專利名稱：聚乙二醇-干擾素結(jié)合物的制作方法
許多天然的和重組的蛋白質(zhì)都具有醫(yī)療和醫(yī)藥效用。一旦被純化并制成制劑，它們能夠?qū)Ω鞣N臨床適應(yīng)征進(jìn)行非腸道使用。然而，非腸道使用的蛋白質(zhì)可能具有免疫原性，可能相對(duì)來(lái)說(shuō)不易溶于水也可能藥理半壽期短。結(jié)果，病人體內(nèi)的蛋白質(zhì)很難達(dá)到有效治療的血液水平。
這些問(wèn)題可通過(guò)將蛋白質(zhì)同聚合物(如聚乙二醇)結(jié)合來(lái)克服。Davis等人在美國(guó)專利4，179，337中公開(kāi)了將聚乙二醇(PEG)結(jié)合到蛋白質(zhì)(如酶和胰島素)上，從而得到其中蛋白質(zhì)免疫原性較低，但能保持大部分生理活性的結(jié)合物。Nakagawa等人公開(kāi)了將PEG結(jié)合到小島活化蛋白質(zhì)上以減少其副作用和免疫原性。Veronese等人在Applied Biochem.and Biotech，11141-152(1985)上公開(kāi)了用氯甲酸苯酯類來(lái)活化聚乙二醇以修飾核糖核酸酶和超氧化物歧化酶。Katre等人在美國(guó)專利4，766，106和4，917，888上也公開(kāi)了通過(guò)聚合物結(jié)合使蛋白質(zhì)增溶。將PEG和其它聚合物同重組蛋白質(zhì)結(jié)合以減弱蛋白質(zhì)的免疫原性和提高它們的半壽期。參見(jiàn)Nitecki等人的美國(guó)專利4，902，502;Enzon公司的國(guó)際申請(qǐng)PCT/US90/03133;Nishimura等人的歐洲專利申請(qǐng)154，316;Tomasi的國(guó)際申請(qǐng)PCT/US85/02572。
以往形成PEG/蛋白質(zhì)結(jié)合物的方法以及由所述方法得到的結(jié)合物存在幾個(gè)問(wèn)題。其一是形成這些蛋白質(zhì)-PEG結(jié)合物的某些方法可以使蛋白質(zhì)失活，從而使得到的結(jié)合物的生物活性可能較差。另外，在形成這些PEG-蛋白質(zhì)結(jié)合物時(shí)所用的某些連接劑可能易在體內(nèi)水解斷開(kāi)。當(dāng)給藥以后發(fā)生這樣的斷裂時(shí)，這些結(jié)合物便失去了由PEG帶來(lái)的有利性能。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是由獨(dú)特的連接劑將干擾素(IFN)的氨基連接到PEG上的新型干擾素-PEG結(jié)合物。本發(fā)明特別涉及通式Ⅰ的具有生物活性的干擾素結(jié)合物
其中R為低級(jí)烷基;R1、R2、R3和R4為H或低級(jí)烷基;
m選自≥1的整數(shù)到干擾素中可及的氨基的數(shù)目;
W為O或NH;
x為1-1000之間的整數(shù)，y和z為0-1000之間的整數(shù)，x、y和z三者之和為3-1000;
附帶條件是R1、R2、R3和R4中至少有一個(gè)是低級(jí)烷基。
式Ⅰ中的-NH-基團(tuán)由干擾素分子中可及的氨基衍生而來(lái)的，這一點(diǎn)是不言而喻的。
更具體地說(shuō)，兩種不同的干擾素結(jié)合物具有下列化學(xué)式
其中R為低級(jí)烷基;R1、R2、R3和R4為H或低級(jí)烷基;m為最大可到干擾素中可及氨基數(shù)的數(shù)字;x、y和z選自使結(jié)合物具有形成結(jié)合物的蛋白質(zhì)的至少一部分生物活性的任意數(shù)字組合;附帶條件是，R1、R2、R3和R4中至少有一個(gè)是低級(jí)烷基。


圖1用實(shí)施例7的化合物進(jìn)行PEG修飾的時(shí)間進(jìn)程。干擾素(5mg/ml)與相對(duì)于蛋白質(zhì)過(guò)量10倍、20倍或40倍的試劑一起在25mM Tricine(pH 10.0)、0.5M KSCN、100 mM NaCl中保溫所示時(shí)間。在不同時(shí)刻取等分試樣，用甘氨酸停止反應(yīng)，在15% SDS-PAGE凝膠上分析。標(biāo)記“Ⅰ”為干擾素。
圖2用實(shí)施例5的化合物進(jìn)行PEG修飾的時(shí)間進(jìn)程。象圖1中那樣，干擾素與過(guò)量3倍或10倍的試劑一起保溫所示的時(shí)間。在所示時(shí)刻取等分試樣，用甘氨酸停止反應(yīng)，在15% SDS-PAGE凝膠上分析?！癝”為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物的標(biāo)記，“Ⅰ”為干擾素的標(biāo)記。
圖3用實(shí)施例1(左側(cè))和實(shí)施例3(右側(cè))的化合物進(jìn)行PEG修飾的比較。干擾素與3倍過(guò)量的試劑一起保溫0.25、1.5或24小時(shí)。取出等分試樣，用甘氨酸停止反應(yīng)并在15% SDS-PAGE凝膠上分析?！癝”為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物的標(biāo)記，“Ⅰ”為干擾素的標(biāo)記。
按照本發(fā)明，式ⅠA和式ⅠB的IFN結(jié)合物可如下制得使末端羥基或氨基已被活化的連接基團(tuán)取代的活化PEG縮合，然后，這些試劑可與IFN中的一個(gè)或更多個(gè)氨基反應(yīng)。只同一個(gè)氨基縮合形成單PEG化的結(jié)合物是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。所以，本發(fā)明也涉及那些可用來(lái)制備本發(fā)明的干擾素結(jié)合物的新型活化化合物(試劑)。這些化合物具有下列通式
其中R為低級(jí)烷基;R1、R2、R3、R4和R5為H或低級(jí)烷基;
W為NH或O;
x為1-1000的整數(shù)，y和z為0-1000的整數(shù)，x、y和z三者之和為3-1000;
附帶條件是，假如W為NH或W為O，R5為H，則R1、R2、R3和R4中至少有一個(gè)為低級(jí)烷基;
其中，R為低級(jí)烷基;R1、R2、R3和R4為H或甲基;x為1-1000的整數(shù)，y和z為0-1000的整數(shù)，x、y和z三者之和為3-1000。
更具體地說(shuō)，式Ⅱ包括下列兩種類型的化合物
在ⅡA、ⅡB和Ⅲ中，R、R1、R2、R3、R4和R5均如上所述;x、y和z選自能使聚合物在同蛋白質(zhì)結(jié)合后允許蛋白質(zhì)保持至少一部分結(jié)合前生物活性水平的任何數(shù)字組合;加上式Ⅱ中所提到的附帶條件。
按照本發(fā)明，通過(guò)使用式ⅡA、ⅡB或Ⅲ的活化的PEG試劑制備結(jié)合物，在蛋白質(zhì)(如干擾素(IFN)的游離氨基和PEG之間形成了一個(gè)連鍵，使所得的結(jié)合物保持了蛋白質(zhì)的至少一部分生物活性，但免疫原性降低。另外，通過(guò)使用式ⅡA、ⅡB或Ⅲ中的任何一種活化的聚乙二醇而在本發(fā)明結(jié)合物中形成的連接基團(tuán)，使所得的蛋白質(zhì)結(jié)合物不易在體內(nèi)水解斷開(kāi)，也不易出現(xiàn)先有技術(shù)PEG蛋白質(zhì)結(jié)合物中所存在的缺點(diǎn)。
按照本發(fā)明，R、R1、R2、R3、R4和R5可以是低級(jí)烷基，優(yōu)選甲基。低級(jí)烷基指含1-6個(gè)碳原子的低級(jí)烷基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基等。通常，優(yōu)選的烷基是含1-4個(gè)碳原子的低級(jí)烷基，其中甲基是最優(yōu)選的。R1、R2、R3、R4和R5也可以是氫，但R1、R2、R3和R4不能同時(shí)為氫。
按照本發(fā)明，x、y和z可以選自能使所得結(jié)合物保持形成結(jié)合物的IFN的至少一部分生物活性的任何數(shù)字組合。顯然，x、y和z的總和以及m與結(jié)合物所保持的IFN生物活性量成反比。x、y和z的數(shù)值代表形成結(jié)合物的聚乙二醇中的二醇單元數(shù)。m代表IFN中包含的能與活化的PEG混合物反應(yīng)的游離氨基或可及氨基數(shù)。m以及x、y和z的值越大，結(jié)合物的分子量越大。按照本發(fā)明，x、y和z是使除了蛋白質(zhì)部分以外的結(jié)合物分子量在約300-30，000道爾頓的任何數(shù)字。對(duì)于IFN，m優(yōu)選1-3。一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案是m為1的單PEG化的結(jié)合物，它的制備條件能夠以高收率得到IFN中僅有一個(gè)游離氨基同式ⅡA或ⅡB或Ⅲ的PEG試劑反應(yīng)的IFN結(jié)合物。按照m為1的優(yōu)選實(shí)施方案，x、y和z是使形成結(jié)合物的二醇的平均分子量為大約300-30，000道爾頓，優(yōu)選大約1，000-10，000道爾頓，尤其是大約1，000-5，000道爾頓的任何數(shù)字。特別優(yōu)選的實(shí)施方案是分子量大約為2，000道爾頓。
至于單元數(shù)x、y和z，x為1-1000的整數(shù)，y和z為0-1000的整數(shù)，x、y和z三者之和為3-1000。
在式ⅠA的ⅠB結(jié)合物的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，x和y為5-500，z為0-4。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的二醇是一個(gè)二醇混合物，其中x為10-100，y為1-10，z為0。最優(yōu)選的是式ⅠA的干擾素結(jié)合物，其中m為1，R、R2和R4為CH3;R1為H;x大約為19，y大約為2，z為0。這對(duì)應(yīng)于PEG單元的平均分子量約為1000道爾頓。
為了避免有關(guān)PEG分子中單元數(shù)的任何疑問(wèn)，聚乙二醇聚合物用分子量表征優(yōu)于指出PEG聚合物中用x、y和z來(lái)表示的自重復(fù)單元(SRU)數(shù)。這些數(shù)值由于起始PEG化合物的潛在不均一性而可能難于估計(jì)，因?yàn)檫@些起始PEG化合物通常由平均分子量定義而不是由它們所含的自重復(fù)單元數(shù)定義。不同分子量的起始PEG化合物可由本領(lǐng)域已知的方法制得或由供應(yīng)商處購(gòu)得。
假如由分子量測(cè)定得到的或由供應(yīng)商標(biāo)示的x、y和z值不是整數(shù)(一般是這種情況)，它們的值則必須按常用方法取舍而化為整數(shù)，從而使可能構(gòu)成聚合物混合物的主要部分的聚合物分子中的上述數(shù)值為整數(shù)。
式ⅡA、ⅡB或Ⅲ中的任何一個(gè)試劑同含一個(gè)以上游離氨基的IFN反應(yīng)時(shí)，可能得到IFN同PEG試劑混合物的不同反應(yīng)產(chǎn)物的混合物。這些反應(yīng)產(chǎn)物是由于PEG試劑同一個(gè)或更多個(gè)游離氨基反應(yīng)而形成的。這可由式ⅠA和ⅠB中的m表示。例如，當(dāng)IFN含有三個(gè)游離氨基時(shí)，活化的PEG試劑可同其中的一個(gè)、二個(gè)或所有三個(gè)游離氨基反應(yīng)。這種情形下，混合物包含所有三種情況下所形成的結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物。由于這個(gè)混合物中的不同結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物依m(xù)值的不同(即1、2或3)而具有大不相同的分子量，這些反應(yīng)產(chǎn)物可用傳統(tǒng)方法(如色譜法)分離。為確定m以及x、y和z是否選取適當(dāng)，分離的結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物可用與篩選IFN母體同樣的方法篩選有生物活性的結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物，從而確定結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物是否仍保持了用未形成結(jié)合物的IFN的一部分生物活性。
按照優(yōu)選的實(shí)施方案，m為1。即使有兩個(gè)或更多個(gè)游離氨基也能得到m為1的結(jié)合物?；罨腜EG試劑首先同IFN中包含的游離氨基之一發(fā)生反應(yīng)。通過(guò)控制試劑(如IFN)的濃度和反應(yīng)條件，按照胺縮合的標(biāo)準(zhǔn)方法，可控制蛋白質(zhì)中包含的游離氨基的聚乙二醇化程度。在包含一個(gè)或更多個(gè)游離氨基的蛋白質(zhì)中，若有一個(gè)游離氨基較其它氨基活潑，可選擇反應(yīng)條件使蛋白質(zhì)同活化的PEG化合物反應(yīng)以形成m為1的式ⅠA或ⅠB化合物。形成蛋白質(zhì)的氨基酸中所含的其它游離氨基可通過(guò)延長(zhǎng)縮合反應(yīng)時(shí)間或利用其它更劇烈的反應(yīng)條件進(jìn)一步同PEG反應(yīng)。
本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中所用的術(shù)語(yǔ)干擾素和IFN包括所有類型的干擾素(即具有干擾素活性的分子)，例如，α、β、γ和ω干擾素以及這些類型的所有亞類，如α1、α2、α2A、α2B或α2C以及不同類型和/或亞類干擾素的雜種分子或嵌合體。干擾素可以是任何來(lái)源的，可以從天然來(lái)源、組織培養(yǎng)或由重組DNA技術(shù)得到。制備或分離天然或重組干擾素的方法在本領(lǐng)域中是公知的，并在如下公開(kāi)號(hào)的專利申請(qǐng)中有所描述EP43980、EP211148、EP140127、DE3028919、USP4503035和USP4414150。
使用R1、R2、R3和R4中至少有一個(gè)為低級(jí)烷基尤其是甲基的式ⅡA、ⅡB和Ⅲ的試劑(烷基取代試劑)，其優(yōu)點(diǎn)在于當(dāng)用烷基取代試劑時(shí)，同相應(yīng)的非取代試劑相比可以出人意料地提高結(jié)合物即PEG化蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。在相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，烷基取代試劑同相應(yīng)的非取代試劑相比，制備結(jié)合物時(shí)，前者可得到至少兩倍量的結(jié)合物。
當(dāng)給予病人由上述的取代試劑制備的式ⅠA和ⅠB結(jié)合物用于治療時(shí)，這些結(jié)合物同由相應(yīng)的非取代試劑制備的結(jié)合物相比，在病人血流中的體內(nèi)半壽期意外地提高。雖然體內(nèi)半壽期同結(jié)合物的分子量成正比，由取代試劑制得的結(jié)合物出人意料地同由非取代試劑制得的較高分子量的結(jié)合物具有同樣長(zhǎng)的半壽期。治療劑在病人血流中的半壽期較長(zhǎng)能提高對(duì)病人給藥的效率。例如，由烷基取代試劑制得的結(jié)合物可以比由相應(yīng)的非取代試劑制得的結(jié)合物給藥次數(shù)少，或者用量較少。為了提高同聚乙二醇結(jié)合的生物活性蛋白質(zhì)的給藥效率，形成這些蛋白質(zhì)結(jié)合物時(shí)使用了較高分子量的聚乙二醇。然而，結(jié)合的活性IFN的生物效能隨分子量增大而減小。但是，通過(guò)使用本發(fā)明的由取代試劑制得的結(jié)合物，相對(duì)于使用相應(yīng)的非取代結(jié)合物提高了給藥效率，但分子量增加較少。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明也涉及制備新型結(jié)合物的方法。
式ⅠA的結(jié)合物可如下制備
其中，R、R1、R2、R3、R4和R5，m和x、y和z同上;附帶條件是R1、R2、R3、R4中任何一個(gè)或更多個(gè)都可以是低級(jí)烷基。
在這一反應(yīng)中，PEG-胺在烴或氯代烴溶劑中同式Ⅳ化合物混合以制備式ⅡA化合物。式ⅡA化合物可在水性介質(zhì)中同蛋白質(zhì)的一個(gè)或更多個(gè)游離氨基縮合以制備式ⅠA的結(jié)合物。這個(gè)反應(yīng)可在水性介質(zhì)中胺縮合的常規(guī)條件下進(jìn)行。該反應(yīng)通常在pH 7-10的標(biāo)準(zhǔn)緩沖水溶液中進(jìn)行，以制備式ⅠA的結(jié)合物。依蛋白質(zhì)中的游離氨基數(shù)和反應(yīng)時(shí)間而定，該反應(yīng)可制備不同分子量的PEG蛋白質(zhì)結(jié)合物的混合物。PEG蛋白質(zhì)結(jié)合物接下來(lái)可用常規(guī)方法如高效液相色譜(HPLC)或凝膠電泳法分出各個(gè)組分。用HPLC或凝膠電泳法依分子量來(lái)分離化合物的任何常規(guī)方法均可使用。這個(gè)混合物的分離可按照本文所述的所得產(chǎn)物的分子量來(lái)進(jìn)行。
式ⅠB的IFN結(jié)合物可按下列反應(yīng)路線來(lái)制備
其中，R、R1、R2、R3、R4、R5、m、x、y、z和附帶條件均如上所述。
式Ⅳ化合物由光氣和2-羥基吡啶(當(dāng)R5為低級(jí)烷基時(shí)為取代的2-羥基吡啶)用酰鹵和醇縮合的任何常規(guī)方法制備。
PEG醇同式Ⅳ化合物的縮合利用醇和碳酸酯縮合的常規(guī)條件進(jìn)行以制備式ⅡB化合物。式ⅡB化合物通過(guò)蛋白質(zhì)上的一個(gè)或更多個(gè)游離氨基同蛋白質(zhì)縮合，以制備式ⅠB化合物。該反應(yīng)可按照上述的式ⅡA化合物縮合制備式ⅠA結(jié)合物的方法進(jìn)行。依蛋白質(zhì)中與式ⅡB化合物發(fā)生反應(yīng)的游離氨基數(shù)的不同，式ⅠB的結(jié)合物可由不同分子量結(jié)合物的混合物組成。該結(jié)合物混合物可用前面描述過(guò)的方法來(lái)分離。
式ⅠB化合物也可用如下反應(yīng)路線來(lái)制備
其中，R、R1、R2、R3、R4、R5、m、x和y均如上所述。
在該反應(yīng)路線中，PEG-醇同式Ⅳ化合物縮合以制備式Ⅲ化合物。在該反應(yīng)中，式ⅡB化合物作為中間產(chǎn)物形成之后與另一摩爾的PEG-醇反應(yīng)生成式Ⅲ化合物。在該反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，PEG-醇的用量至少為每摩爾式Ⅳ化合物用2摩爾PEG-醇。在這一步驟中，醇同碳酸酯縮合的任何常規(guī)方法均可使用。式Ⅲ化合物同干擾素反應(yīng)形成式ⅠB結(jié)合物是按照上述的式ⅡA化合物轉(zhuǎn)化為式ⅠA化合物的方法進(jìn)行的。依蛋白質(zhì)所含的游離氨基數(shù)，式Ⅲ化合物同蛋白質(zhì)縮合得到各種結(jié)合物的混合物，該混合物可用前面描述的分離式ⅠA結(jié)合物的方法分離成各個(gè)組分。
按照本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的干擾素結(jié)合物同用于形成結(jié)合物的蛋白質(zhì)具有同樣的效用。這樣，這些結(jié)合物同形成它們的蛋白質(zhì)具有相同形式的治療活性，可以按與蛋白質(zhì)本身相同的方式使用，而不會(huì)產(chǎn)生在給予病人蛋白質(zhì)本身時(shí)可能引起的不良免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明也包括以式Ⅰ化合物或其鹽為主要成分的藥物組合物以及制備這些組合物的方法。
本發(fā)明用來(lái)控制或預(yù)防疾病的藥物組合物包括通式Ⅰ的干擾素組合物和治療惰性的、治療上可接受的無(wú)毒的載體物質(zhì)。欲使用的藥物組合物可制成制劑，并按與合適的醫(yī)療慣例一致的方式給藥，并應(yīng)考慮所要治療的疾病、病人的個(gè)體狀況、蛋白質(zhì)結(jié)合物的釋放部位、給藥方法以及操作者已知的其它因素。
下述實(shí)施例代表本發(fā)明的說(shuō)明性實(shí)施方案，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。
在這些實(shí)施例中所用的Jeffamine M-2070 是由環(huán)氧丙烷和環(huán)氧乙烷衍生而來(lái)的、平均分子量為2070的單甲氧基聚氧化烯丙胺聚合物，其骨架由聚乙二醇組成，并平均包含30%無(wú)規(guī)結(jié)合的環(huán)氧丙烷基團(tuán)。
Jeffamine M-1000 是平均分子量為1000的單甲氧基聚氧化烯丙胺聚合物，它由環(huán)氧丙烷和環(huán)氧乙烷衍生而來(lái)，其骨架由聚乙二醇組成，并包含14%專一性結(jié)合的環(huán)氧丙烷基團(tuán)，其中x平均為18.6，y平均為1.6，z為0(這里所用的x、y和z的意義如上所述)。
這些實(shí)施例中所用的所有試劑均在4℃下于棕色瓶中干燥貯存?zhèn)溆?。每次修飾反?yīng)都使用新鮮的等分試劑。
實(shí)施例實(shí)施例1α，α′-氧亞甲基雙[ω-甲氧基聚(氧-1，2-亞乙基)]SRU111的制備從含1.5克MPEG(甲氧基聚乙二醇，分子量為5000)的80ml干燥甲苯的懸浮液中蒸去50ml溶劑。溶液冷卻后加入30.5mg碳酸二-2-吡啶酯。然后將得到的混合物回流24小時(shí)。將溶液冷卻，得到的沉淀過(guò)濾后，先用少量甲苯洗滌，再用乙醚洗滌，得到的固體在高真空下干燥得到0.6克α，α′-氧亞甲基雙[ω-甲氧基聚(氧-1，2-亞乙基)]SRU111白色粉末。經(jīng)PEG修飾的干擾素由下述的方法1制備。
經(jīng)PEG修飾的干擾素-α的制備方法1濃度為每ml 5g蛋白質(zhì)的重組干擾素-α在含5mM乙酸鈉(pH5.0)、120 mM NaCl的緩沖液中滲析。加入硫氰酸鉀達(dá)最后濃度為0.5M，加入1/10體積pH11.9的1M Tricine-氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值，得到最終pH為10.0的溶液。PEG試劑以固體或DMSO溶液(DMSO的體積小于總體積的10%)形式按3∶1摩爾比加入到蛋白質(zhì)中。在室溫下進(jìn)行修飾反應(yīng)30分鐘到4小時(shí)，然后加入1ML-甘氨酸(pH6.3)到最后濃度為20mM以終止進(jìn)一步的修飾。加入3.5M硫酸銨、50mM磷酸鈉，pH7.0，使硫酸銨的最后濃度達(dá)到1.1M(對(duì)于PEG-1000為1.0M硫酸銨)，使經(jīng)PEG修飾的蛋白質(zhì)沉淀，沉淀經(jīng)離心收集，洗滌后再溶于pH5.0的25mM乙酸銨中。經(jīng)PEG修飾的蛋白質(zhì)在疏水交換柱(如75×7.5mm)如BioRad TSK Phenyl-5-PW或Toyopearl Phenyl-650 M上用色譜法純化，使用pH7.0的50mM磷酸鈉溶液中硫酸銨濃度遞減的梯度。另一種方法是，PEG-IFN在用25mM乙酸鈉(pH5.0)、200mM NaCl平衡的Sephacryl S-200柱(如90cm×3.2cm柱)(Pharmacia)上進(jìn)行凝膠過(guò)濾純化。經(jīng)PEG修飾的蛋白質(zhì)用SDS-PAGE鑒定。從柱中洗脫出相應(yīng)于結(jié)合有一個(gè)PEG(PEG1-IFN)或兩個(gè)PEG(PEG2-IFN)的IFN的蛋白質(zhì)，合并這些蛋白質(zhì)并濃縮后，通過(guò)測(cè)定280nm處的光吸收或用比色分析法(Pierce)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。PEG-IFN在4℃下于含50mM磷酸鈉(pH7.0)、0.3M硫酸銨的緩沖液中貯存。
方法2大約6mg/ml蛋白質(zhì)濃度的干擾素α-2a用5mM乙酸鈉(pH5.0)、0.12M氯化鈉滲析。以1.0mg-1ml為消光系數(shù)測(cè)定280nm處的光吸收，以此來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)溶液以蛋白質(zhì)試劑為1∶3的摩爾比與修飾試劑混合。用1/10體積的pH10.7的0.12M Na2B4O7-NaOH調(diào)節(jié)pH到10.0，從而引發(fā)修飾反應(yīng)。在室溫下保溫1小時(shí)后，通過(guò)加入1/20體積pH7.5的1M甘氨酸終止反應(yīng)。3-5分鐘后，加入1/20體積的pH4.0的1M乙酸鈉使pH降至5.0-6.0。
含PEG-干擾素、已停止反應(yīng)的試劑和未修飾干擾素的溶液用pH4.5的40mM乙酸銨稀釋4倍后，移至一個(gè)羧甲基纖維素柱(Whatman CM-52，每mg蛋白質(zhì)約0.5ml樹(shù)脂)上，用5倍體積pH 4.5的40mM乙酸銨洗柱后，PEG-干擾素和未修飾干擾素用氯化鈉在pH 4.5的40mM乙酸銨中的線性梯度(0-0.5M)洗脫，含蛋白質(zhì)的級(jí)分用280nm處的光吸收來(lái)鑒定，含PEG-干擾素的級(jí)分由SDS-PAGE來(lái)鑒定。
PEG-干擾素在裝有Sephacryl S-200樹(shù)脂(Pharmacia LKB)的柱上用排阻-凝膠過(guò)濾色譜法進(jìn)一步純化。從柱中洗脫出的級(jí)分用SDS-PAGE來(lái)分析，合并含PEG-干擾素的峰物質(zhì)。
實(shí)施例2α，α-氧亞甲基雙[ω-甲氧基聚(氧-1，2-亞乙基)]SRU28.3的制備按實(shí)施例1中描述的方法，將MPEG(分子量1300)轉(zhuǎn)化為α，α-氧亞甲基雙[ω-甲氧基聚(氧-1，2-亞乙基)SRU28.3，經(jīng)PEG修飾的干擾素用這個(gè)試劑按實(shí)施例1中所述方法1來(lái)制備。
實(shí)施例3α-甲基-ω-[2-[[2-吡啶基氧)羰基]氧]乙氧基]-聚(氧-1，2-亞乙基)SRU111.7的制備從含1克分子量為5000的MPEG的30ml干燥CH2Cl2溶液中蒸出10ml溶劑。溶液冷卻到室溫后加入132mg(0.6mM)碳酸二-2-吡啶酯和4mg DMAP。得到的溶液攪拌14小時(shí)后真空下除去溶劑。殘余物用乙醚研制并將得到的沉淀過(guò)濾。然后將產(chǎn)物溶于7ml干燥的甘醇二甲醚中，加熱使其溶解，使得到的溶液冷卻，并在室溫下放置數(shù)小時(shí)。然后將得到的沉淀過(guò)濾并用2×5ml干燥的甘醇二甲醚洗滌，固體在氮?dú)饬飨掠谡婵諣t中干燥，得到0.7克α-[(2-吡啶基氧)羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-亞乙基)SRU111.7。
元素分析 C9H11NO4(CH2CH2O)111.7的計(jì)算值C，54.57;H，9.02;N，0.28。實(shí)測(cè)值C，54.51;H，9.19;N，0.28。
經(jīng)PEG修飾的干擾素用這個(gè)試劑按實(shí)施例1中所述方法1來(lái)制備。
實(shí)施例4α-[(2-吡啶基氧)羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-亞乙基)SRU225的制備分子量為10，000的MPEG按實(shí)施例3中所述方法轉(zhuǎn)化為α-[(2-吡啶基氧)羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-亞乙基)SRU225。
元素分析 C9H11NO4(CH2CH2O)225的計(jì)算值C，54.54;H，9.08;N，0.14。實(shí)測(cè)值C，54.54;H，9.12;N，0.11。
經(jīng)PEG修飾的干擾素用這個(gè)試劑按實(shí)施例1中所述方法1來(lái)制備。
實(shí)施例5α-甲基-ω-[2-[2-[[(2-吡啶基氧)羰基]氧]丙氧基]丙氧基]聚(氧-1，2-亞乙基)SRU64.7的制備從含0.5克α-2-[2-(羥基丙氧基)丙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-亞乙基)SRU64.7的40ml干燥CH2Cl2溶液中蒸去15ml溶劑。然后向溶液中加入108mg碳酸二-2-吡啶酯、4mg DMAP和幾粒4A分子篩?；旌衔飻嚢柽^(guò)夜，過(guò)濾后減壓除去溶劑。殘余物通過(guò)排阻色譜法純化。
這個(gè)試劑對(duì)應(yīng)于式ⅡB-1化合物
其中n約為64，這相當(dāng)于聚合物的分子量約為3000道爾頓。
經(jīng)PEG修飾的干擾素用這個(gè)試劑按實(shí)施例1中所述方法1來(lái)制備。
實(shí)施例6α-甲基-ω-[2-[2-[[(2-吡啶基氧)羰基]氧]丙氧基]丙氧基]聚(氧-1，2-亞乙基)SRU110的制備。
α-2-[2-(羥基丙氧基)丙基]-ω-甲氧基聚(氧-1，2-亞乙基)SRU110按實(shí)施例5中所述方法轉(zhuǎn)化為α-甲基-ω-[2-[2-[[(2-吡啶基氧)羰基]氧]丙氧基]丙氧基]聚(氧-1，2-亞乙基)SRU110。
這個(gè)試劑(ⅡB-2)除了n大約為110，對(duì)應(yīng)于5000道爾頓外，同實(shí)施例5所述的化合物(ⅡB-1)相當(dāng)。
經(jīng)PEG修飾的干擾素用這個(gè)試劑按實(shí)施例1中所述方法1來(lái)制備。
實(shí)施例7甲基環(huán)氧乙烷同環(huán)氧乙烷的聚合物2-[[(2-吡啶基氧)羰基]氨基]丙基甲基醚(MO/O＝10/32)的制備從含1克Jeffamine M-2070(Texaco Chemical Co.)的40ml干燥CH2Cl2溶液中蒸出15ml溶劑。溶液冷卻到0℃并加入215mg碳酸二-2-吡啶酯。得到的溶液在0℃下再攪拌4小時(shí)，之后減壓除去溶劑。殘余物用串連的兩個(gè)Phenomenex排阻色譜柱(500
和1000
)純化。該產(chǎn)物在紫外光譜上顯示232nm和310nm兩個(gè)吸收帶。
這個(gè)試劑對(duì)應(yīng)于下式化合物
其中，R5為H，R2為H或甲基，并且，作為平均分布，當(dāng)R2為H時(shí)n為32，當(dāng)R2為甲基時(shí)n為10。
經(jīng)PEG修飾的干擾素用這個(gè)試劑按實(shí)施例1中所述方法2來(lái)制備。
實(shí)施例8甲基環(huán)氧乙烷同環(huán)氧乙烷的聚合物2-[[(3-甲基-2-吡啶基氧)羰基]氨基]丙基甲基醚(MO/O＝10/32)的制備按實(shí)施例7中所述方法，1克Jeffamine M-2070同碳酸雙(3-甲基-2-吡啶基)酯反應(yīng)得到甲基環(huán)氧乙烷同環(huán)氧乙烷的聚合物2-[[(3-甲基-2-吡啶基氧)羰基]氨基]丙基甲基醚(MO/O＝10/32)。
除了R5為CH3外，這個(gè)試劑(ⅡA-2)同實(shí)施例7中所述化合物(ⅡA-1)相當(dāng)。
經(jīng)PEG修飾的干擾素用這個(gè)試劑按實(shí)施例1中所述方法1來(lái)制備。
實(shí)施例9甲基環(huán)氧乙烷同環(huán)氧乙烷的聚合物2-[[(2-吡啶基氧)羰基]氨基]丙基甲基醚嵌段(MO/O＝1.6/18.6)的制備按實(shí)施例7中所述方法，0.6克Jeffamine M-1000(Texaco Chemical Co.)同155.6mg 碳酸二-2-吡啶酯反應(yīng)得到甲基環(huán)氧乙烷同環(huán)氧乙烷的聚合物2-[[(2-吡啶基氧)羰基]氨基]丙基甲基醚嵌段(MO/O＝1.6/18.6)。
得到下式化合物
其中聚合物中各單元的平均分布如所示。
經(jīng)PEG修飾的干擾素用該試劑按實(shí)施例1中所述方法1來(lái)制備。
干擾素的抗病毒活性對(duì)干擾素及經(jīng)PEG修飾的干擾素的抗病毒活性進(jìn)行了測(cè)定(Rubenstein等人，(1981)J.Virol.37∶755-758;Familletti等人，(1981)Methocls Enzymol.78∶387-394)。所有的測(cè)定都相對(duì)于對(duì)照物進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。測(cè)定中所用的干擾素標(biāo)準(zhǔn)物的比活性為每mg蛋白質(zhì)2×108單位。
修飾干擾素所用條件是以所述的最優(yōu)化程序?yàn)榛A(chǔ)的。PEG修飾過(guò)程中，由SDS-PAGE分析不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)干擾素轉(zhuǎn)化為單PEG-干擾素的轉(zhuǎn)化率(化學(xué)反應(yīng)性)以及不同種類PEG-干擾素結(jié)合物的分布(位點(diǎn)選擇性)。在SDS-PAGE中，觀察到經(jīng)PEG修飾的物質(zhì)是凝膠上的遷移較慢的條帶。單PEG-干擾素和雙PEG-干擾素的產(chǎn)率都足以使它們能夠用疏水性相互作用色譜法從反應(yīng)混合物中純化出來(lái)。測(cè)定純化的PEG-干擾素的抗病毒活性并與未修飾的干擾素-α2a標(biāo)準(zhǔn)物比較。所用聚合物的分子量以及一些PEG化的衍生物的抗病毒活性如表1所示。
表1PEG試劑的物理性質(zhì)及其蛋白質(zhì)結(jié)合物的生物活性抗病毒活性實(shí)施例化合物 (%對(duì)照物)聚合物分子量 單PEG 雙PEG4 10000 25 23 5000 40 41 5000 40 ND6 5000 40 ND5 3000 60 ND7 2070 45 ND2 1300 70 ND9 1000 100 40ND=未測(cè)
權(quán)利要求
1.一種具有下式的干擾素結(jié)合物
其中R為低級(jí)烷基；R1、R2、R3和R4為H或低級(jí)烷基；m選自≥1的整數(shù)到干擾素中可及氨基的數(shù)目；W為O或NH；x為1-1000的整數(shù)，y和z為0-1000的整數(shù)，x、y和z三者之和為3-1000；附帶條件是R1、R2、R3和R4中至少有一個(gè)為低級(jí)烷基。
2.權(quán)利要求1的干擾素結(jié)合物，其中選擇x、y和z，使得結(jié)合物中聚合物部分的分子量在大約300-30000道爾頓的范圍內(nèi)。
3.權(quán)利要求1的干擾素結(jié)合物，其中m為1。
4.權(quán)利要求1的干擾素結(jié)合物，其中R為甲基。
5.權(quán)利要求1的干擾素結(jié)合物，其中選擇x、y和z，使得結(jié)合物中聚合物部分的分子量在大約1000-5000道爾頓的范圍內(nèi)。
6.權(quán)利要求2的干擾素結(jié)合物，其中選擇x、y和z，使得結(jié)合物中聚合物部分的分子量在大約1000-2200道爾頓的范圍內(nèi)。
7.權(quán)利要求1的干擾素結(jié)合物，其中x和y為5.0-500.0，z為0.0-4.0。
8.權(quán)利要求1的干擾素結(jié)合物，其中x為10.0-100.0，y為1.0-10.0，z為0。
9.權(quán)利要求1的干擾素結(jié)合物，其中干擾素為干擾素α2a。
10.權(quán)利要求9的干擾素結(jié)合物，其中W為NH;m為1;R、R2和R4為CH3;R1為H;x為18.6，y為1.6，z為0。
11.一種具有下式的化合物
其中R為低級(jí)烷基;R1、R2、R3、R4和R5為H或低級(jí)烷基;W為NH或O;x為1-1000的整數(shù)，y和z為0-1000的整數(shù)，x、y和z三者之和為3-1000;附帶條件是，假如W為NH或W為O，R5為H，則R1、R2、R3和R4中至少有一個(gè)為低級(jí)烷基。
12.權(quán)利要求11的化合物，其中選擇x、y和z，使得所述化合物的分子量在大約300-30000道爾頓的范圍內(nèi)。
13.權(quán)利要求11的化合物，其中R為甲基。
14.權(quán)利要求13的化合物，其中x為10.0-100.0，y為1.0-10.0，z為0.0-4.0。
15.一種具有下式的化合物
其中R為低級(jí)烷基;R1、R2、R3和R4為H或甲基;x為1-1000的整數(shù)，y和z為0-1000的整數(shù)，x、y和z三者之和為3-1000。
16.權(quán)利要求15的化合物，其中選擇x、y和z，使得所述化合物的分子量在大約300-30000道爾頓的范圍內(nèi)。
17.權(quán)利要求15的化合物，其中R1、R2、R3和R4中至少有一個(gè)為低級(jí)烷基。
18.權(quán)利要求15的化合物，其中R為甲基。
19.依據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的干擾素結(jié)合物，該結(jié)合物用作治療或預(yù)防疾病的治療活性化合物。
20.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述干擾素結(jié)合物的制備方法，該方法包括使權(quán)利要求11-18中所述的化合物同干擾素或其鹽反應(yīng)，并由反應(yīng)混合物中分離出干擾素結(jié)合物。
21.藥物組合物，該組合物包含權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的干擾素結(jié)合物和治療惰性載體。
22.用于治療或預(yù)防如腫瘤性疾病或傳染病等免疫調(diào)節(jié)失調(diào)疾病的藥物組合物，該組合物包含權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的干擾素結(jié)合物和治療惰性載體。
23.依照權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的干擾素結(jié)合物在治療或預(yù)防非人類疾病中的應(yīng)用。
24.依照權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的干擾素結(jié)合物在制備用于治療或預(yù)防疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有生理活性的水溶性聚乙二醇同干擾素的結(jié)合物，以及可用來(lái)制備這些結(jié)合物的新型聚乙二醇化合物。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1088936SQ93116479
公開(kāi)日1994年7月6日 申請(qǐng)日期1993年8月25日 優(yōu)先權(quán)日1992年8月26日
發(fā)明者R·卡拉西韋茨, C·納林, P·羅森 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司