shù)進(jìn)展，超聲在許多方面仍然是不完美的工具，特別是關(guān)于肝和脾、腎、心血管疾病的顯像和檢測(cè)，包括測(cè)定血流。檢測(cè)這些區(qū)域的能力依賴于組織或組織液與周?chē)M織或組織液之間聲學(xué)特性的差別。結(jié)果，尋求到了造影劑，它能增加組織或組織液與周?chē)M織或組織液之間的聲學(xué)差別，以改善超聲顯像和疾病檢測(cè)。
超聲顯像形成的理論基礎(chǔ)指導(dǎo)研究者們尋覓氣體造影劑。在密度或聲阻抗大大不同的不同物質(zhì)的界面對(duì)聲學(xué)特性或聲阻抗的改變最重要，特別是固體、液體和氣體之間的界面。當(dāng)超聲波和這些界面相遇時(shí)，聲學(xué)阻抗的改變產(chǎn)生更強(qiáng)的聲波反射和超聲顯像中更強(qiáng)的信號(hào)。影響聲效率或反射的另一個(gè)因素是反射界面的彈性。這種界面的彈性越大，聲反射就越有效。如氣泡物可出現(xiàn)高彈性界面。這樣，作為上述原理的結(jié)果，研究者們著重于根據(jù)氣泡或含氣體超聲造影劑的開(kāi)發(fā)及其制備的有效方法的開(kāi)發(fā)。
另一個(gè)致力于重要研究的領(lǐng)域是靶藥物傳遞領(lǐng)域。當(dāng)某處毒性成問(wèn)題時(shí)，靶傳遞工具特別重要。特異的治療傳遞方法潛在地用于降低毒副作用、降低要求的劑量、降低患者的花費(fèi)。
在現(xiàn)有技術(shù)中將遺傳物質(zhì)，例如，導(dǎo)入活細(xì)胞，其方法和物質(zhì)是有限和無(wú)效的。目前已開(kāi)發(fā)了幾種不同的機(jī)制，使遺傳物質(zhì)傳遞給活細(xì)胞。這些機(jī)制包括磷酸鈣沉淀和電穿孔，如以陽(yáng)離子聚合物及水填充的脂質(zhì)體為載體的技術(shù)。所有這些方法都在體內(nèi)相當(dāng)無(wú)效及只限于使用在細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染。這些方法沒(méi)有一個(gè)有利于定位釋放、傳遞和使遺傳物質(zhì)整合于靶細(xì)胞。
用于治療藥物，如遺傳物質(zhì)傳遞的最好方法是治療各種各樣的人和動(dòng)物疾患。特征的遺傳病和在可理解的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄方面，已取得了很大進(jìn)步，但在傳遞遺傳物質(zhì)給細(xì)胞治療人和動(dòng)物疾病方面進(jìn)展相當(dāng)小。
主要的困難是從細(xì)胞外空間進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)空間傳遞遺傳物質(zhì)或甚至有效地使遺傳物質(zhì)定位在選擇的細(xì)胞膜表面。在體內(nèi)已嘗試了不同的技術(shù)，但沒(méi)有大的成功。例如病毒，象腺病毒與逆轉(zhuǎn)錄病毒，已用作載體，轉(zhuǎn)送遺傳物質(zhì)給細(xì)胞。使用了整個(gè)病毒，但置于病毒囊內(nèi)的遺傳物質(zhì)的量有限。并且有由活病毒引起的相關(guān)的危險(xiǎn)的相互作用?？煞蛛x病毒囊中的必要成分，用于攜帶遺傳物質(zhì)給所選擇的細(xì)胞。然而，在體內(nèi)，傳遞載體不但必須識(shí)別某種細(xì)胞，而且必須傳遞進(jìn)這些細(xì)胞。盡管在病毒載體方面做了大量工作，但是為在體內(nèi)傳遞遺傳物質(zhì)開(kāi)發(fā)一種成功靶定位的病毒介導(dǎo)載體是困難的。
在細(xì)胞培養(yǎng)中，常規(guī)的含液體的脂質(zhì)體已用于傳遞遺傳物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，但是體內(nèi)遺傳物質(zhì)的細(xì)胞傳遞基本無(wú)效。例如體內(nèi)陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)不能有效地實(shí)施。需要的更有效的方法是改善治療藥物，如遺傳物質(zhì)的細(xì)胞傳遞。
本發(fā)明主要涉及上述及用于超聲顯像造影劑及用于治療藥物的有效靶定位傳遞載體領(lǐng)域的別的重要要求。
發(fā)明概要本發(fā)明提供了用于超聲顯像造影劑或作為藥物傳遞劑的氣體填充的脂質(zhì)體的制備方法與設(shè)備。本發(fā)明的方法益處是，例如，氣體填充的脂質(zhì)體的制造過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低。
制備氣體填充的脂質(zhì)體的優(yōu)選方法包括在有氣體存在時(shí)，在低于類(lèi)脂從凝膠狀態(tài)向液晶狀態(tài)相轉(zhuǎn)變溫度下振蕩含類(lèi)脂的水溶液。
出乎意料，根據(jù)本發(fā)明方法制備的氣體填充的脂質(zhì)體具有許多驚人的高效性。例如，氣體填充的脂質(zhì)體由于其生物相容性及易于同脂溶性化合物在脂質(zhì)體破裂后穿過(guò)細(xì)胞膜，所以有益處。本發(fā)明的脂質(zhì)體也顯示了對(duì)超聲的回聲反射性，對(duì)壓力高度穩(wěn)定、和/或通常具有長(zhǎng)的貯存壽命、干燥貯存或懸于液體培養(yǎng)基中。脂質(zhì)體的回響反射性根據(jù)本發(fā)明對(duì)制造的脂質(zhì)體的診斷和治療的應(yīng)用是重要的。氣體填充的脂質(zhì)體也有下列優(yōu)點(diǎn)，例如穩(wěn)定的顆粒大小、低的毒性和溫和的膜。據(jù)信這種柔韌的氣體填充的脂質(zhì)體的膜可有助于這樣的指質(zhì)體累積或靶定位到組織，如腫瘤。
根據(jù)本發(fā)明制造的氣體填充的脂質(zhì)體對(duì)超聲對(duì)比顯像因此有優(yōu)越的特性。當(dāng)其位于氣體或組織培養(yǎng)基內(nèi)時(shí)，氣體填充的脂質(zhì)體對(duì)提高聲的吸收產(chǎn)生了界面。因此，氣體填充的脂質(zhì)體一般用于給患者顯像，和/或診斷患者疾病組織的存在及加熱和藥物釋放或激活組織的存在。
除超聲外，使用了根據(jù)本發(fā)明制造的脂質(zhì)體，例如，用于磁顯像和作為MRI造影劑。例如，氣體填充的脂質(zhì)體可包括順磁氣體，例如大氣，含痕量氧17，或順磁離子，如Mn+2、Gd+2、Fe+3，并因此用作磁共振顯像的敏感造影劑。此外，例如根據(jù)本發(fā)明制造的氣體填充的脂質(zhì)體可含射線透不過(guò)的金屬離子，例如碘、鋇、溴或鎢，用于X-射線造影劑。
氣體填充的脂質(zhì)體也特別用于藥物載體。不象現(xiàn)有技術(shù)中的脂質(zhì)體，只有適于水溶性膠囊藥物的液體內(nèi)部，根據(jù)本發(fā)明制造的氣體填充的脂質(zhì)體特別適用于膠囊性脂溶性藥物。而且，藥物的脂溶性衍生物易于摻入類(lèi)脂層，例如二鹵化金屬茂的烷基化衍生物。Kuo等，J.Am Chem.Soc.1991,113,9027-9045。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是根據(jù)本發(fā)明，為制備本發(fā)明氣體填充的脂質(zhì)體微球體優(yōu)選設(shè)備部分圖。
圖2說(shuō)明的是過(guò)濾和/或分散本發(fā)明含氣體填充的脂質(zhì)體的治療微球體的優(yōu)選設(shè)備。
圖3說(shuō)明的是過(guò)濾和/或分散本發(fā)明含氣體填充的脂質(zhì)體的治療微球體的優(yōu)選設(shè)備。
圖4是圖3的設(shè)備的部分部件分解圖。
圖5是(A)過(guò)濾前和(B)過(guò)濾后說(shuō)明本發(fā)明氣體填充脂質(zhì)體大小的顯微照片。
圖6圖示的是(A)過(guò)濾前和(B)過(guò)濾后本發(fā)明氣體填充脂質(zhì)體的大小分配。
圖7是通過(guò)濾器進(jìn)行(A)過(guò)濾前和(B)過(guò)濾后類(lèi)脂懸浮液的顯微照片。
圖8是繼于過(guò)濾和高壓類(lèi)脂懸浮液形成的氣體填充的脂質(zhì)體顯微照片，此照片攝于篩分氣體填充的脂質(zhì)體大小的(A)之前和(B)之后。
發(fā)明概述本發(fā)明是指氣體填充的脂質(zhì)體的制備方法和設(shè)備。不象現(xiàn)有技術(shù)中的方法，是指用內(nèi)部填充水溶液形成脂質(zhì)體，本發(fā)明的方法是指內(nèi)部含氣體的脂質(zhì)體的制備。
制備氣體填充的脂質(zhì)體的優(yōu)選方法包括在氣體存在時(shí)，溫度在類(lèi)脂從凝膠狀態(tài)向液晶狀態(tài)相轉(zhuǎn)變溫度以下振蕩含類(lèi)脂的水溶液。本發(fā)明也提供了制備氣體填充的脂質(zhì)體的方法，包括在氣體存在時(shí)振蕩含類(lèi)脂的水溶液及分離結(jié)果產(chǎn)生的氣體填充的脂質(zhì)體，以用于診斷或治療。經(jīng)上述方法制備的脂質(zhì)體此處稱為通過(guò)振蕩氣體滴注方法由凝膠狀態(tài)制備的氣體填充的脂質(zhì)體。
通常一般的水填充的脂質(zhì)體在類(lèi)脂的相轉(zhuǎn)變溫度以上的溫度形成，因?yàn)樗鼈兏呷犴g性并因此在液晶狀態(tài)下應(yīng)用于生物系統(tǒng)。例如，見(jiàn)Szoka and Papahadjopoulos,Proc.Natl.Acad.Sci.1998,75,9494-4198.相比之下，按本發(fā)明方法優(yōu)選實(shí)施方案制造的脂質(zhì)體是氣體填充的，有更大的柔韌性，因?yàn)闅怏w比水溶液更具可縮性和柔和性。因此，在低于類(lèi)脂的相轉(zhuǎn)變溫度的溫度下形成時(shí)，盡管凝膠相是更硬的，氣體填充的脂質(zhì)體可用于生物系統(tǒng)。
本發(fā)明方法提供了在氣體存在時(shí)，振蕩含類(lèi)脂的水溶液。此處使用的振蕩，定義為攪拌水溶液使氣體從局部周?chē)h(huán)境進(jìn)入水溶液的運(yùn)動(dòng)。攪拌水溶液和引起氣體進(jìn)入的任何類(lèi)型的運(yùn)動(dòng)都可用于振蕩。振蕩必須具有足夠的力度以使其在一短時(shí)間內(nèi)能夠形成泡沫。如30分，優(yōu)選在20分鐘之內(nèi)，更優(yōu)選是在10分鐘之內(nèi)。振蕩可以通過(guò)旋轉(zhuǎn)進(jìn)行(如通過(guò)渦旋)，從一邊到另一邊，或上下運(yùn)動(dòng)。而且，可結(jié)合不同類(lèi)型的運(yùn)動(dòng)。此外，振蕩可通過(guò)搖動(dòng)含有類(lèi)脂水溶液的容器進(jìn)行，或通過(guò)搖動(dòng)容器內(nèi)水溶液而不搖動(dòng)容器本身產(chǎn)生。進(jìn)一步，振蕩可通過(guò)手工或機(jī)器產(chǎn)生?？墒褂玫臋C(jī)械振蕩器包括，如象VWR Scientific(Cerritos,CA)振蕩搖床及機(jī)械涂料混合器及其它已知的機(jī)器。另一個(gè)產(chǎn)生振蕩的方法是在高速或高壓下發(fā)出氣體的運(yùn)動(dòng)。也可理解，優(yōu)選用較大體積的水溶液，力的總量相應(yīng)增加。劇烈振蕩定義為至少每分鐘振蕩約60次，而且優(yōu)選。渦旋至少每分鐘1000次，劇烈振蕩的例子更優(yōu)選。渦旋在每分1800轉(zhuǎn)為最好。
振蕩形成的氣體填充的脂質(zhì)體通過(guò)水溶液頂部的泡沫的存在檢測(cè)。一旦形成泡沫，伴隨著水溶液體積的降低。優(yōu)選地，泡沫的最終體積至少約為類(lèi)脂水溶液起初體積的2倍，更好地，泡沫的最終體積至少約為水溶液初始體積的3倍，再最好地，泡沫的最終體積至少約為初始體積的4倍；最好地，所有類(lèi)脂水溶液變成泡沫。
需要的持續(xù)振蕩時(shí)間可通過(guò)檢測(cè)泡沫的形成確定。例如，50ml離心管中10ml類(lèi)脂溶液渦旋近15-20分鐘或氣體填充的脂質(zhì)體的粘稠度相當(dāng)厚，以致于當(dāng)其旋轉(zhuǎn)時(shí)不再粘于側(cè)壁。此時(shí)，泡沫可導(dǎo)致含氣體填充的脂質(zhì)體溶液產(chǎn)至30至50ml水平。
要求形成優(yōu)選泡沫的類(lèi)脂的濃度依賴使用的類(lèi)脂類(lèi)型而變，一旦經(jīng)此說(shuō)明書(shū)支持，可被本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定。例如，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，按本發(fā)明方法用于形成氣體填充的脂質(zhì)體的1,2-二棕櫚酸磷脂酰膽堿(DPPC)的濃度約20mg/ml-約30mg/ml鹽溶液。用于優(yōu)選實(shí)施方案中的二硬脂酸磷脂酰膽堿(DSPC)的濃度約為5mg/ml至約10mg/ml鹽溶液。
具體地，濃度為20mg/ml至30mg/ml的DPPC一經(jīng)振蕩，便全部產(chǎn)生懸浮液，并且包裹的氣體體積本身比懸液體積大4倍。濃度為10mg/ml的DSPC，一經(jīng)振蕩，完全產(chǎn)生無(wú)任何液體懸液的總體積，并全部為泡沫。
一旦得到此說(shuō)明書(shū)支持，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可知，類(lèi)脂或脂質(zhì)體可處理于本發(fā)明方法前或之后。例如，類(lèi)脂可水合，然后凍干經(jīng)凍融循環(huán)處理，或只水合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，水合類(lèi)脂，然后凍干，或水合，然后通過(guò)凍融循環(huán)處理，然后凍干，這些是在氣體填充的脂質(zhì)體形成之前。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，水合類(lèi)脂，然后振蕩，接著至少進(jìn)行一個(gè)在液氮中冷凍和融化的循環(huán)，此后接著凍干。在氣體填充的脂質(zhì)體形成之前這些處理的益處包括類(lèi)脂由液體到具有較大表面積的固體的轉(zhuǎn)化，一旦水合，因此具有較好的溶解性并因此形成較高產(chǎn)率的氣體填充的脂質(zhì)體。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的方法，氣體的存在通過(guò)當(dāng)場(chǎng)環(huán)境氣壓提供。當(dāng)場(chǎng)環(huán)境氣壓可以是密封容器內(nèi)的氣壓，或在一個(gè)非密封容器內(nèi)的氣壓，可是外環(huán)境中的氣壓。
二者擇一，例如，氣體可被注射進(jìn)或不然加至有類(lèi)脂水溶液的容器中或注射進(jìn)類(lèi)脂水溶液本身以提供空氣以外的氣體。不如空氣重的氣體加至密封的容器中而比空氣重的氣體加至密封的或不密封的容器中。
本發(fā)明優(yōu)選的方法優(yōu)選在低于所用類(lèi)脂的凝膠態(tài)至液晶態(tài)相轉(zhuǎn)變溫度下進(jìn)行。所謂凝膠態(tài)向液晶態(tài)相轉(zhuǎn)變溫度，是指類(lèi)脂雙層從凝膠態(tài)向液晶態(tài)轉(zhuǎn)變的溫度。例如見(jiàn)Chap-man等J.Biol.Chem.1974,249,2512-2521。不同類(lèi)脂的凝膠態(tài)向液晶態(tài)相轉(zhuǎn)變溫度對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)地，且例如描述于Gregoriadis ed.,Liposome Technology，Vol.I,1-18(CRC Press,1984)and Derek Marsh,CRCHandbook of Lipid Bilayers(CRC Press,Boca Raton,FL1990),at P.139。也可在下表Ⅰ中看出。使用的類(lèi)脂凝膠態(tài)向液晶態(tài)相轉(zhuǎn)變溫度高于室溫，容器的溫度可調(diào)節(jié)，例如，通過(guò)冷卻機(jī)制冷卻含有類(lèi)脂溶液的容器。
例2當(dāng)用形碼識(shí)別技術(shù)鍵入“辛"時(shí)，即IDHD，此時(shí)提示行會(huì)出現(xiàn)1、立IDH12、辛IDH23、音IDH3用戶可選擇2．同時(shí)記憶一下IDH2，這個(gè)2是本發(fā)明拼形碼中的2，而不是數(shù)字鍵中的2。幾次下來(lái)，用戶一般能記住常用的。當(dāng)然，記不住時(shí)還是選擇，這一技術(shù)將使我們得到一個(gè)無(wú)重碼方案?，F(xiàn)有的重碼處理技術(shù)．當(dāng)發(fā)生重碼時(shí)，只有1、2、3……等選擇而無(wú)學(xué)習(xí)功能。每次發(fā)生重碼則每次選。還有一種功能是“跳字”功能、自動(dòng)上屏、當(dāng)發(fā)生重碼時(shí)、你選的字下次就跳在第一個(gè)位置。而處于“預(yù)選”狀態(tài)。本發(fā)明則是每發(fā)生一次重碼，操作者就可以學(xué)習(xí)一次，記下該重碼的位號(hào)(標(biāo)識(shí)碼)，而下次將此位號(hào)當(dāng)作一個(gè)編碼放在重碼字的編碼后面(作為最后一碼)，每字四鍵。該技術(shù)可使用戶(操作者)每發(fā)生一次重碼就可記憶一次，從而使重碼隨著記憶的增多而下降。適用于任何漢字輸入法．且技術(shù)手段可以多樣化。重碼每發(fā)生一次就記憶一次，只要記住了，就不要再用重碼方式輸入，而將記住的編碼直接輸入即可。
本發(fā)明的熱鍵部件(部首、字根)顯示方法。即當(dāng)處于輸入狀態(tài)時(shí)。只要鍵入“功能鍵+代碼鍵”，屏幕提示行就會(huì)顯示所述代碼鍵所代表的相關(guān)代碼(即相關(guān)部件、部首、字根等)。這一技術(shù)將使用戶不需要記住每一個(gè)部件(部首、筆畫(huà)、字根等)．而通過(guò)該技術(shù)隨時(shí)查看。本技術(shù)可用于各種漢字編碼輸入法。用于本發(fā)明的舉例如下。
當(dāng)處于輸入狀態(tài)時(shí)．鍵入A1t+A，則提示行會(huì)顯示〖A〗又瓦(a)又
及
女當(dāng)你按一下“A1t+I”，則提示行顯示生物系統(tǒng)。例如見(jiàn)Szoka and Papahadjopoulos,PROC.Natl.Acad.Sci.1978 75,4194-4198。對(duì)此之下，按本發(fā)明方法優(yōu)選實(shí)施方案制造的脂質(zhì)體是氣體填充的，具有較大的柔韌性，因?yàn)闅怏w比水溶液更可縮和柔和。因此，在低于類(lèi)脂的相轉(zhuǎn)變溫度下，盡管凝膠相是更硬的，形成的氣體填充的脂質(zhì)體可用于生物系統(tǒng)。
使用凝膠態(tài)振蕩氣體滴注方法生產(chǎn)氣體填充的脂質(zhì)體的優(yōu)選設(shè)備見(jiàn)圖1。類(lèi)脂和水溶性介質(zhì)的混合物在氣體滴注過(guò)程中經(jīng)劇烈攪拌產(chǎn)生氣體填充的脂質(zhì)體，或成批或連續(xù)進(jìn)料。關(guān)于圖1，來(lái)自類(lèi)脂供應(yīng)器50的干燥類(lèi)脂51通過(guò)導(dǎo)管59加至混合器66中，或連續(xù)流入或以間歇團(tuán)狀輸入。如使用成批方法，混合器66可含相當(dāng)小的容器，如注射器、試管、瓶或圓底燒瓶、或較大容器。如使用連續(xù)進(jìn)料方法，混合器最好是大容器，例如桶。
氣體填充的脂質(zhì)體含有化合物，可加入治療化合物，例如，以類(lèi)似于上述類(lèi)脂的加入方式在氣體滴注程序前加入。二者擇一，當(dāng)脂質(zhì)體在其外邊用治療化合物包裹時(shí)，氣體滴注程序后，加入治療化合物。
除了類(lèi)脂51，來(lái)自水介質(zhì)供應(yīng)器52的水介質(zhì)53，如鹽溶液，經(jīng)導(dǎo)管61也加至容器66中。類(lèi)脂51和水介質(zhì)53結(jié)合形成類(lèi)脂水溶液74。兩者擇一，干燥類(lèi)脂51能在引進(jìn)混合器66之前水合，使類(lèi)脂在水溶液中引入。在制造脂質(zhì)體方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，溶液74起初的氣體填充的，使溶液只占居混合器66容量的一部分。而且，用連續(xù)的方法，加入類(lèi)脂水溶液74的速度及移去產(chǎn)生的氣體填充的脂質(zhì)體的速度受到控制，保證類(lèi)脂溶液74的體積不超過(guò)混合器66容量的預(yù)先確定的百分比。
通過(guò)引進(jìn)高速壓縮噴射氣流直接進(jìn)入類(lèi)脂水溶液74完成振蕩。兩者擇一，通過(guò)機(jī)械振蕩水溶液，或手工或經(jīng)機(jī)器完成振蕩。此種機(jī)械振蕩可通過(guò)振蕩混合器66或通過(guò)直接通過(guò)振蕩水溶液74，而不振蕩混合器本身進(jìn)行。如圖1所示，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，機(jī)械振蕩器75和混合器66相連。振蕩應(yīng)是有充分強(qiáng)度的，目的在一段時(shí)間后，在水溶液74的上部形成含氣體填充脂質(zhì)體的泡沫73，如圖1所示。泡沫73形成的測(cè)定可作為控制振蕩持續(xù)的手段，就是說(shuō)，預(yù)先不確定振蕩的時(shí)間，振蕩可以持續(xù)，直至產(chǎn)生預(yù)先確定體積的泡沫。
在制造氣體填充的脂質(zhì)體設(shè)備的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的類(lèi)脂低于室溫的凝膠向液晶相轉(zhuǎn)變的溫度，使用了冷卻類(lèi)脂水溶液的方法。在圖1所示實(shí)施方案中，通過(guò)混合器66周?chē)渲玫耐馓?4完成冷卻，以在混合器周?chē)纬森h(huán)形通道。如圖1所示，冷卻液63被迫流過(guò)這種環(huán)形通道，此是分別借助于外套進(jìn)出導(dǎo)管62和63完成的。通過(guò)調(diào)節(jié)冷卻液62的溫度和流動(dòng)速度，類(lèi)脂水溶液74的溫度能維持在期望的溫度。
如圖1中所示，氣體55，可以是氣體填充的或其它氣體，如氮?dú)饣驓鍤馀c水溶液74一起導(dǎo)入混合容器66?？諝饪梢圆捎貌幻芊獾幕旌先萜鲗?dǎo)入，這樣水溶液就不斷地暴露于環(huán)境。批量方法中，固定量的局部環(huán)境空氣可以通過(guò)密封該混合容器66而導(dǎo)入。如采用比空氣重的氣體，則該容器無(wú)需密封。然而，導(dǎo)入不比空氣重的氣體則需要將混合容器密封，例如采用蓋65，如圖1中所示。無(wú)論氣體55是空氣或是其它氣體，它可以在混合容器66中加壓，例如，由導(dǎo)管57將混合容器與加壓氣體供給罐54連接，如圖1中所示。
搖動(dòng)完畢后，含泡沫73的氣體填充的脂質(zhì)體可以從混合容器66中提取。提取可以通過(guò)將注射器100的針頭102(如圖2中所示)插入泡沫73并通過(guò)抽回柱塞106將預(yù)定量的泡沫抽入注射管104來(lái)完成。如下文進(jìn)一步論述的，針頭102的尖端在泡沫73中所置的位置可用來(lái)控制所提取的氣體填充的脂質(zhì)體的大小。
此外，提取可以通過(guò)將提取管67插入混合容器66來(lái)完成，如圖1中所示。如果混合容器66是加壓的，如前面論述的，氣體55的壓力可用來(lái)迫使氣體填充的脂質(zhì)體77從混合容器66經(jīng)導(dǎo)管70入提取容器76。在混合容器66不加壓的情況下，提取容器76可以經(jīng)導(dǎo)管78與真空源58(如真空泵)相連，這樣就產(chǎn)生足夠的負(fù)壓將泡沫73吸入提取容器76，如圖1中所示。由提取容器76，氣體填充的脂質(zhì)體77導(dǎo)入管瓶82，于其中它們可裝運(yùn)給最終用戶。加壓氣體56的氣源可與提取容器76相連從而幫助擠出氣體填充的脂質(zhì)體。由于負(fù)壓會(huì)導(dǎo)致增加氣體填充的脂質(zhì)體的大小，優(yōu)選采用正壓移出充質(zhì)脂質(zhì)體。
優(yōu)選進(jìn)行過(guò)濾以獲得基本均一大小的氣體填充的脂質(zhì)體。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，過(guò)濾裝配含有不只一種過(guò)濾器，且優(yōu)選地，這些過(guò)濾器不是緊密地相互連接，如圖4中所示。過(guò)濾前，氣體填充的脂質(zhì)體的大小范圍從約1微米至大干60微米(圖5A和6A)。經(jīng)單個(gè)過(guò)濾器過(guò)濾后，氣體填充的脂質(zhì)體通常小于10微米，但大小在25微米的顆粒仍然存在。經(jīng)兩個(gè)過(guò)濾器(10微米接著經(jīng)8微米過(guò)濾器)過(guò)濾后，幾乎所有的脂質(zhì)體都小于10微米，且大多數(shù)為5至7微米(圖5B和6B)。
如圖1中所示，過(guò)濾可以通過(guò)將過(guò)濾器單元72直接結(jié)合到提取管67的端部來(lái)完成，這樣只有低于預(yù)定大小的氣體填充的脂質(zhì)體能從混合容器66中提取。此外，或除提取管過(guò)濾器72外，氣體填充的脂質(zhì)體篩分可以通過(guò)結(jié)合入將氣體填充的脂質(zhì)體77從提取容器76導(dǎo)入管瓶82的導(dǎo)管79的過(guò)濾器80的方式來(lái)完成，如圖1中所示。過(guò)濾器80可以含有階式過(guò)濾器裝配124，如圖4中所示。示于圖4中的階式過(guò)濾器裝配124包含兩個(gè)連續(xù)過(guò)濾器116和120，其中過(guò)濾器120置于過(guò)濾器116上游。在優(yōu)選實(shí)施方案中，上游過(guò)濾器120是“NUCLEPORE”10μm過(guò)濾器，下游過(guò)濾器116是NUCLEPORE”8μm過(guò)濾器。兩個(gè)0.15mm金屬網(wǎng)盤(pán)115優(yōu)選置于過(guò)濾器116的兩面。優(yōu)選實(shí)施方案中，過(guò)濾器116和120由特氟隆TMO形圈118的方式將兩者空間間隔最少150μm。
除過(guò)濾器外，篩分也可以利用氣體填充的脂質(zhì)體浮力對(duì)大小的依賴來(lái)完成。氣體填充的脂質(zhì)體恰好具有比水小的密度，因而將浮于混合容器66的頂部。由于最大的脂質(zhì)體具有最小的密度，它們最快浮于水面。最小的脂質(zhì)體通常最后升到頂部，并且不被氣體填充的脂質(zhì)將沉入底部。通過(guò)將它們經(jīng)不同的漂浮過(guò)程移出混合容器66，這種現(xiàn)象可以優(yōu)越地用來(lái)篩分氣體填充的脂質(zhì)體。因此，提取管67在混合容器66中的垂直位置的定位可以控制提取的氣體填充的脂質(zhì)體大小。管越高，所提取的氣體填充的脂質(zhì)體就越大。而且，定時(shí)或不斷調(diào)節(jié)管67在混合容器66中的垂直位置，所提取的氣體填充的脂質(zhì)體的大小可以在不斷發(fā)展的基礎(chǔ)上控制。這種提取可以通過(guò)結(jié)合裝置68而容易化，裝置68可以是連于提取管67的與紋套管72匹配的紋箍71，此裝置使得提取管67在提取容器66中的垂直位置得以準(zhǔn)確地調(diào)節(jié)。
凝膠態(tài)振蕩氣體裝置方法本身也可以用來(lái)改善篩分氣體填充的類(lèi)脂微球體。通常，振蕩能量的強(qiáng)度越大，所得的氣體填充的脂質(zhì)體的大小就越小。
本發(fā)明還包括制備分發(fā)給最終用戶的含藥氣體填充的脂質(zhì)體的新方法。一旦形成氣體填充的脂質(zhì)體，它們將不可以在引起破裂的溫度下高溫消毒。因此，期望以滅菌成分形成氣體填充的脂質(zhì)體且盡可能少進(jìn)行隨后的操作以避免污染的危險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明，這可以通過(guò)下述方法完成，例如，通過(guò)在振蕩之前將含有類(lèi)脂和水溶液的混合容器消毒，并將氣體填充的脂質(zhì)體77從混合容器66經(jīng)提取容器76直接分配入消毒注射器100的注射管104，如圖2中所示，而無(wú)需進(jìn)一步加工或處理。裝有氣體填充的脂質(zhì)體77且適當(dāng)包裝好的注射器100可分發(fā)給最終用戶。之后，產(chǎn)品無(wú)需進(jìn)一步操作以施氣體填充的脂質(zhì)體于患者，只需從包裝中取出注射器并從注射器針頭102取下保護(hù)套(未示出)，將針頭插入患者體內(nèi)，或插入導(dǎo)管。而且，當(dāng)注射器柱塞106擠壓入注射管104時(shí)產(chǎn)生的壓力會(huì)引起最大的氣體填充的脂質(zhì)體破裂，因此不過(guò)濾便獲得了篩分的程度。
使用時(shí)需要過(guò)濾氣體填充的脂質(zhì)體時(shí)，例如因?yàn)樗鼈儚奶崛∪萜?6移出時(shí)未過(guò)濾或因?yàn)樾枰M(jìn)一步過(guò)濾，注射器100可以裝有自己的過(guò)濾器108，如圖2中所示。這就導(dǎo)致當(dāng)注射氣體填充的脂質(zhì)體時(shí)通過(guò)柱塞106的作用引起它們壓出過(guò)濾器108而使氣體填充的脂質(zhì)體篩分。因此，充氣脂質(zhì)體可以在一個(gè)步驟內(nèi)篩分并注入患者。
如圖3中所示，階式過(guò)濾器盒110可以直接裝在注射器112上，這樣使得在使用時(shí)階式過(guò)濾。如圖4中所示，過(guò)濾器盒110包含階式過(guò)濾器裝配124，前面已論述過(guò)，結(jié)合在具有陽(yáng)螺紋的下箍122和具有陰螺紋的上箍114之間。下箍122適合于Luer鎖，使得它容易固定在注射器112上，而上箍114適合于針頭102。
優(yōu)選實(shí)施方案中，類(lèi)脂溶液經(jīng)過(guò)濾器壓出且類(lèi)脂溶液在振蕩前高溫消毒。一旦氣體填充的脂質(zhì)體形成，它們可以如前所述過(guò)濾篩分。這些步驟先于氣體填充的脂質(zhì)體形成提供，例如，減少未水合的脂質(zhì)體量且由此提供明顯較高的氣體填充的脂質(zhì)體產(chǎn)率以及提供可直接施于患者的消毒脂質(zhì)體的優(yōu)點(diǎn)。例如，混合容器如管瓶或注射器可裝有過(guò)濾的類(lèi)脂懸浮液，然后該溶液可在混合容器中消毒，例如，通過(guò)高壓滅菌器。氣體可以注入類(lèi)脂懸浮液以通過(guò)振蕩該消毒容器生成氣體填充的脂質(zhì)體。優(yōu)選該消毒容器配有裝好的過(guò)濾器，這樣在接觸患者前，氣體填充的脂質(zhì)體經(jīng)過(guò)過(guò)濾器。
優(yōu)選方法的第一步，經(jīng)過(guò)濾器壓出類(lèi)脂溶液，通過(guò)破碎干的類(lèi)脂和更大表面積的暴露而水合，減少了未水合的類(lèi)脂的量。優(yōu)選地，過(guò)濾器具有孔徑約0.1至0.5μm，更優(yōu)選約0.1至約4μm，甚至更優(yōu)選，約0.1至約2μm，最優(yōu)選，約1μm。如圖7中所示，當(dāng)類(lèi)脂懸浮液過(guò)濾時(shí)(圖7B)，與未先過(guò)濾的類(lèi)脂懸浮液相比(圖7A)，未水合類(lèi)脂的量減少。未水合類(lèi)脂表現(xiàn)為非均一大小的無(wú)定形塊，是不合適的。
第二步，消毒，提供可容易施于患者的組合物。優(yōu)選消毒通過(guò)熱消毒完成，優(yōu)選在至少約100℃溫度下將溶液高壓滅菌法處理，且更優(yōu)選在約100℃至約130℃下高壓滅菌法處理，甚至更優(yōu)選，約110℃至約130℃，甚至更優(yōu)選，約120℃至130℃，且最優(yōu)選約130℃。優(yōu)選加熱至少約1分鐘，更優(yōu)選，約1至30分鐘，甚至更優(yōu)選，約10至約20分鐘，且最優(yōu)選，約15分鐘。
采用不同于在會(huì)引起氣體填充的脂質(zhì)體破裂溫度下高溫消毒的方法進(jìn)行消毒時(shí)，消毒可在氣體填充的脂質(zhì)體形成后進(jìn)行，且是優(yōu)選的。例如，可在充氣脂質(zhì)體形成前和/或后采用γ射線。
圖8說(shuō)明在130℃高壓滅菌15分鐘，接著渦旋10分鐘后，氣體填充的脂質(zhì)體成功形成的能力。此外，壓出和消毒程序后，振蕩步驟產(chǎn)生對(duì)無(wú)殘留的無(wú)水類(lèi)脂相來(lái)說(shuō)帶得很少的氣體填充的脂質(zhì)體。圖8A顯示高壓滅菌后但在過(guò)濾前產(chǎn)生的氣體填充的脂質(zhì)體，由此得許多具有大于10μm大小的氣體填充的脂質(zhì)體。圖8B顯示約10μm“NUCLEPORE”過(guò)濾器過(guò)濾后的氣體填充的脂質(zhì)體，得10μm左右的均一大小。
可以采用來(lái)制備氣體填充的類(lèi)脂微球的原料包括任何一種本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的適合用來(lái)作脂質(zhì)體制備的材料或其組合物。采用的類(lèi)脂可以是天然或合成來(lái)源。選用特定類(lèi)脂類(lèi)以最適合所需的屬性，例如，短血漿半衰期與長(zhǎng)血漿半衰期用于最大的血清穩(wěn)定性。也可以理解某些類(lèi)脂類(lèi)可以對(duì)特定應(yīng)用更有效，如抑制治療化合物在氣體填充的脂質(zhì)體微球體破裂時(shí)被釋放。
氣體填充的脂質(zhì)體中的類(lèi)脂可以是單個(gè)雙層或多薄片雙層，且優(yōu)選多薄片雙層的形式。
可以用來(lái)產(chǎn)生類(lèi)脂微球體的類(lèi)脂類(lèi)包括但不限于類(lèi)脂類(lèi)如脂肪酸，溶類(lèi)脂，帶飽和和非飽和類(lèi)脂的磷脂酰膽堿包括，二油酰磷脂酰膽堿；二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿；雙十五酰磷脂酰膽堿，二月桂酰磷脂酰膽堿，二棕櫚酰磷脂酰膽堿；二硬脂酰磷脂酰膽堿；磷酯酰乙醇胺如二油酰磷脂酰乙醇胺；磷脂酰絲氨酸；磷脂酰甘油；磷脂酰肌醇；鞘酯類(lèi)如鞘磷酯；糖酯類(lèi)如神經(jīng)節(jié)甘油GM1和GM2；葡糖酯類(lèi)(glucolipids)；硫甘酯；糖鞘酯類(lèi)；磷脂酸；棕櫚酸；硬脂酸；花生四烯酸；油酸；含類(lèi)脂類(lèi)的聚合物如聚乙二醇，幾丁質(zhì)，透明質(zhì)酸或聚乙烯吡咯烷酮；含類(lèi)脂類(lèi)的磺化單、雙、寡或聚糖；膽甾醇，膽甾醇硫酸酯和膽甾醇半琥珀酸酯；生育酚半琥珀酸酯，帶有醚和酯連接脂肪酸的類(lèi)脂類(lèi)，聚合的類(lèi)脂類(lèi)，二乙酰磷酸酯，硬脂胺，心磷酯，帶有長(zhǎng)度為6-8個(gè)碳的短鏈脂肪酸的磷脂類(lèi)，帶有對(duì)稱?；湹暮铣闪字?lèi)(例如，帶有一個(gè)6個(gè)碳的酰基鏈和另一個(gè)12個(gè)碳的?；?，6-(5-膽甾烯-3β-基氧)-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷，二半乳糖基甘油二酯，6-(5-膽甾烯-3β-基氧)己基-6-氨基-6-脫氧-1-硫化-β-D-吡喃半乳糖苷，6-(5-膽甾烯-3β-基氧)己基-6-氨基-6-脫氧-1-硫代-α-D-吡喃甘露糖苷，12-(((7′-二乙基氨基香豆-3-基)羰基)甲基氨基)-十八酸；N-[12-(((7′-二乙基氨基香豆-3-基)羰基)甲基氨基)十八酰基]-2-氨基棕櫚酸；(4′-三甲銨)丁酸膽甾烯酯；N-琥珀酰二油酰磷脂酰乙醇胺；1,2-二油酰基-sn-甘油；1,2-二棕櫚?；?sn-3-琥珀酰甘油；1,3-二棕櫚?；?2-琥珀酰甘油；1-十六基-2-棕櫚甘油磷酰乙醇胺；和棕櫚酰高半胱氨酸；和/或其組合物。
如果需要，可以采用各種陽(yáng)離子類(lèi)脂類(lèi)如DOTMA,N-[1-(2,3-二油?；?丙基]-N,N,N-三甲基銨氯化物；DOTAP,1,2-二油?；?3-(4′-三甲基銨)丙烷；DOTB,1,2-二油?；?3-(4′-三甲銨)丁?；?sn-甘油。通常，脂質(zhì)體中陽(yáng)離子類(lèi)脂與非陽(yáng)離子類(lèi)脂的摩爾比為，例如，1∶1000,1∶100，優(yōu)選，2∶1至1∶10之間，更優(yōu)選在1∶1至1∶2.5的范圍內(nèi)，且最優(yōu)選1∶1(陽(yáng)離子類(lèi)脂摩爾量與非陽(yáng)離子類(lèi)脂(例如DPPC)摩爾量的比)。當(dāng)陽(yáng)離子用來(lái)構(gòu)建微球體時(shí)，品種繁多的類(lèi)脂類(lèi)可以包含非陽(yáng)離子類(lèi)脂。優(yōu)選，這種非陽(yáng)離子類(lèi)脂是二棕櫚酰磷脂酰膽堿，二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺或二油酰磷脂酰乙醇胺。作為如上所述的陽(yáng)離子類(lèi)脂類(lèi)的替代，含類(lèi)脂類(lèi)的陽(yáng)離子聚合物如多溶素或多精氨酸也可用來(lái)構(gòu)建微球體，且提供結(jié)合帶負(fù)電荷治療劑(如遺傳物質(zhì))于微球體的外部。此外，可以采用負(fù)電荷類(lèi)脂類(lèi)，例如，來(lái)結(jié)合帶正電荷的治療化合物。
與本發(fā)明精神一致的，對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯然的其它有用類(lèi)脂類(lèi)或其組合物亦被本發(fā)明所包含。例如，含碳水化合物的類(lèi)脂類(lèi)可用于體內(nèi)靶定位，如USP4,310,505中所描述的，其公開(kāi)全部并入本文作為參考。
最優(yōu)選的類(lèi)脂類(lèi)為磷脂類(lèi)，優(yōu)選DPPC和DSPC，且最優(yōu)選DPPC。
可用來(lái)產(chǎn)生氣體填充的微球體的飽和非飽和脂肪酸優(yōu)選包括，但不限于，直鏈或支鏈形式的12個(gè)碳原子和22個(gè)碳原子間的分子?？刹捎玫娘柡椭舅岬膶?shí)施包括，但不限于，月桂酸，肉豆蔻酸，棕櫚酸和硬脂酸?？刹捎玫牟伙柡椭舅岬膶?shí)施包括，但不限于，月桂烯酸，抹香鯨酸，肉豆蔻烯酸，棕櫚烯酸，巖芹酸，和油烯酸?？刹捎玫闹ф溨舅岬膶?shí)施包括，但不限于，異月桂酸，異肉豆蔻酸，異棕櫚酸，和異硬脂酸和類(lèi)異戊二烯。
通過(guò)一或多個(gè)烷基或甾醇基，陽(yáng)離子聚合物可結(jié)合到類(lèi)脂層上，上述基團(tuán)所起的作用是將陽(yáng)離子聚合物固定在包圍氣體的類(lèi)脂層上?？梢赃@種方式使用的陽(yáng)離子聚合物包括，但不限制于，多溶素和多精氨酸，和其類(lèi)似物如多高精氨酸和多高溶素。陽(yáng)離子類(lèi)脂類(lèi)和陽(yáng)離子聚合物的正電荷基團(tuán)，或含全氟烷基化基團(tuán)的陽(yáng)離子基團(tuán)，例如，可用來(lái)配合負(fù)電荷分子如遺傳物質(zhì)上的糖磷酸酯，由此將所述物質(zhì)結(jié)合到空氣類(lèi)脂微球的表面。例如，可以采用兩新全氟烷基化二吡啶，如Garelli和Vierling在Biochim Biophys Acta,19921127,41-48中所描述的，其公開(kāi)全部并入本文作為參考。此外，例如，負(fù)電荷分子可以經(jīng)酯、酰胺、醚、二硫或硫酯鍵直接結(jié)合到類(lèi)脂的首基上。
生物活性物質(zhì)，如肽或蛋白質(zhì)，可以并入類(lèi)脂層，假定肽具有足夠的親油性或可以用烷基或甾醇基衍生而連接于類(lèi)脂層。負(fù)電荷肽可以，例如，如上所述采用陽(yáng)離子類(lèi)脂或聚合物連接。
類(lèi)脂類(lèi)或氣體填充的脂質(zhì)體的溶液可以通過(guò)，例如，增加品種繁多的粘性改善劑來(lái)穩(wěn)定。粘性改善劑包括，但不限于，碳水化合物及其磷?；突酋；苌铮痪勖杨?lèi)，優(yōu)選分子量范圍在400和8000之間；二和三羥基烷烴及其聚合物，優(yōu)選分子量范圍在800和8000之間。乳化劑和/或增溶劑也可用來(lái)與類(lèi)脂類(lèi)或脂質(zhì)體結(jié)合。這些試劑包括，但不限于，阿拉伯膠，膽甾醇，二乙醇胺，單硬脂酸甘油酯，羊毛脂醇，卵磷脂，單和二甘油酯，單乙醇胺，油酸，油醇，泊洛沙姆，聚氧乙烯50硬脂酸酯，聚氧乙烯35蓖麻油，聚氧乙烯10油基醚，聚氧乙烯20十六十八基醚，聚氧乙烯40硬脂酸酯，聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯40，聚山梨醇酯60，聚山醇酯80，丙二醇二乙酸酯，丙二醇單硬脂酸酯，月桂基硫酸鈉，硬脂酸鈉，失水山梨醇單月桂酸酯，失水山梨醇單油酸酯，失水山梨醇單棕櫚酸酯，失水山梨醇單硬脂酸酯，硬脂酸，三乙醇胺，和乳化蠟?？膳c類(lèi)脂或脂質(zhì)體溶液一起使用的懸浮和/或增粘劑包括但不限于，阿拉伯膠，瓊脂，藻酸，單硬脂酸鋁，膨潤(rùn)土，糖糊，聚羧乙烯934P，羧甲基纖維素、鈣和鈉和鈉12，鹿角膠，纖維素，糊精，明膠，瓜爾膠，羥乙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，硅酸鎂鋁，甲基纖維素，果膠，聚環(huán)氧乙烷，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，藻酸丙二醇酯，二氧化硅，藻酸鈉，黃蓍膠，和黃原膠。
本發(fā)明的氣體填充的脂質(zhì)體優(yōu)選包含一種不滲透性物質(zhì)。不滲透性物質(zhì)被定義為這樣一種物質(zhì)，它在典型的貯存條件下不允許主要的脂質(zhì)體內(nèi)含物通過(guò)。主要被定義為大于約50％的內(nèi)含物，該內(nèi)含物是包囊在脂質(zhì)體內(nèi)的氣體以及任何其它成分，例如治療劑。在貯存期和施用于患者前，優(yōu)選，少于25％的氣體被釋放，更優(yōu)選，少于10％的氣體被釋放，且最優(yōu)選，少于1％的氣體被釋放。
也已發(fā)現(xiàn)，氣體填充的脂質(zhì)體的氣體不滲透性至少部分地與凝膠態(tài)向液晶態(tài)的相轉(zhuǎn)變溫度有關(guān)。通常認(rèn)為，凝膠態(tài)向液晶態(tài)的相轉(zhuǎn)變溫度越高，在給定溫度下脂質(zhì)體就越是氣體不滲透。飽和二?；?sn-甘油基-3-磷酰膽堿的主鏈熔點(diǎn)轉(zhuǎn)變參見(jiàn)上面的表1和Derek Marsh,CRC Handbookof Lipid Bilayers(CRC Press,Boca Raton,FL 1990)第139頁(yè)。然而，應(yīng)當(dāng)指出的是，一般使用較少量的能量就可以將治療化合物從帶較低凝膠態(tài)向液晶態(tài)的相轉(zhuǎn)變溫度的類(lèi)脂類(lèi)組成的氣體填充的脂質(zhì)體釋放。
在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，類(lèi)脂的相轉(zhuǎn)變溫度比它們要施予的患者的體內(nèi)溫度高。例如，優(yōu)選施于人的類(lèi)脂類(lèi)具有大于約37℃的相轉(zhuǎn)變溫度。通常，優(yōu)選具有相轉(zhuǎn)變溫度大于約20℃的微球體。
在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，由本發(fā)明方法制得的脂質(zhì)體是穩(wěn)定的。穩(wěn)定性定義為從形成時(shí)起直至超聲應(yīng)用時(shí)耐破裂。為求穩(wěn)定性可以選用用來(lái)構(gòu)建微球體的類(lèi)脂類(lèi)。例如，由DSPC(二硬脂酰磷脂酰膽堿)組成的氣體填充的脂質(zhì)體要比由DPPC(二棕櫚酰磷脂酰膽堿)組成的氣體填充的脂質(zhì)體穩(wěn)定，且這些轉(zhuǎn)而又比由蛋磷脂酰膽堿(EPC)組成的氣體填充的脂質(zhì)體穩(wěn)定。優(yōu)選，從形成時(shí)直至超聲應(yīng)用時(shí)少于約50％的脂質(zhì)體破裂，更優(yōu)選，少于約25％的脂質(zhì)體破裂，甚至更優(yōu)選，少于約10％的脂質(zhì)體，且最優(yōu)選，少于約1％的脂質(zhì)體。
本主題脂質(zhì)體趨向于比經(jīng)由已知方法如壓力法或其它技術(shù)生產(chǎn)的其它氣體填充的脂質(zhì)體在貯存期具有更大的氣不滲透性和穩(wěn)定性。例如，形成72小時(shí)后，常規(guī)制備的脂質(zhì)體通?；旧先狈怏w(氣體擴(kuò)散到脂質(zhì)體外和/或脂質(zhì)體破裂和/或融合)，導(dǎo)致反射性的伴隨損失。相比之下，保持在水溶液中的本發(fā)明氣體填充的脂質(zhì)體通常具有大于約三星期的貯存壽命穩(wěn)定性，優(yōu)選的貯存壽命穩(wěn)定性大于約四星期，更優(yōu)選的貯存壽命穩(wěn)定性大于約五星期，甚至更優(yōu)選的貯存壽命穩(wěn)定性大于約三個(gè)月，且通常貯存壽命穩(wěn)定性甚至更長(zhǎng)，如超過(guò)六個(gè)月，十二個(gè)月，或甚至二年。
此外，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，摻入至少少量的負(fù)電荷類(lèi)脂入任何脂質(zhì)體膜，雖然不是必需的，但有益于提供一種不因聚合而趨于破裂的脂質(zhì)體。至少少量的是指約占總類(lèi)脂的約一摩爾百分量。適合的負(fù)電荷類(lèi)脂類(lèi)對(duì)本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，包括例如，磷脂酰絲氨酸和脂肪酸。最優(yōu)選的對(duì)應(yīng)用共振頻率超聲時(shí)破裂，回波產(chǎn)生性和穩(wěn)定性有能力的是由二棕櫚酰磷脂酯膽堿制備的脂質(zhì)體。
再則，本發(fā)明脂質(zhì)體在血管中很好地充分穩(wěn)定，因而它們經(jīng)受再循環(huán)。氣體填充的脂質(zhì)體可以包被，因而被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吸收最小。有用的包被物包括，例如，神經(jīng)節(jié)苷酯，糖醛酸苷半乳糖醛酸酯，古洛糖醛酸酯，聚乙二醇，聚丙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇，葡聚糖，淀粉，磷?；突酋；瘑?，雙，三，寡和多糖和
。脂質(zhì)體也可以為如避免被免疫系統(tǒng)識(shí)別的目的而包被。
采用的類(lèi)脂也最好是柔性的。柔性，如氣體填充的脂質(zhì)體的文中所定義的，是結(jié)構(gòu)改變其形狀的能力，例如，為了穿過(guò)大小比脂質(zhì)體小的孔。
假定脂質(zhì)體的循環(huán)半衰期充分地長(zhǎng)，當(dāng)通過(guò)身體時(shí)，脂質(zhì)體通常穿過(guò)靶組織。因此，通過(guò)將聲波集中于被治療的選擇組織上，治療藥物會(huì)局部釋放在靶組織。為進(jìn)一步幫助中靶，也可以將抗體，碳水化合物、肽、糖肽，糖類(lèi)脂和外源凝集素?fù)饺胫|(zhì)體的表面。
在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，作為對(duì)氣體灌輸過(guò)程以及對(duì)保持氣體填充的脂質(zhì)體穩(wěn)定性的幫助，例如，可以向類(lèi)脂加入乳化劑。乳化劑的實(shí)例包括，但不限于，甘油、鯨蠟醇、山梨醇、聚乙醇、月桂基硫酸鈉，Lauseth 23，聚山梨醇酯(所有個(gè)體)，所有飽和和非飽和脂肪酸，和三乙醇胺。
對(duì)于使用前的貯存，本發(fā)明的脂質(zhì)體可以懸浮在水溶液中，如鹽水溶液(例如，磷酸鹽緩沖的鹽水溶液)，或僅僅是水，并優(yōu)選貯存在約2℃至約10℃間的溫度下，優(yōu)選在約4℃下。優(yōu)選，水是經(jīng)消毒的。
典型貯存條件是，例如，非除氣的0.9％NaCl水溶液在4℃下保存48小時(shí)。貯存溫度優(yōu)選低于形成脂質(zhì)體材料的凝膠態(tài)向液晶態(tài)的相轉(zhuǎn)變溫度。
更優(yōu)選，脂質(zhì)體貯存在等滲鹽水溶液，雖然，如果需要，鹽水溶液可以是低滲的(例如，約0.3至約0.5％NaCl)。溶液也可以是緩沖的，如果需要，以提供約pH5至約pH7.4的pH范圍。適合的緩沖液包括，但不限于，乙酸鹽，檸檬酸鹽，磷酸鹽和碳酸氫鹽。
也可以與脂質(zhì)體一起包括抑菌劑以防止貯存時(shí)細(xì)菌降解。適合的抑菌劑包括但不限于氯化芐烷銨，氯化芐乙氧銨，苯甲酸，芐醇，羥苯甲酸丁酯，十六基吡啶鎓氯化物，氯丁醇，氯甲酚，羥苯甲酸甲酯，苯酚，苯甲酸鉀，山梨酸鉀，苯甲酸鈉和山梨酸。
本文所用的“氣體填充的”是指脂質(zhì)體具有至少約10％氣體的內(nèi)部體積，優(yōu)選至少約25％的氣體，更優(yōu)選至少約50％的氣體，甚至更優(yōu)選至少約75％的氣體，且最優(yōu)選至少約90％的氣體。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以理解，一旦得到本發(fā)明的公開(kāi)，人們也可以采用氣體前體，接著活化以形成氣體。
本發(fā)明的氣體填充的脂質(zhì)體可以使用各種生物相容氣體。這類(lèi)氣體包括空氣，氮?dú)?，二氧化碳，氧氣、氬氣、氟氣、氙氣、氖氣、氦氣，或其任何和所有組合氣。一旦得到本發(fā)明的公開(kāi)，其它適合的氣體對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
本發(fā)明脂質(zhì)體的大小依所期的使用而定。對(duì)較小的脂質(zhì)體，通常共振頻率超聲要比較大的脂質(zhì)體要高。篩分也可用作調(diào)節(jié)所得脂質(zhì)體的生物分布和清除。除過(guò)濾外，脂質(zhì)體的大小，如果需要，也可以通過(guò)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的方法調(diào)節(jié)，如壓出，聲處理，勻漿，采用層流將液體芯導(dǎo)入液體不互混鞘。參見(jiàn)，例如，USP 4,728,478；英國(guó)專利申請(qǐng)GB2193095A；USP 4,728,575；USP 4,737,323；國(guó)際申請(qǐng)PCT/US 85/01161；Maye等，Biochimica et Biophysica Ac-ta 1986,858,161-168；Hope等，Biochimica et BiophysicaActa 1985,812,55-65；USP 4,533,254；Mayhew等，Methods in Enzymology 1987,149,64-77；Mayhew等，Biochimica et Biophysica Acta 1984,755,169-74；Cheng等，Investigative Radiology 1987,22,47-55；PCT/US89/05040；USP 4,162,282；USP 4,310,505；USP 4,921,706；和Liposomes Technology,Groegoriadis,G主編，Vol I.PP 29-37,51-67和79-108(CRC Press Inc,Boca Ra-ton,FL,1984)。每個(gè)前面專利，文獻(xiàn)和專利申請(qǐng)的公開(kāi)全部并入本文作為參考。在壓力下壓出限定大小的孔是調(diào)節(jié)脂質(zhì)體大小的優(yōu)選方法。
由于脂質(zhì)體大小影響生物分布，不同大小脂質(zhì)體可以選用于不同的目的。例如，血管內(nèi)施用，優(yōu)選的大小范圍是平均外徑在約30納米和約10微米間，優(yōu)選平均外徑為5微米。
更具體地說(shuō)，對(duì)于血管內(nèi)施用，脂質(zhì)體的大小優(yōu)選約10μm或更小的平均外徑，且優(yōu)選小于約7μm，且更優(yōu)選小于約5μm的平均外徑。優(yōu)選，脂質(zhì)體不小于約30納米的平均外徑。
對(duì)于提供治療劑釋放至器官如肝臟并將正常組織與腫瘤區(qū)別，較小的脂質(zhì)體，約30納米和約100納米間的平均外徑，是優(yōu)選的。
為栓塞組織如腎或肺，脂質(zhì)體優(yōu)選小于約200微米的平均外徑。
對(duì)于鼻內(nèi)，直腸內(nèi)或表面給藥，微球體優(yōu)選小于約100微米的平均外徑。
大脂質(zhì)體，例如，1到10微米大小之間的，通常限定于靜脈內(nèi)空間，直至被襯在管內(nèi)的吞噬單體清除，如襯噬菌體和Kuppfer細(xì)胞的毛細(xì)管竇狀隙。為穿至竇狀隙外的細(xì)胞，可以采用較小的脂質(zhì)體，例如，小于約1微米平均外徑，如大小小于約300納米。
脂質(zhì)體的給藥途徑依預(yù)期的使用而定。如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能理解的，本發(fā)明治療劑傳遞體系的給藥可采用各種劑量形式以各種方式進(jìn)行，如血管內(nèi)、淋巴內(nèi)、非腸道、皮下、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、直腸內(nèi)、腹膜內(nèi)、間質(zhì)、經(jīng)霧化器入氣道、高壓、經(jīng)口，表面，或腫瘤內(nèi)。對(duì)于血管內(nèi)應(yīng)用，治療劑傳遞體系通常是靜脈注射，但也可以是動(dòng)脈注射。本發(fā)明的脂質(zhì)體也可以間質(zhì)注射或注入任何體腔。
對(duì)于具有良好的傳聲途徑傳送超聲能量的組織，采用超聲，治療劑從本發(fā)明的脂質(zhì)體的傳遞得以最好地完成。在體內(nèi)的大多數(shù)組織如肌肉，心臟，肝臟和大多數(shù)其它的重要結(jié)構(gòu)是這種情況。腦中，為了直接讓超聲能量穿過(guò)頭顱，需要手術(shù)來(lái)辟路徑。
此外，本發(fā)明特別有用于將治療劑傳遞入患者肺中。本發(fā)明的氣體填充的脂質(zhì)體比，例如，常規(guī)的液體填充脂質(zhì)體輕。液體填充脂質(zhì)體通常沉降在中心的鄰近氣道而不是到達(dá)肺的末梢區(qū)域。因而認(rèn)為，本發(fā)明的氣體填充的脂質(zhì)體合格可以改善治療化合物至肺末梢區(qū)域的傳遞。肺末梢區(qū)域包括末端氣道和小窩。施用于肺，氣體填充的脂質(zhì)體可由例如，霧化使用。
在例如以襯有類(lèi)脂類(lèi)的肺為靶體的使用時(shí)，治療劑可以在氣體填充的脂質(zhì)體與襯在靶組織的類(lèi)脂類(lèi)聚合時(shí)釋放，此外，氣體填充的脂質(zhì)體可以在不使用超聲在給藥后爆裂。因此，在上述類(lèi)型的給藥中不需要應(yīng)用超聲來(lái)釋放藥物。
再則，本發(fā)明的氣體填充的脂質(zhì)體對(duì)在水介質(zhì)或暴露于氧和/或空氣時(shí)降解的治療劑特別有用。例如，脂質(zhì)體可以用惰性氣體如氮?dú)饣驓鍤馓畛渑c不穩(wěn)定治療化合物一起使用。此外，氣體填充的脂質(zhì)體可以用惰性氣體填充并用來(lái)包囊不穩(wěn)定治療劑，用于患者的通常引起治療劑暴露于氣體填充的的區(qū)域，如皮膚和眼上使用。
氣體填充的脂質(zhì)體對(duì)經(jīng)皮傳遞例如，膏藥傳遞體系也特別有用。使用破裂超聲可增加經(jīng)皮傳遞治療化合物，再則，機(jī)械裝置可用來(lái)監(jiān)控和調(diào)節(jié)藥物傳遞。例如，診斷超聲可用來(lái)可視監(jiān)控氣體填充的脂質(zhì)體的爆裂和調(diào)節(jié)藥物的傳遞和/或水聽(tīng)器可用于查聽(tīng)氣體填充的脂質(zhì)體的爆裂和調(diào)節(jié)藥物傳遞。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，脂質(zhì)體單獨(dú)地施用，而不是例如包埋在基質(zhì)中。
體外應(yīng)用，如細(xì)胞培養(yǎng)使用，氣體填充的脂質(zhì)體可加到培養(yǎng)物的細(xì)胞中，然后培養(yǎng)。隨后聲能可用于含細(xì)胞和脂質(zhì)體的培養(yǎng)基。
通常，本發(fā)明的治療傳遞體系是以水懸浮液如在水中或鹽水溶液(例如，磷酸鹽緩沖的鹽水)中的形式給藥。優(yōu)選，水是經(jīng)消毒的。還優(yōu)選鹽水溶液是等滲鹽水溶液，雖然如果需要，鹽水溶液可以是低滲的(例如。約0.3至約0.5％NaCl)，如果需要，該溶液也可以是緩沖的，以提供約pH5和至約pH7.4的pH范圍。此外，葡聚糖最好包括在培養(yǎng)基中。其它的可用于氣體填充的脂質(zhì)體給藥的溶液包括，但不限于，杏油、玉米油、棉籽油、油酸乙酯，肉豆蔻酸異丙酯，棕櫚酸異丙酯，礦物油、肉豆蔻醇、辛基十二醇、橄欖油、花生油、桃仁油、芝麻油、大豆油和角鯊烯。
施用的氣體填充的微球體的有用劑量和施用方法依年齡、重量、要治療的哺乳動(dòng)物，預(yù)期的特定應(yīng)用(治療/診斷)而定。典型地，劑量以較低水平開(kāi)始，然后增加直至取得所需的治療效果。
對(duì)于超聲顯像中的應(yīng)用，優(yōu)選，本發(fā)明的脂質(zhì)體具備反射率大于2dB，更優(yōu)選在給4dB和約20dB之間。在此范圍內(nèi)，較大的脂質(zhì)體，較高濃度的脂質(zhì)體，和/或采用較高超聲頻率時(shí)，顯出本發(fā)明脂質(zhì)體最高的反射率。
對(duì)于治療藥物傳遞，本發(fā)明的含治療劑的脂質(zhì)體治療劑給藥于或經(jīng)其它方式到達(dá)患者需治療的區(qū)域后，向該區(qū)使用某種頻率的超聲，該脂質(zhì)體的破裂令人吃驚地容易進(jìn)行。具體地說(shuō)，意外地發(fā)現(xiàn)，以相應(yīng)于含治療劑的氣體填充的脂質(zhì)體的峰共振頻率的頻率使用超聲時(shí)，脂質(zhì)體會(huì)破裂并釋放其內(nèi)容物。
峰共振頻率可在體內(nèi)成體外測(cè)定，但最好在體內(nèi)，采用常規(guī)方法，通過(guò)將脂質(zhì)體暴露于超聲，接收反射的共振頻率信號(hào)和分析接收的信號(hào)譜以確定該峰來(lái)測(cè)定。該峰，如所測(cè)定的，與峰共振頻率一致(或如有時(shí)所稱的第二級(jí)諧波)。
優(yōu)選，本發(fā)明的脂質(zhì)體具有峰約0.5mHz和約10mHz間的共振頻率。當(dāng)然，本發(fā)明脂質(zhì)體的峰共振頻率會(huì)依外徑和，在某種程序上，脂質(zhì)體的彈性或柔性的不同而不同。帶較大和較高彈性或柔性的脂質(zhì)體比較小和較低彈性或柔性脂質(zhì)體的共振頻率要低。
當(dāng)暴露于與較高強(qiáng)度(瓦數(shù))和較長(zhǎng)時(shí)期(時(shí)間)組合的非峰共振頻率時(shí)，含治療劑的氣體填充的脂質(zhì)體也會(huì)破裂。然而，這種更高的能量，導(dǎo)致大大增加熱量，可能是不希望的。通過(guò)調(diào)節(jié)能量的頻率使之與峰共振頻率匹配，破裂的效率和治療劑釋放得以改善，明顯的組織變熱通常不會(huì)出現(xiàn)(通常溫度增加不高于約2℃)，且需要較少的總能量。因此，以峰共振頻率使用超聲，雖然并不要求，是最優(yōu)選的。
對(duì)于診斷或治療超聲，在本發(fā)明的實(shí)施中可以采用任何一種類(lèi)型的診斷超聲顯像裝置，裝置的具體類(lèi)型或型號(hào)對(duì)本發(fā)明的方法無(wú)關(guān)緊要。設(shè)計(jì)來(lái)施用超聲高溫的裝置也是適合的，這種裝置描述于USP 4,620,546；4,658,828和4,586,512，其分別全部并入本文作為參考。優(yōu)選，該裝置使用共振頻率(RF)譜分析儀。轉(zhuǎn)換器探頭可以體外使用或植入。超聲通常比較低強(qiáng)度和短時(shí)間開(kāi)始，然后，增加強(qiáng)度，時(shí)間，和/或共振頻率直至脂質(zhì)體在超聲上可見(jiàn)(用于診斷超聲使用)或破裂(用于治療超聲使用)。
盡管各種原理的使用對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，一旦得到本發(fā)明公開(kāi)，通過(guò)一般的指引，對(duì)于約1.5至約1微米平均外徑的氣體填充的脂質(zhì)體，共振頻率通常在約1至10兆赫的范圍。通過(guò)調(diào)節(jié)聚焦區(qū)于靶組織(例如腫瘤)的中心隨著脂質(zhì)體在靶組織內(nèi)的累積，脂質(zhì)體可以在實(shí)際時(shí)間超聲下見(jiàn)到。使用7.5兆赫彎曲排列轉(zhuǎn)換器作為實(shí)例，調(diào)節(jié)傳遞至轉(zhuǎn)換器的能量至最大和調(diào)節(jié)聚焦區(qū)在靶組織內(nèi)，則二維峰臨時(shí)平均(SPTA)能量為在水中的最大值接近5.31mW/cm2。該能量會(huì)引起從氣體填充的脂質(zhì)體釋放一些治療劑，但更大量的釋放可以通過(guò)使用更高能量來(lái)完成。
將轉(zhuǎn)換器開(kāi)到多普勒方式，可實(shí)現(xiàn)更高能量的輸出，從同一轉(zhuǎn)換器可達(dá)每平方厘米2.5瓦。用多普勒方式開(kāi)動(dòng)機(jī)器，能量可以釋放到靶組織內(nèi)的選擇聚焦區(qū)，且氣體填充的脂質(zhì)體可釋放其治療劑。選擇匹配氣體填充的脂質(zhì)體共振頻率的轉(zhuǎn)換器甚至?xí)惯@種治療劑釋放的方法更有效。
對(duì)于較大直徑的氣體填充的脂質(zhì)體，例如，平均外徑大于3微米，完成治療劑釋放時(shí)較低頻率的轉(zhuǎn)換器可能更有效。例如，可以選擇3.5兆赫的轉(zhuǎn)換器(20mm彎曲排列型)來(lái)與氣體填充的脂質(zhì)體的共振頻率一致。采用這種轉(zhuǎn)換器，可傳遞101.6毫瓦/cm2至聚焦點(diǎn)，并且開(kāi)至多普勒式會(huì)增加能量輸出(SPTA)至1.02瓦/cm2。
為使用氣蝕現(xiàn)象來(lái)釋放和/或活化脂質(zhì)體內(nèi)的藥物/前藥，可使用較低頻率能量，因?yàn)樵谳^低頻率氣蝕發(fā)生更有效。用較高電壓(高達(dá)300伏)驅(qū)動(dòng)0.757兆赫的轉(zhuǎn)換器，氣體填充的脂質(zhì)體溶液的氣蝕將于約5.2大氣壓的閥值出現(xiàn)。
表Ⅱ顯示從普通使用的儀器的診斷超聲傳送到組織的能量范圍。儀器如Piconics Inc.(Tyngsboro,MA)產(chǎn)的接收器脈沖裝置1966型661的Portascan一般目的掃描儀；Picker(Cleveland,OH)產(chǎn)的包括80C系統(tǒng)的Echoview 8LScanner或Medisonics(Mountain View,CA)的Model D-9 Versatone Bidirectional Doppler。通常，脈沖重復(fù)中所采用的能量范圍對(duì)診斷和監(jiān)控氣體填充的脂質(zhì)體是有用的，但對(duì)本發(fā)明脂質(zhì)體的破裂無(wú)效。
診斷設(shè)備產(chǎn)生的能量和強(qiáng)度*<
>*數(shù)值來(lái)自Carson等的，Ultrasound in Med.&amp; Biol.1978,3,341-350一文，該文的公開(kāi)全部并入本文作為參考。
如普通采用于治療超聲的較高的能量對(duì)活化含治療劑的氣體填充的脂質(zhì)體是優(yōu)選的。通常，根據(jù)用超聲加熱的組織區(qū)域，治療超聲儀器采用多達(dá)50％至100％的占空因數(shù)。帶較大量肌肉塊(即，背、股)的區(qū)和高度血管化的組織如心臟會(huì)需要較大的占空因數(shù)，例如100％。
在超聲診斷中，使用一種或幾種聲波脈沖而且該儀器在脈沖到接受反射的聲音信號(hào)之間要暫停。超聲診斷中使用的有限數(shù)量的脈沖限制了傳遞到被成像組織的有效能量。
在超聲治療中，使用連續(xù)的超聲波來(lái)傳遞高水平的能量。在使用本發(fā)明的脂質(zhì)體時(shí)，聲波能量可以是脈沖的，但優(yōu)選連續(xù)的超聲波。如果使用脈中，聲波優(yōu)選一次以至少約8個(gè)回聲序列長(zhǎng)度脈沖，并且優(yōu)選至少20個(gè)脈沖。
可以使用固定的頻率或調(diào)頻的超聲。將固定的頻率定義為聲波的頻率在時(shí)間段內(nèi)是恒定的。調(diào)頻則是聲波的頻率在時(shí)間段內(nèi)是變化的，例如由高到低(PRICH)或由低到高(CHIRP)。例如，聲能的起始頻率為10MHz的PRICH脈沖偏到1MHz且能量從1增到5瓦特?？偠灾?，調(diào)頻，高能的超聲能量可在脂質(zhì)體范圍內(nèi)增加局部氣體膨脹和破裂的速度來(lái)產(chǎn)生治療劑的局部傳遞。
所使用的聲波頻率可在約0.025到約100兆赫之間變化。優(yōu)選的頻率范圍約為0.75-3兆赫，最優(yōu)選的頻率范圍為約1-2兆赫。通常治療時(shí)可使用約0.75到約1.5兆赫的頻率。通常也可使用約3到7.5兆赫的診斷頻率。對(duì)于很小的脂質(zhì)體，如低于0.5微米的平均外徑，由于這些較小的脂質(zhì)體在較高的聲波頻率時(shí)更有效地吸收聲能，因此優(yōu)選使用較高頻率的聲波。當(dāng)使用很高的頻率時(shí)，如超過(guò)10兆赫，聲能通常會(huì)限制滲透到(流)體液和組織的深度。外用可優(yōu)選皮膚和其它表面組織，但對(duì)于深結(jié)構(gòu)，可優(yōu)選通過(guò)組織間隙探針或血管內(nèi)超聲導(dǎo)管來(lái)使用聲能。
用氣體填充的脂質(zhì)體來(lái)傳遞藥物時(shí)，可將被傳遞的治療藥物化合物按需嵌入脂質(zhì)體的壁中，包囊在脂質(zhì)體中和/或連結(jié)到脂質(zhì)體上。本文所使用的與治療化合物的部位有關(guān)的短語(yǔ)“連結(jié)”或其變化形式的意思是指治療化合物以某種方式連接到微球的壁的內(nèi)部和/或外部，如通過(guò)共價(jià)或離子鍵或其它化學(xué)或電化學(xué)鍵的方式或相互作用的方式連結(jié)。本文所用的與治療化合物的部位有關(guān)的短語(yǔ)“包囊”或其變化形式是指治療化合物位于微球內(nèi)的空隙中。本文所使用的與治療化合物的部位有關(guān)的短語(yǔ)“嵌入”或其變化形式是指治療化合物位于微球壁內(nèi)。短語(yǔ)“含有治療物”指以各種形式使治療物置于微球中。因此，治療物的位置是可變的，例如，包裹在氣體填充的微球體的空隙中，位于氣體和氣體填充的微球內(nèi)壁之間。結(jié)合在氣體填充的微球的外表面和/或網(wǎng)在微球結(jié)構(gòu)本身中。
任何一種治療劑都可包囊在脂質(zhì)體中。本文所使用的治療劑意指對(duì)病人具有有益效果的試劑。本文所使用的術(shù)語(yǔ)治療劑與術(shù)語(yǔ)藥物是同義的。
可用氣體填充脂質(zhì)體傳遞的藥物的實(shí)例可包含以傳遞藥物為目的，但不局限于此，激素產(chǎn)品如加壓素和催產(chǎn)素及其衍生物，胰高血糖素，和甲狀腺劑如碘產(chǎn)品和抗甲狀腺劑；心血管產(chǎn)品如螯合劑和汞利尿劑和強(qiáng)心甙；呼吸產(chǎn)品如黃嘌呤衍生物(茶堿和氨茶堿)；抗感染劑如氨基糖甙，抗真菌劑(二性霉素)，青霉素和頭孢菌素抗生素，抗病毒劑如齊多夫定，利巴韋林，金剛烷胺，阿糖腺苷和阿昔洛韋，抗蠕蟲(chóng)劑(anti-helmintic)，抗瘧劑和抗結(jié)核藥；生物產(chǎn)品如免疫血清，抗毒素和抗蛇毒血清，狂犬病預(yù)防產(chǎn)品，細(xì)菌疫苗，病毒疫苗，類(lèi)毒素；抗腫瘤劑如nitrosureas，氮芥，抗代謝物(氟尿嘧啶，激素如progesings和雌激素和抗雌激素劑)；抗生素如放線菌素；有絲分裂抑制劑如依托泊甙和長(zhǎng)春生物堿(the Vinca alkaloids)，放射藥物如放射活性碘和磷產(chǎn)品；以及干擾類(lèi)、羥基脲、甲基芐肼、氮烯咪胺、米托坦、天冬酰胺酶和環(huán)孢子菌素。
在氣體安置過(guò)程中，可將遺傳和生物活性物質(zhì)混入這些脂質(zhì)體氣體填充空間內(nèi)或混入這些顆粒的質(zhì)膜內(nèi)或脂膜上。優(yōu)選結(jié)合在這些顆粒的表面上?？蓪⒕哂懈叩男链?水分配系數(shù)的遺傳物質(zhì)和生物活性產(chǎn)品直接混入包裹氣體的類(lèi)脂層中但優(yōu)選結(jié)合在氣體填充脂質(zhì)體球的表面上。要達(dá)到這樣的目的，通常需將能結(jié)合遺傳物質(zhì)或生物活性物質(zhì)的基團(tuán)鍵合在結(jié)合這些物質(zhì)的類(lèi)脂層中。在使用遺傳物質(zhì)(DNA、RNA，單股和雙股和反義和有意寡聚核苷酸)時(shí)，通過(guò)使用可混合到干類(lèi)脂起始材料中的陽(yáng)離子類(lèi)脂或陽(yáng)離子聚合物，很容易達(dá)到這個(gè)目的。
其它合適的治療劑包括但不局限于抗腫瘤劑，如鉑化合物(如，螺鉑、順鉑和卡鉑)，甲氨喋呤、阿霉素、紫杉酚、絲裂霉素、ansamitocin、博米霉素、阿糖胞苷、阿糖腺苷、巰基多熔素、長(zhǎng)春新堿、馬利蘭、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥(如，PAM、L-PAM或苯丙氨酸芥子)、巰基嘌呤、米托坦、鹽酸丙卡巴肼、放線菌素D(actinomycin D)、鹽酸柔紅霉素、鹽酸阿霉素、絲裂霉素、普卡霉素(mithramycin)、氨魯米特、雌莫司汀磷酸鈉、氟他胺、乙酸亮丙瑞林乙酸甲地孕酮、檸檬酸他莫昔芬、睪內(nèi)酯、曲洛司坦、安吖啶(m-AMSA)、門(mén)冬酰胺酶(L-asparaginase)Erwina asparaginase，依托泊甙(VP-16)、干擾素α-2a、干擾素α-2b、替尼泊甙(VM-26)、硫酸長(zhǎng)春堿(VLB)、硫酸長(zhǎng)春新堿、博來(lái)霉素、硫酸博來(lái)霉素、甲氨喋呤、阿霉素、和arabinosyl；血液產(chǎn)品如非腸道鐵劑、氯化血紅素，血卟啉及其衍生物；生物應(yīng)答改良劑如胞壁酰二肽、胞壁酰三肽、微生物細(xì)胞壁成分，淋巴細(xì)胞活素(如，細(xì)菌內(nèi)素如脂多糖，巨噬細(xì)胞激活因子)，細(xì)菌亞單位(如，分枝桿菌、棒狀桿菌)，合成的二肽N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺；抗真菌劑如酮康唑、制霉菌素、灰黃霉素、氟胞嘧啶(5-FC)、米康唑、兩性霉素B、蓖麻素和β-內(nèi)酰胺抗生素(如，sulfazecin)；激素如生長(zhǎng)激素、促黑素細(xì)胞激素、雌二醇、二丙酸氯地米松、倍他米松、醋酸倍他米松和磷酸倍他米松鈉、vetamethasone disodium phos-phate、vetamethasone sodium phosphate、醋酸可的松、地塞米松、醋酸地塞米松、磷酸地塞米松鈉、9-去氟膚輕松(flunsolide)、氫化可的松、醋酸氫化可的松、氫化可的松環(huán)戊丙酸酯、磷酸氫化可的松鈉、琥珀酸氫化可的松鈉、甲潑尼龍、醋酸甲潑尼龍、琥珀酸甲潑尼龍鈉、醋酸帕拉米松、潑尼松龍、醋酸潑層松龍、磷酸潑尼松龍鈉、氫化潑尼松特丁酸酯、潑尼松、曲安西龍、曲安奈德、二乙酸曲安西龍、己曲安奈德和醋酸氟氫可的松；維生素如Cyanocobalamin neinoicacid,retinoids及衍生物如維生素A棕櫚酸酯、和α-生育酚；肽，如超氧化錳二變位酶(manganese super oxide dimu-tase)；酶如堿性磷酸酯酶；抗過(guò)敏劑如amelexanox；抗凝劑如苯丙香豆素和肝素；循環(huán)系統(tǒng)藥物如心得安；代謝增強(qiáng)劑如谷胱甘肽；抗結(jié)核劑如對(duì)氨基水楊酸、異煙肼、硫酸纏霉素、環(huán)絲氨酸、鹽酸乙胺丁醇、乙硫異煙胺，吡嗪酰胺、利福平和硫酸鏈霉素；抗病毒劑如阿昔洛韋、金剛烷胺、齊多夫定(AZT或azidothymidine)、利巴韋林和阿糖腺苷一水合物(adenine arabinoside,ara-A)；抗心絞痛藥如地爾硫草、硝苯地平、維拉帕米、丁四硝酯、硝酸異山梨酯、三硝酸甘油酯和戊四硝酯；抗凝劑如苯丙香豆素、肝素；抗生素如氨苯砜、氯霉素、新霉素、頭孢克洛、頭孢羥氨芐、頭孢氨芐、頭孢拉定、紅霉素、克林霉素、林肯霉素、阿莫西林、氨芐西林、巴安西林、羧芐西林、雙氯西林、氨環(huán)己西林、picloxacillin、海他西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、替卡西林、利福平和四環(huán)素；抗炎劑如二氟尼柳、布洛芬、吲哚美辛、甲氯芬那鹽、甲芬那酸、萘普生、羥布宗、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、托美丁、阿斯匹林和水楊酸鹽；抗原生動(dòng)物劑如氯喹、羥基氯喹、甲硝唑、奎寧和銻酸葡甲胺(meglu-mine antimonate)；抗風(fēng)濕藥如青霉胺；麻醉藥如復(fù)方樟腦酊；鴉片制劑如可待因、海洛因、美沙酮、嗎啡和鴉片；強(qiáng)心甙如去乙酰毛花甙、洋地黃毒甙、地高辛、洋地黃甙和洋地黃；神經(jīng)肌肉阻斷劑如阿曲庫(kù)銨苯磺酸鹽、加拉磺銨、乙芴溴銨、碘二甲箭毒、泮庫(kù)溴銨、氯琥珀膽堿(succinyl choline chlo-ride)、氯化筒箭毒堿和維庫(kù)溴銨；鎮(zhèn)靜藥(催眠藥)如異戊巴比妥、異戊巴比妥鈉、阿普比妥、仲丁比妥鈉、水合氯醛、乙氯維諾、炔己蟻胺、鹽酸氟西泮、格魯米特、鹽酸左美丙嗪、甲乙哌酮、鹽酸咪達(dá)唑它、副醛、戊巴比妥、戊巴比妥鈉、苯巴比妥鈉、司可巴比妥鈉、他布比妥、替馬西泮和三唑它；局麻藥如鹽酸卡因、鹽酸氯普魯卡因、鹽酸依替卡因、鹽酸利多卡因、鹽酸甲呱卡因、鹽酸普魯卡因和鹽酸丁卡因；全身麻醉藥如氟哌利多、依托咪酯、檸檬酸芬太尼與氟哌利多、鹽酸氯胺酮、美索比妥鈉和硫噴妥鈉；及放射性粒子或離子如鍶、碘化物、錸和釔。
在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療劑為單克隆抗體，如能夠與黑素瘤抗原結(jié)合的單克隆抗體。
其它優(yōu)選的治療劑包括遺傳物質(zhì)如核酸、RNA和DNA，他們是天然或合成得到的，包括重組RNA和DNA及反意RNA和DNA?？墒褂玫倪z傳物質(zhì)的類(lèi)型包括例如載于表達(dá)載體如質(zhì)粒、噬菌體質(zhì)粒(phagemids)、裝配型質(zhì)粒、酵母人工染色體(YACs)上的基因，和缺陷性病毒或“輔助”病毒，抗原核酸、單股和雙股RNA和DNA及其類(lèi)似物，如硫代磷酸酯和硫代磷酸酯低聚核苷酸。另外，可將遺傳物質(zhì)與例如蛋白質(zhì)或其它聚合物混合。
可用于本發(fā)明脂質(zhì)體中的遺傳治療劑的例子包括至少編碼一部分HLA基因的DNA、至少編碼一部分營(yíng)養(yǎng)不良素(dystrophin)的DNA，至少編碼一部分CFTR的DNA，至少編碼一部分IL-2的DNA，至少編碼一部分TNF的DNA，能與至少編碼一部分Ras的DNA結(jié)合的反義寡聚核苷酸。
編碼某些蛋白質(zhì)的DNA可用于治療許多不同類(lèi)型的疾病。例如，可用腺嘌呤核苷脫氨酶治療ADA缺乏；可用腫瘤壞死因子和/或白細(xì)胞介素-2治療晚期癌；可用HDL受體治療肝臟疾?。豢捎肏LA-B7治療惡性黑瘤，可用白細(xì)胞介素-2治療成神經(jīng)細(xì)胞瘤、惡性黑素瘤或腎癌；可用白細(xì)胞介素-4治療癌癥；可用HIV env治療HIV感染；可用反義ras/p53治療肺癌；以及可用凝血因子Ⅷ治療血友病B。例如，參見(jiàn)Science 258,744-746。
如果需要，可將多種治療劑置于脂質(zhì)體中。例如，單個(gè)脂質(zhì)體中可含有多種治療劑或者可一起給予含有不同治療物的脂質(zhì)體。作為實(shí)例，可同時(shí)給予能與黑素瘤抗原結(jié)合的單克隆抗體和至少編碼一部分IL-2的寡聚核苷酸。本文中所使用的短語(yǔ)“至少一部分”意思是指寡聚核苷酸不需要代表整個(gè)基因，只要其所表示的那部分基因能有效地阻斷基因的表達(dá)。
類(lèi)似地，可將藥物前體包囊在脂質(zhì)體中，并且藥物前體被包括在本文所使用的術(shù)語(yǔ)治療劑的范圍之內(nèi)。本技術(shù)領(lǐng)域中，藥物前體是熟知的，包括未激活的藥物前體，當(dāng)暴露在高溫、代謝酶、氣蝕和/或壓力下，在氧或其它物質(zhì)存在下，或當(dāng)從脂質(zhì)體中釋出時(shí)，這些藥物前體將形成活性藥物。在本發(fā)明方法中，當(dāng)超聲使用含前體藥物的脂質(zhì)體時(shí)，在氣蝕、加熱、加壓和/或從脂質(zhì)體中釋放時(shí)，這些藥物前體能被激活。合適的藥物前體對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，例如在Sin Kula等J.Pharm.Sci.1975 64,181-210中進(jìn)行了描述，由該文所公開(kāi)的全部?jī)?nèi)容都引入本文供參考。
例如，藥物前體可包括活性藥物的未活化形式，其中藥物前體上存在有延緩活化和/或改變藥物的溶解性或其它特性的化學(xué)基團(tuán)。在這種形式時(shí)，通常藥物前體是未活化的，但是當(dāng)通過(guò)加熱、氣蝕、加壓和/或通過(guò)周?chē)h(huán)境中的酶或其它物質(zhì)從藥物前體中除去該化學(xué)基團(tuán)時(shí)，即可產(chǎn)生活性藥物。本技術(shù)領(lǐng)域中詳細(xì)描述了這些藥物前體，并且包括各種各樣通過(guò)鍵與化學(xué)基團(tuán)結(jié)合的藥物，如與短、中等或長(zhǎng)鏈脂肪族碳酸酯形成的酯、有機(jī)磷酸的半酯、焦磷酸酯、硫酸酯、酰胺、氨基酸、偶氮鍵、氨基甲酸酯、磷酰胺、葡糖苷酸、N-乙酰葡糖胺和β-葡糖苷。
具有母體分子和可逆修飾或連結(jié)的藥物的實(shí)例如下具有酮縮醇的鈴蘭毒甙，具有烷基酯的乙內(nèi)酰脲、具有甘油或丙氨酸酯的氯苯甘油醚、具有咖啡因復(fù)合物的撲熱息痛、具有THAM鹽的乙酰水楊酸，具有乙酰氨基酚酯的乙酰水楊酸，具有硫酸酯的納洛酮，具有甲基酯的15-甲基前列腺素F2α，具有聚乙二醇的普魯卡因，具有烷基酯的紅霉素，具有烷基酯或磷酸酯的氯潔霉素，具有甜菜堿鹽的四環(huán)素，具有環(huán)取代的酰氧芐基酯的7-?；被^孢菌素，具有苯基丙酸癸酸酯的諾龍，具有烯醇醚乙縮醛的雌二醇，具有乙酸酯的甲基強(qiáng)的松龍，具有n-乙酰氨基葡糖苷葡糖苷酸(三甲基硅烷基)醚的睪丸酮，真有21-磷酸酯的可的松或強(qiáng)的松龍或地塞米松。
藥物前體也可設(shè)計(jì)為可逆的藥物衍生物并用作修飾劑來(lái)增強(qiáng)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到特定部位的組織。具有可逆修飾或連結(jié)以使藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到特定部位組織并增強(qiáng)治療效果的母體分子的實(shí)例包括具有鹵代烷基亞硝基脲的異氰酸酯，具有丙酸酯的睪丸酮，具有二烷基酯的氨甲喋呤(3,5′-二氯氨甲喋呤)，具有5′-?；陌⑻前?，氮芥(2,2′-二氯-N-甲基二乙基胺)，具有氨基甲基四環(huán)素的氮芥，具有膽甾醇或雌二醇或脫氫異酮酯的氮芥和具有偶氮苯的氮芥。
作為一個(gè)本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到，可選擇一個(gè)特定的修飾所給出的藥物的化學(xué)基團(tuán)來(lái)影響藥物在脂質(zhì)體膜中或空間中的分配?？蛇x擇能選擇性地連結(jié)化學(xué)基團(tuán)與藥物的鍵來(lái)產(chǎn)生理想的代謝速度，如，在酯鍵情況下，從氣體填充的脂質(zhì)體中釋出后，在血清酯酶存在下水解。另外，可選擇特定的化學(xué)基團(tuán)來(lái)影響在本發(fā)明氣體填充的運(yùn)載藥物脂質(zhì)體中所用的藥物的生物分布，如具有環(huán)磷酰胺的N,N-二(2-氯乙基)-二氨基磷酸分布到卵巢腺癌中。
另外，可設(shè)計(jì)氣體填充脂質(zhì)體中所用的藥物前體含有可逆的衍生物，它用來(lái)改良活性產(chǎn)生的期限，延長(zhǎng)或貯存作用效果。例如，可用葡聚糖和羧甲基葡聚糖酯修飾煙酸，用藻酸鹽修飾鏈霉素，用雙羥萘酸鹽修飾二氫鏈霉素，用5′-adamantoate酯修飾阿糖胞甙(ara-C)，用5-棕櫚酸酯和5′-苯甲酸酯修飾阿糖腺苷(ara-A)，用甲基酯修飾兩性霉素B、用17-β-烷基酯修飾睪丸酮，用甲酸酯修飾雌二醇，用2-(4-咪唑基)乙胺鹽修飾前列腺素，用氨基酸酰胺修飾多巴胺，用單一和雙(三甲基硅烷基)醚修飾氯素，和用雙羥萘酸鹽修飾環(huán)氯胍。在這種形式時(shí)，長(zhǎng)期作用的藥物貯存庫(kù)可在體內(nèi)從氣體填充的載有藥物前體的脂質(zhì)體中釋放出來(lái)。
另外，可使用通常熱不穩(wěn)定的化合物來(lái)產(chǎn)生無(wú)毒基團(tuán)化合物。優(yōu)選高溫分解如上所述具有偶氮鍵，過(guò)氧化物和二硫鍵的化合物。在這種形式的藥物前體下，由高能量的聲波與氣體填充的脂質(zhì)體相互作用引起的氣蝕和/或溫度增加激活化合物中的偶氮，過(guò)氧化物和二硫鍵而由這些包裹在其中的藥物前體產(chǎn)生串聯(lián)的游離基。多種藥物或化學(xué)物質(zhì)都可構(gòu)成這些藥物前體，如偶氮化合物，通式為R-N=N-R的化合物，其中R為烴鏈，兩個(gè)氮原子之間雙鍵可在體內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)生游離基產(chǎn)物。
可用來(lái)產(chǎn)生游離基產(chǎn)物的藥物或化合物的實(shí)例包括含偶氮的化合物如偶氮苯，2,2′-偶氮二異丁腈、偶氮二酰胺、石蕊精、氮霉素、azosemide、偶氮磺酰胺、氧化偶氮苯、aztre-onam、蘇丹Ⅲ、磺胺柯衣定、磺氨基柯衣定和磺胺水楊嗪，含二硫鍵的化合物如sulbentine、二硫胺、硫藤黃菌素、二硫化四甲秋蘭姆，含過(guò)氧化物的化合物如過(guò)氧化氫和過(guò)氧化苯甲酰、2,2′-偶氮二異丁腈、2,2′-偶氮二(2-酰氨基丙烷)二鹽酸鹽和2,2′-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)。
用氧氣填充的充氣脂質(zhì)體會(huì)產(chǎn)生氣蝕的廣泛的游離基。而且過(guò)渡金屬離子，特別是錳、鐵和銅能增加由氧形成活性氧中間體的速度。在脂質(zhì)體中包裹金屬離子，可增加體內(nèi)游離基的形成?？蓪⑦@些金屬離子以游離鹽、配合物如與ED-TA、DTPA、DOTA或desferrioxamine，或以金屬離子氧化物的形式混入脂質(zhì)體中，另外，衍生的金屬離子復(fù)合物可結(jié)合到脂質(zhì)的前部基團(tuán)，或離子的親脂復(fù)合物例如可結(jié)合到脂質(zhì)雙層中。當(dāng)熱刺激時(shí)，如氣蝕，這些金屬離子將增加形成活性氧中間體的速度。而且，可將放射敏感劑如2-甲基-5-硝基-1-咪唑基-乙醇和misonidazole混合在氣體填充的脂質(zhì)體中來(lái)在熱刺激下產(chǎn)生游離基。
作為使用藥物前體的例子，可通過(guò)易于在體內(nèi)被血清活性酶清除的酯鍵，將?；幕瘜W(xué)基團(tuán)與藥物結(jié)合。該?；乃幬锴绑w被混合在本發(fā)明氣體填充的脂質(zhì)體中。當(dāng)用超聲所產(chǎn)生的聲波脈中來(lái)中擊氣體填充的脂質(zhì)體時(shí)，由脂質(zhì)體包裹的藥物前體將暴露于血清中。血清中的酯酶消除酯鍵，因此產(chǎn)生藥物。
類(lèi)似地，超聲不僅可用來(lái)破裂氣體填充的脂質(zhì)體，而且可產(chǎn)生熱效應(yīng)，它可增加化學(xué)清除的速度并由藥物前體釋放活性藥物。
脂質(zhì)體也可以設(shè)計(jì)，以便使藥物在脂質(zhì)體的內(nèi)部和外面具有對(duì)稱或不對(duì)稱的分布。
可選擇或修飾治療物的特定化學(xué)結(jié)構(gòu)來(lái)達(dá)到所需的溶解性，這樣治療劑可被包裹在脂質(zhì)體氣體填充空間內(nèi)，連結(jié)在脂質(zhì)體上或網(wǎng)在脂質(zhì)體中。表面結(jié)合的治療劑可攜帶一種或多種酰基鍵，這樣，當(dāng)經(jīng)氣蝕而沖擊或加熱或破裂氣泡時(shí)，酰化的治療劑離開(kāi)表面和/或治療劑可從?；I化學(xué)基團(tuán)中被除去。類(lèi)似地，可將其它治療劑配制芳族或甾族結(jié)構(gòu)的疏水基團(tuán)來(lái)使其結(jié)合到脂質(zhì)體的表面。
下列實(shí)施例更進(jìn)一步地描述本發(fā)明，這些實(shí)施例說(shuō)明制備和試驗(yàn)氣體填充的脂質(zhì)體。下列實(shí)施例不會(huì)對(duì)所附的權(quán)利要求的范圍構(gòu)成限制。實(shí)施例實(shí)施例1制備氣體填充的脂質(zhì)體將50mg的1,2-二棕櫚酰-Sn-甘油基-3-磷酸膽堿(分子量734.05，粉末，批號(hào)160pc-183).(Avanti-Po-lar Lipids,Alabaster,AL)稱重并在離心管中用5.0ml的鹽溶液(0.9％氯化鈉)或磷酸鹽緩沖鹽(0.8％氯化鈉，0.02％氯化鉀，0.115％磷酸氫二鈉，0.02％磷酸二氫鉀，PH調(diào)至7.4)。然后在渦旋器上(Scientific Industries,Bohemi-a,NY)在6.5的儀器沉降位置振蕩水合的懸浮液10分鐘。記錄總體積為12ml。鹽溶液從5.0ml減小到約4ml。
用光學(xué)顯微鏡來(lái)估量經(jīng)過(guò)這種新方法的氣體填充脂質(zhì)體的大小。測(cè)得脂質(zhì)體最大的尺度從約50到約60μm并且可見(jiàn)的最小尺度約8μm。平均大小范圍為約15至約20μm。
經(jīng)過(guò)在Swin-Lko過(guò)濾架上的10或12μm的“核微孔”膜(Nuclepore Filtration Products,Costar Corp.,Cambridge,MA)和20cc注射器(Becton Dickinsion &amp;Co.,Rutherford,NJ)，過(guò)濾氣體填充的脂質(zhì)體。膜為10或12μm的“核微孔”膜(Nuclepore Filtration Proclucts,Costar Corp.,Cambridge,MA)。將10.0μm的過(guò)濾器安裝在Suin-Lok過(guò)濾架上并將蓋牢牢地壓緊。將脂質(zhì)體溶液振蕩起來(lái)并經(jīng)18號(hào)針轉(zhuǎn)移到200cc注射器中。將大約12ml的脂質(zhì)體溶液放入注射器中，并將注射器擰在Suin-Lok過(guò)濾架上。倒置安裝注射器和過(guò)濾架，這樣，大量氣體填充的脂質(zhì)體泡可以升至頂部。然后輕輕地上推注射器并用此方法來(lái)過(guò)濾氣體填充脂質(zhì)體。
經(jīng)過(guò)10.0μm過(guò)濾器壓出后的氣體填充脂質(zhì)體殘存率(擠壓過(guò)程后殘留的氣體填充脂質(zhì)體的量)為約83-92％。用手壓出前，泡沫的體積為約12ml。并且水溶液的體積約為4ml。用手壓出后，泡沫的體積約為10-11ml并且水溶液的體積約為4ml。
再次使用光學(xué)顯微鏡來(lái)測(cè)定擠壓的氣體填充脂質(zhì)體的大小分布。測(cè)得脂質(zhì)體最大的尺寸從約25到約30μm。并且可見(jiàn)的最小尺度約為5μm。平均大小范圍約8至約15μm。
發(fā)現(xiàn)過(guò)濾后，90％以上的氣體填充脂質(zhì)體小于15μm。實(shí)施例2冷凍干燥法制備氣體填充脂質(zhì)體將50mg的1,2-二棕櫚酰-Sn-甘油基-3-磷酸膽堿(分子量734.05，粉末)(Avanti-Polar Lipids,Al-abaster,AL)稱重并放入離心管中。然后用5.0ml的鹽溶液(0.9％NaCl)水合。并在6.5的儀器的沉降位置渦旋10分鐘。渦旋后，將全部溶液在液氮中冷凍。然后將樣品放列凍干器上冷凍干燥。將樣品在凍干器上保持18小時(shí)。將干燥的類(lèi)脂從凍干器上取下并在5ml的鹽溶液中再水合并在6.5的沉降位置渦旋10分鐘。用移液管取少量該溶液放到載玻片上并在顯微鏡下觀察。測(cè)定氣體填充脂質(zhì)體的大小。測(cè)得最大的脂質(zhì)體尺寸約為60μm并且可見(jiàn)的最小尺度約為20μm。平均大小從約30到約40μm。實(shí)施例3高于類(lèi)脂相變溫度下的氣體填充脂質(zhì)體制備的實(shí)例將50mg的1,2-二棕櫚酰-Sn-甘油基-3-磷酸膽堿(分子量734.05，粉)(Avanti-Polar Lipids,Alabaster,AL)稱重并放入離心管中。將大約2英尺的乳膠管(0.25英寸內(nèi)徑)象線圈一樣纏繞在錐形離心管周?chē)Ｈ缓笥秒娋€將乳膠管扎牢在離心管上。將乳膠管連接在恒溫循環(huán)水浴上(VWR Scientific Model 1131)。將水浴的溫度定在60℃并讓循環(huán)水高速環(huán)繞通過(guò)離心管。將溫度計(jì)放在類(lèi)脂物溶液中并可見(jiàn)在42°和50℃之間。
在6.5的渦旋儀沉降位置，將類(lèi)脂溶液渦流10分鐘。可以看到極小量的類(lèi)脂泡沫(相變溫度=41℃)不形成氣體填充脂質(zhì)體。光學(xué)顯微鏡展示了溶液中具有大量的類(lèi)脂顆粒。在此溫度下形成的氣體填充脂質(zhì)體的數(shù)量少于在低于相變溫度下形成的數(shù)量的3％。將溶液靜置15分鐘直到溶液溫度平衡到室溫(25℃)。然后將溶液渦旋10分鐘。10分鐘后，可見(jiàn)氣體填充脂質(zhì)體形成。實(shí)施例4冰凍-融化法制備氣體填充脂質(zhì)體將50mg的1,2-二棕櫚酰-Sn-甘油基-3-磷酸膽堿(分子量734.05，粉末)(Avanti-Polar Lipids,Al-abaster,AL)稱重并放入離心管中。然后用5.0ml 0.9％NaCl水合。在6.5的儀器沉降位置將類(lèi)脂的水溶液渦旋10分鐘。渦旋后，將全部溶液在液氮中冰凍。然后將全部溶液在室溫下(25℃)，在水浴中融化。將冰凍-融化過(guò)程重復(fù)8次。然后在6.5的儀器沉降位置，將水合的懸浮液渦旋10分鐘。然后可見(jiàn)如實(shí)施例1所述的氣體填充脂質(zhì)體。實(shí)施例5用乳化劑(十二烷基硫酸鈉)來(lái)制備氣體填充脂質(zhì)體準(zhǔn)備兩支離心管，每支含有50mg的DPPC。其中一只離心管中加入1摩爾％(約0.2mg的Duponol C批號(hào)2832)的十二烷基硫酸鈉，另一只加入10摩爾％(2.5mgDuponol C批號(hào)2832)。兩支離心管中分別加入5ml 0.9％NaCl。并在液氮中冰凍并凍干約16小時(shí)。從凍干器上取下兩樣品并分別加入5ml鹽水。在6.5的位置，將兩支管子渦旋10分鐘。
測(cè)得加1摩爾％十二烷基硫酸鈉的氣體填充脂質(zhì)體的最大尺寸為約75μm并且可見(jiàn)的最小尺寸為約6μm。平均大小約從15到40μm。測(cè)得加10摩爾％十二烷基硫酸鈉的氣體填充脂質(zhì)體的最大尺寸為約90μm并且可見(jiàn)的最小尺寸為約6μm。平均大小約從15到35μm。
在含1摩爾％十二烷基硫酸鈉的氣體填充脂質(zhì)體溶液中，其泡沫體積約為15ml并且其水溶液的體積約為3-4ml。在含10摩爾％十二烷基硫酸鈉的氣體填充脂質(zhì)體溶液中，其泡沫體積也約為15ml并且其水溶液的體積約為3-4ml。實(shí)施例6測(cè)定氣體填充的脂質(zhì)體是否可由聲處理產(chǎn)生將50mg的1,2-二棕櫚酰-Sn-甘油基-3-磷酸膽堿(A vanti-Polar Lipids,Alabaster,AL)稱重并用5ml0.9％NaCl水合。代替渦旋，用Heat Systems Sonicator Ul-trasonic Processor XL(Heat Systems,Inc.,Farming-dale,NY)Model XL 2020聲處理溶液。將頻率為20KHz的聲處理器調(diào)至其旋扭為4的位置并發(fā)出連續(xù)波。用管尖聲處理10分鐘。聲處理后，在光學(xué)顯微鏡下觀察溶液。沒(méi)有氣體填充脂質(zhì)體已經(jīng)產(chǎn)生的跡象。
接著，除去聲處理器的管尖并用聲處理器提供的尖帽代替。制備另一份溶液(每5ml鹽水中含50mg類(lèi)脂)并用這種管尖聲處理。10分鐘后，在光學(xué)顯微鏡下觀察溶液，仍無(wú)氣體填充脂質(zhì)體的跡象。實(shí)施例7測(cè)定濃度對(duì)氣體填充脂質(zhì)體產(chǎn)生的作用本實(shí)施例測(cè)定了低濃度限的類(lèi)脂是否會(huì)終止氣體填充脂質(zhì)體的產(chǎn)生。將10mg的1,2-二棕櫚酰-Sn-甘油基-3-磷酸膽堿(Avanti-Polar Lipids,Alabaster,AL)加到10ml鹽水中。在6.5位置將類(lèi)脂/鹽溶液渦旋10分鐘。在光學(xué)顯微鏡下觀察溶液來(lái)測(cè)量粒子大小。測(cè)得脂質(zhì)體最大的尺寸約為30至40μm并且可見(jiàn)的最小尺寸約為7μm平均大小從約30到約45μm。
氣體填充脂質(zhì)體似乎更易破碎，因?yàn)樗鼈冿@示遭受破裂比前面所述的更快。因此可見(jiàn)，類(lèi)脂的濃度是影響氣體填充脂質(zhì)體產(chǎn)生和穩(wěn)定性的因素。實(shí)施例8階式過(guò)濾將未過(guò)濾的氣體填充脂質(zhì)體吸入50ml注射器中并通過(guò)至少間隔150μm的階式“核微孔”10μm濾器和8μm濾器(圖3和4)。或者，例如，將樣品通過(guò)許多彼此緊密相連的10μm和8μm濾器來(lái)過(guò)濾。氣體填充脂質(zhì)體在流速為2.0ml/min的壓力下通過(guò)濾器。隨后測(cè)定過(guò)濾的氣體填充脂質(zhì)體中氣體填充類(lèi)脂脂質(zhì)體的產(chǎn)率，其得到未過(guò)濾體積的80-90％。
通過(guò)四種不同的測(cè)定脂質(zhì)體大小分布的方法來(lái)篩分產(chǎn)生的氣體填充脂質(zhì)體大小。用Particle Sizing Systems Mod-el 770,Optical Sizing unit,a Zeiss Axioplaen Optical mi-croscope in terfaced to image processing Software manfac-tured by Universal Imaging，和a Coulter Counter(CoultorElectronics Limited,Lutor,Beds.,England)進(jìn)行篩分。如圖5和6所見(jiàn)，與未過(guò)濾氣體填充脂質(zhì)體相比，該氣體填充脂質(zhì)體的大小更均勻地分布在8-10μm。因此可見(jiàn)，過(guò)濾的氣體填充脂質(zhì)體大小更均勻。實(shí)施例9制備過(guò)濾的DPPC懸浮液將250mg DPPC(二棕櫚酰磷脂酰膽堿)和10ml 0.9％NaCl加到50ml Falcon離心管中(Becton-dickinson,Lin-coln Park,NJ)并保持在室溫(約20℃)。在氮?dú)鈮毫ο?，將懸浮液壓出通過(guò)1μm核微孔(Costar,Pleasanton,CA)聚碳酸酯膜。在Particl Sizing Systems(Santa Barbara,CA)Model 370激光燈散射揀理器上篩分產(chǎn)生的懸浮液中粒子的大小。所有類(lèi)脂粒子平均外徑為1μm或更小。
另外，將相同量的DPPC懸浮液以18,000p.s.i.的壓力5次通過(guò)MicrofiuidicsTM(Microfluidics Corporation,Newton,MA)微流化器。將變得不太稠的懸浮液在ParticleSizing Systems(Santa Barbara,CA)Sub micron ParticleSizer,Model 370激光燈散射揀理器上篩分大小，可見(jiàn)粒子大小均勻地小于1μm。已知經(jīng)微流化懸浮液的粒子大小可保持穩(wěn)定6個(gè)月。實(shí)施例10制備過(guò)濾的DSPC懸浮液將100mgDSPC(二硬脂酰磷脂酰膽堿)和10ml 0.9％NaCl加到50ml Falcon離心管中(Becton Dickinson,,Lin-coln Park,NJ)。然后，在氮?dú)鈮毫ο?，?00-800 p.s.i的壓力將懸浮液壓出通過(guò)1μm“核微孔”(Costar,Pleasanton,CA)聚碳酸酯膜。產(chǎn)生的懸浮液在Particle Sizing Systems(Santa Barbara,CA)Sub Micron Partids Sizer Moelel 370激光燈散射揀理器上篩分大小。發(fā)現(xiàn)所有粒子的大小都為1μm或更小。
另外，將同樣量的DPPC懸浮液，以18,000p.s.i.的壓力5次通過(guò)MicrofiuidicsTM(Microfluidics Corporation,Newton,MA)微流化器。將變得不太稠的懸液在Sub Mi-cron Particle Sizer Systems Model 370激光燈散射揀理器上篩分大小并發(fā)現(xiàn)其大小均勻地小于1μm。實(shí)施例11通過(guò)壓熱器處理來(lái)進(jìn)行過(guò)濾的類(lèi)脂懸浮液的滅菌將前面實(shí)施例9和10篩分大小的DPPC和DSPC懸浮液在Barnsteadl Model C57835壓熱器(Barnsteadl/Ther-molyne,Dubuque,IA)中壓熱處理20分鐘。平衡到室溫后(約20℃)，用滅菌的懸浮液來(lái)滴注。實(shí)施例12經(jīng)渦旋將氣體滴注到過(guò)濾的在壓熱器中處理的類(lèi)脂中將先前已壓出通過(guò)1μm濾器和壓熱器處理20分鐘的，以25mg/ml量溶在0.9％NaCl中的10ml 1,3-二棕櫚酰磷脂酰膽堿溶液加到Falcon 50ml離心管中(Becton-Dickin-son,Lincoln Park,New Jersey)。將類(lèi)脂懸浮液平衡到室溫后(約20℃)，將液體在VWR Genie-2(120V,0.5安培，60Hz)(Scientific Industries Inc.,Bohemia,NY)上渦旋10分鐘或直到整個(gè)氣體填充脂質(zhì)體的容積至少為原類(lèi)脂水溶液體積的二倍或三倍。在離心管底部的溶液幾乎完全沒(méi)有無(wú)水的顆粒類(lèi)脂，并產(chǎn)生了較大容積的含氣體填充脂質(zhì)體的泡沫。因此，預(yù)先壓熱器處理不影響類(lèi)脂懸浮液形成氣體填充脂質(zhì)體的能力。壓熱器處理不改變脂質(zhì)體的大小并且不減小類(lèi)脂形成氣體填充脂質(zhì)體的能力。實(shí)施例13經(jīng)振蕩器搖床的振蕩，將氣體滴注到過(guò)濾的，經(jīng)壓熱器處理的類(lèi)脂中將前面擠壓通過(guò)1μm濾器并壓熱器處理20分鐘的，以26mg/ml量溶在0.9％NaCl中的10ml 1,2-二棕櫚酰磷脂酰膽堿溶液加到Falcon 50ml離心管中(Becton-Dickin-son,Lincoln Park,NJ)。類(lèi)脂懸浮液平衡到室溫后(約20℃)，將離心管垂直放在VMR Scientific Orbital振蕩器上(VMR Scientific,Cerritos,CA)并以300 r.p.m速度振蕩30分鐘。振蕩器搖床上產(chǎn)生的攪拌作用產(chǎn)生了氣體填充脂質(zhì)體。實(shí)施例14經(jīng)過(guò)用振搖器蕩床的振蕩和用油漆混合器的振蕩，將氣體滴注到過(guò)濾的，壓熱器處理的類(lèi)脂中將前面壓出通過(guò)1μm濾器并壓熱器處理20分鐘的，以25mg/ml量溶在0.9％NaCl中的10ml 1,2-二棕櫚酰磷脂酰膽堿溶液加到Falcon離心管中(Becton-Dickinson,Lincoln Park,NJ)。類(lèi)脂懸浮液平衡到室溫后(約20℃)，將離心管固定在1加侖空的家用油漆容器中并隨后放在機(jī)械油漆混合器中，回轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)15分鐘。強(qiáng)力混合后，取出離心管，并可見(jiàn)氣體填充脂質(zhì)體已形成。實(shí)施例15經(jīng)手振蕩，將氣體滴注到過(guò)濾的，經(jīng)壓熱器處理的類(lèi)脂中將前面壓出通過(guò)1μm核微孔濾器并壓熱器處理20分鐘的，以25mg/ml量溶在0.9％NaCl中的10ml 1,2-二棕櫚酰磷脂酰膽堿溶液加到Falcon 50ml離心管中(Becton-Dickinson,Lincoln Park,NJ)。類(lèi)脂懸浮液平衡到室溫后(約20℃)，用手用力振蕩離心管10分鐘。停止攪拌后，氣體填充的脂質(zhì)體形成。實(shí)施例16經(jīng)過(guò)階式或堆積濾器按大小過(guò)濾經(jīng)壓熱器處理的氣體填充脂質(zhì)體如實(shí)施例12所述，從DPPC可制備氣體填充脂質(zhì)體。將產(chǎn)生的未過(guò)濾的脂質(zhì)體吸入50ml注射器中并通過(guò)含“核微孔”(Coster,pleasanton,CA)10μm濾器和至少間隔150μm的8μm濾器的階式濾器系列。另外，在分離樣品時(shí)，可使用堆積在一起的10μm和8μm過(guò)濾集，這兩種濾器彼此緊密連接。氣體填充的脂質(zhì)體以使其過(guò)濾速度為2.0ml/min的壓力通過(guò)濾器。過(guò)濾的氣體填充脂質(zhì)體的容積為未過(guò)濾容積的80-90％。
通過(guò)4種不同的測(cè)定脂質(zhì)體大小分布的方法來(lái)篩分產(chǎn)生的氣體填充脂質(zhì)體的大小。用Particle Sizing Systems(Santa Barbara,CA)Model 770 Optical Sizing unit，和Zeiss(Oberkochen,Germany)Axioplan optical micro-scope interfaced to image processing software(UniversalImaging,West Chester,PA)和Coulter Counter(CoulterElectronics Limited,Luton,Beds.,Englanel)來(lái)篩分大小。如圖8所述，氣體填充脂質(zhì)體的大小與未過(guò)濾的氣體填充脂質(zhì)體相比更均勻地分布在8-10μm。
除了在此已描述的那些以外，本發(fā)明的各種改進(jìn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。這些改進(jìn)也將落入所附的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1．一種制備氣體填充的類(lèi)脂微球體的方法，此方法包括在氣體存在時(shí)，在低于類(lèi)脂的凝膠態(tài)到液晶態(tài)相轉(zhuǎn)變溫度下振蕩含有類(lèi)脂的水溶液。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中振蕩步驟包含渦旋。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中進(jìn)一步包含過(guò)濾和加熱消毒所述的類(lèi)脂水溶液。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中進(jìn)一步包含通過(guò)至少一種選擇的孔大小的濾器壓出過(guò)濾微球體。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中孔大小約為10μm或更小。
6．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中進(jìn)一步包含水合干燥類(lèi)脂，以形成含類(lèi)脂的水溶液。
7．一種制備氣體填充的類(lèi)脂微球體的方法，此方法包括在氣體存在時(shí)振蕩含類(lèi)脂的水溶液，分離所得的用于診斷或治療的氣體填充的類(lèi)脂微球體。
8．一種制造氣體填充的脂質(zhì)體微球體的方法，包括步驟為a)將含類(lèi)脂的水溶液引入容器；b)將氣體引入所述的容器；c)在所述的氣體存在時(shí)振蕩所述的類(lèi)脂水溶液以滴注至少一部分所述的氣體進(jìn)入水溶液中，在充分的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行所述振蕩以產(chǎn)生含有上述水溶液的氣體填充的脂質(zhì)體；和d)從所述的容器中提取至少一部分所述的含氣體填充的脂質(zhì)體泡沫。
9．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中進(jìn)一步包括冷卻所述的水溶液的步驟。
10．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中冷卻所述水溶液的步驟包括在低于在所說(shuō)水溶液中的所述類(lèi)脂凝膠態(tài)向液晶態(tài)相轉(zhuǎn)變的溫度下，冷卻所述的水溶液。
11．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，進(jìn)一步包括向所述的容器加壓的步驟。
12．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，進(jìn)一步包括篩分所述氣體填充的脂質(zhì)體大小的步驟。
13．根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中篩分所述氣體填充脂質(zhì)體大小的步驟包括控制從所述容器中提取的所述氣體填充的脂質(zhì)體的大小。
14．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中經(jīng)一濾器，通過(guò)提取所述的氣體填充的脂質(zhì)體控制從所述容器提取的所述氣體填充脂質(zhì)體的大小。
15．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，通過(guò)在所述容器內(nèi)固定位置，從中提取所述氣體填充的脂質(zhì)體，從而控制從所述容器提取的所述氣體填充的脂質(zhì)體的大小。
16．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中通過(guò)調(diào)整所述容器內(nèi)的位置控制從所述容器提取的所述氣體填充的脂質(zhì)體的大小，在從所述容器提取所述氣體填充的脂質(zhì)體步驟中，從此位置提取所述氣體填充的脂質(zhì)體。
17．根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中篩分所述氣體填充的脂質(zhì)體大小的步驟包括使所述提取的氣體填充的脂質(zhì)體通過(guò)濾器。
18．根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中篩分所述氣體填充的脂質(zhì)體的步驟包括控制所述振蕩的強(qiáng)度。
19．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，進(jìn)一步使從所述容器提取的所述氣體填充的脂質(zhì)體流入注射器而不進(jìn)一步處理的步驟。
20．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中振蕩所述水溶液的步驟包括在每分鐘至少約60次振動(dòng)的頻率下振蕩的步驟。
21．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中振蕩所述水溶液的步驟包括渦旋所述水溶液的步驟。
22．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中振蕩所述水溶液的步驟包括振蕩所述容器的步驟。
23．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中振蕩所述水溶液的步驟包括用充分的強(qiáng)度振蕩所述水溶液以在約不到30分鐘內(nèi)產(chǎn)生所述的含氣體填充的脂質(zhì)體泡沫的步驟。
24．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中振蕩所述水溶液的步驟包括根據(jù)測(cè)定所述的含氣體填充的脂質(zhì)體泡沫控制所述振蕩的持續(xù)時(shí)間的步驟。
25．根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中根據(jù)測(cè)定所述含氣體填充的脂質(zhì)體的泡沫控制所述振蕩的持續(xù)時(shí)間的步驟包括振蕩直至測(cè)定到所述泡沫的預(yù)測(cè)定的體積存在。
26．一種制造氣體填充的脂質(zhì)體的設(shè)備，包括a)一種容器；b)使含類(lèi)脂的水溶液進(jìn)入所述容器的裝置；c)使氣體進(jìn)入所述容器的裝置；和d)在所述容器內(nèi)滴注所述氣體進(jìn)入所述水溶液的裝置，因此在所述容器內(nèi)產(chǎn)生含氣體填充的脂質(zhì)體的泡沫。
27．根據(jù)權(quán)利要求26的設(shè)備，其中所述的引入類(lèi)脂水溶液的裝置包括引入干燥的類(lèi)脂進(jìn)入所述容器的裝置和引入水溶性介質(zhì)進(jìn)入所述容器的裝置。
28．根據(jù)權(quán)利要求27的設(shè)備，其中所述引入類(lèi)脂水溶液的裝置進(jìn)一步包括引入治療化合物進(jìn)入所述容器的裝置。
29．根據(jù)權(quán)利要求26的設(shè)備，其中所述滴注所述氣體進(jìn)入所述水溶液的裝置包括振蕩所述水溶液的裝置。
30．根據(jù)權(quán)利要求29的設(shè)備，其中所述振蕩所述水溶液的裝置包括振蕩所述容器的裝置。
31．根據(jù)權(quán)利要求29的設(shè)備，其中振蕩所述水溶液的裝置包括渦旋所述水溶液的裝置。
32．根據(jù)權(quán)利要求26的設(shè)備，進(jìn)一步包括冷卻所述水溶液的裝置。
33．根據(jù)權(quán)利要求26的設(shè)備，進(jìn)一步包括從所述的容器中提取所述的泡沫的裝置。
34．根據(jù)權(quán)利要求33的設(shè)備，其中從所述的容器提取所述泡沫的裝置包括調(diào)節(jié)垂直位置的裝置，在此位置，從所述容器中提取所述泡沫。
35．根據(jù)權(quán)利要求33的設(shè)備，其進(jìn)一步包括使所述提取的氣體填充的脂質(zhì)體流過(guò)濾器裝配的裝置。
36．根據(jù)權(quán)利要求35的設(shè)備，其中所述濾器裝配包括分別占居預(yù)先確定距離的第一和第二濾器。
37．根據(jù)權(quán)利要求26的設(shè)備，進(jìn)一步包含篩分所述氣體填充的脂質(zhì)體的大小的裝置。
38．根據(jù)權(quán)利要求26的設(shè)備，進(jìn)一步包括和所述容器相流通的濾器。
39．根據(jù)權(quán)利要求26的設(shè)備，進(jìn)一步包括加壓所述容器的裝置。
40．根據(jù)權(quán)利要求26的設(shè)備，進(jìn)一步包括抽吸從所述容器中產(chǎn)生的所述氣體填充的脂質(zhì)體在不進(jìn)一步處理情況下全部進(jìn)入注射器的裝置。
41．通過(guò)凝膠態(tài)振蕩氣體滴注方法制備的氣體填充的脂質(zhì)體。
42．權(quán)利要求10的方法進(jìn)一步包括加壓所述容器的步驟。
43．根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中冷卻所述水溶液的步驟包括在低于所述水溶液中所述類(lèi)脂從凝膠向液晶相轉(zhuǎn)變溫度下冷卻所述水溶液。
44．根據(jù)權(quán)利要求43的方法，進(jìn)一步包括加壓所述容器的步驟。
45．權(quán)利要求41的氣體填充的脂質(zhì)體包括至少一種選自以下的類(lèi)脂，包括二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、和磷脂酸和所述的脂質(zhì)體進(jìn)一步包括聚乙二醇。
46．權(quán)利要求41的氣體填充的脂質(zhì)體至少包括一種二棕櫚酰類(lèi)脂。
47．權(quán)利要求41的氣體填充的脂質(zhì)體，其相轉(zhuǎn)變溫度高于約20℃。
48．在權(quán)利要求8的方法中，其中所述的容器是一個(gè)注射器套管，所述的注射器也至少包括一個(gè)濾器和一個(gè)針頭；所述的提取步驟包括通過(guò)從所述套管內(nèi)通過(guò)一個(gè)濾器壓出所述的脂質(zhì)體，篩分所述氣體填充的脂質(zhì)體的大小。
49．權(quán)利要求8的方法，其中所述的容器是一個(gè)注射器套管。
50．權(quán)利要求49的方法，其中所述的注射器也包括至少一個(gè)濾器和一個(gè)針頭；所述提取的步驟包括于所述套管內(nèi)通過(guò)一個(gè)濾器壓出所述脂質(zhì)體篩分所述氣體填充的脂質(zhì)體的大小。
51．權(quán)利要求17的方法，包括抽吸所述脂質(zhì)體進(jìn)入注射器，所述注射器包含一個(gè)套管、至少一個(gè)濾器及一個(gè)針頭；一旦抽吸所述脂質(zhì)體進(jìn)入所述的套管內(nèi)，所述濾器就篩分所述脂質(zhì)體的大小。
52．權(quán)利要求8的方法，包括壓出所述的脂質(zhì)體進(jìn)入一個(gè)注射器套管，所述注射器也至少包括一個(gè)濾器和一個(gè)針頭；一旦從所述套管內(nèi)壓出所述的脂質(zhì)體，所述濾器就對(duì)所述脂質(zhì)體的大小進(jìn)行篩分。
53．權(quán)利要求8的方法，其中所述的提取步驟包括抽吸含所述含氣體填充的脂質(zhì)體的泡沫進(jìn)入注射器，所述注射器包括一個(gè)套管、至少一個(gè)濾器及一個(gè)針頭；由此篩分所述脂質(zhì)體的大小。
54．權(quán)利要求33的設(shè)備，其中所述的容器是一個(gè)注射器套管，所述注射器也包至少含一個(gè)濾器和一個(gè)針頭；所述的提取裝置包括于所述套管內(nèi)通過(guò)一個(gè)濾器壓出所述脂質(zhì)體篩分所述氣體填充脂質(zhì)體大小的裝置。
55．權(quán)利要求26的設(shè)備，其中所述的容器是一個(gè)注射器套管。
56．權(quán)利要求55的設(shè)備，其中所述的注射器也包含至少一個(gè)濾器和一個(gè)針頭；進(jìn)一步包括在所述套管內(nèi)通過(guò)一個(gè)濾器壓出所述脂質(zhì)體篩分所述氣體填充脂質(zhì)體大小的裝置。
57．權(quán)利要求26的設(shè)備，其中所述容器是一個(gè)注射器套管，所述注射器也至少包括一個(gè)濾器和一個(gè)針頭；這里所述的濾器是抽吸所述脂質(zhì)體進(jìn)入所述套管篩分所述脂質(zhì)體大小的裝置。
58．權(quán)利要求33的設(shè)備，其中所述的容器是一個(gè)注射器套管，所述注射器也包含至少一個(gè)濾器和一個(gè)針頭；其中濾器是于所述的套管壓出所述的脂質(zhì)體篩分所述脂質(zhì)體大小的裝置。
59．權(quán)利要求33的設(shè)備，其中所述提取裝置包括抽取所述含氣體填充的脂質(zhì)體泡沫的進(jìn)入注射器的裝置，所述注射器包含一個(gè)套管、至少一個(gè)濾器及一個(gè)針頭；由此篩分所述脂質(zhì)體的大小。
60．一種氣體填充的脂質(zhì)體設(shè)備，包括一個(gè)裝有套管的注射器、濾器裝配及一個(gè)針頭，所述濾器裝配在所述套管和所述針頭之間接合相配，并含至少一個(gè)濾器，所述套管含通過(guò)凝膠態(tài)振蕩氣體滴注法制備的氣體填充的脂質(zhì)體。
61．權(quán)利要求60的設(shè)備，其中所述濾器裝配是一個(gè)階式的濾器裝配，含第一級(jí)濾器，有一個(gè)側(cè)對(duì)針頭和一個(gè)側(cè)對(duì)套管，第二級(jí)濾器，在所述的第一級(jí)濾器的所述的側(cè)對(duì)針頭和所述的側(cè)對(duì)套管分別有第一和第二金屬網(wǎng)盤(pán)，在第二金屬網(wǎng)盤(pán)和所述第二濾器間有一O型環(huán)，其中所述第二濾器于所述第一濾器的側(cè)對(duì)套管占居約150μm的空間。
62．權(quán)利要求61的設(shè)備，所述第一濾器和所述第二濾器有孔，所述第二濾器有約10μm的孔，所述第一濾器有一大小約為8μm的孔。
63．權(quán)利要求60的設(shè)備，其中所述濾器有孔，所述孔有約30nm-約20μm大小范圍的孔。
64．權(quán)利要求60的設(shè)備，其中所述濾器有孔，所述孔的大小約為8μm。
65．權(quán)利要求58的設(shè)備，有第一濾器和一第二濾器，所述第一濾器和第二濾器有孔，所述第二濾器孔的大小約為10μm，所述第一濾器孔的大小為8μm。
66．權(quán)利要求58的設(shè)備，其中所述濾器有孔，所述孔大小范圍為約30nm-約20μm。
67．權(quán)利要求58的設(shè)備，其中所述濾器有孔，所述孔的大小約為8μm。
68．權(quán)利要求59的設(shè)備，有第一濾器和第二濾器，所述第一濾器和所述第二濾器有孔，所述第二濾器孔的大小約為10μm，所述第一濾器孔的大小約為8μm。
69．權(quán)利要求59的設(shè)備，所述濾器有孔，所述孔的大小范圍為約30nm-20μm。
70．權(quán)利要求59的設(shè)備，其中所述濾器有孔，所述孔的大小約為8μm。
71．權(quán)利要求1的方法，在高于環(huán)境壓力下進(jìn)行。
72．權(quán)利要求7的方法，在高于環(huán)境壓力下進(jìn)行。
73．權(quán)利要求41的氣體填充的脂質(zhì)體，使用時(shí)用噴霧器，所述的脂質(zhì)體靶定位在肺上。
74．權(quán)利要求41的氣體填充的脂質(zhì)體，含有二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺，所述脂質(zhì)體進(jìn)一步包含聚乙二醇。
全文摘要
描述了制備氣體填充的脂質(zhì)體的方法和設(shè)備。通過(guò)這些方法制備的氣體填充的脂質(zhì)體特別有用,例如,用于超聲顯像和治療藥物傳送系統(tǒng)。
文檔編號(hào)A61M5/31GK1215986SQ94192405
公開(kāi)日1999年5月5日 申請(qǐng)日期1994年5月19日 優(yōu)先權(quán)日1993年6月11日
發(fā)明者艾文C·安格爾, 托馬斯A·弗里茲, 特里·馬斯安納格, 瓦瑞德瑞簡(jiǎn)·拉馬斯瓦米, 大衛(wèi)·耶柔赫爾, 吳冠禮 申請(qǐng)人:ImaRx藥物公司, 托馬斯A·弗里茲, 特里·馬斯安納格