專利名稱：2-(1-羥乙基)-5-羥基萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮和含該化合物的抗腫瘤劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抗腫瘤作用的一種新化合物以及含該化合物的抗腫瘤劑。
每年癌癥的死亡率不斷增加，在發(fā)展中國家癌癥是死亡的主要原因。因此，在醫(yī)學領(lǐng)域癌癥的控制是至關(guān)重要的。抗腫瘤藥的開發(fā)早已是重要的癌癥的治療的課題之一。目前已經(jīng)開發(fā)出多種抗腫瘤藥。因此，已開發(fā)出許多抗腫瘤的抗生素和其它直接作用于腫瘤細胞并對該細胞產(chǎn)生一種殺細胞作用的抗腫瘤劑。然而，這些藥對正常的細胞或組織也有很強的細胞毒性，并且在多數(shù)情況下嚴重的副作用已經(jīng)不可避免。因此，對腫瘤細胞具有選擇性的細胞毒性而又很少出現(xiàn)副作用的抗腫瘤藥的開發(fā)長期以來一直是研究者的目標。
盡管人們并沒有充分認識腫瘤細胞的特性，但一般認為它作為由致癌化學制品、輻射、紫外線或致癌病毒刺激的結(jié)果在染色體上暫時不活動的致癌基因被表達;或者相反，因上述刺激因素引起腫瘤抑制基因失活的結(jié)果。據(jù)信，致癌基因或其細胞膜附著體的表達產(chǎn)物的內(nèi)外細胞的分泌物與腫瘤細胞的瘤的特征性例如轉(zhuǎn)移、浸潤能力及非正常的增生的顯示有關(guān)。若能抑制引起不正常表達過程其中之一的任何方法行之有效，那么，這樣的方法可能會成為控制癌癥的有效的方法。
在日本，根據(jù)NIC(美國國家癌癥研究所)用小鼠白血病細胞系L1210和P388的抗腫瘤藥篩選規(guī)定，對抗腫瘤劑的有效性進行了篩選。然而，篩選試驗的結(jié)果常與癌癥患者的相應(yīng)的治療結(jié)果不一致。最近，新修改的NCI篩選規(guī)定用人類癌細胞系。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)新的實驗結(jié)果和臨床研究中的治療結(jié)果之間具有良好的相關(guān)性[G.B.GrindeyCancer Cells第2卷，第6期，163-171頁，1990;N.Saijo，Clinician第17卷，第6期，4-9頁，1991]。
本發(fā)明人采取使用人類癌細胞系的新的NIC篩選規(guī)定對多種化合物進行了抗腫瘤活性的篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2-(1-羥乙基)-5-羥基萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮(以下稱為NFD)具有極好的抗腫瘤活性，它是從紫葳科Tabebuia avellanedae Lorentz，ex Griseb。中提取出來的一個新化合物。依據(jù)該發(fā)現(xiàn)，完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供具有下式(1)結(jié)構(gòu)的新化合物NFD
本發(fā)明的第二個目的是提供含作為活性成分的NFD的抗腫瘤劑。
本發(fā)明第三個目的是提供生產(chǎn)NFD的方法，它包括下述幾個步驟用熱甲醇提取Tabebuia avellanedae Lorentz，ex Griseb.的干燥樹皮;將提取物經(jīng)蒸發(fā)后得到的殘留物用冷氯仿提取;并用制備薄層層析以甲苯/乙酸乙酯(4∶1)為展開劑分離氯仿可溶的成分。
NFD(分子式C14H10O5;分子量258.230)是一種黃色針狀結(jié)晶，熔點為181℃，易溶于二甲亞砜和氯仿，微溶于水。
在低濃度時NFD顯著地抑制下述腫瘤細胞的生長，并且對這些腫瘤細胞顯示出選擇性的毒性作用培養(yǎng)的人的肺腺癌細胞系A(chǔ)-549、VMRC-LCD和SK-LU-1，人肺鱗狀上皮細胞癌Calu-1細胞，人結(jié)腸腺癌Wi Dr細胞，人的前列腺癌LNCaP細胞，人的陰道鱗狀上皮細胞癌A-431細胞，人的頸部癌HeLa細胞，人膽道癌HuCC-Tl細胞，小鼠皮膚癌黑色素瘤B16(M4)細胞，人的惡性B細胞淋巴瘤細胞，人慢性骨髓性的白血病K562細胞，人的胰腺癌ASPC-1細胞，人的成神經(jīng)細胞瘤IMR-132細胞，人肺小細胞癌SCCH-194細胞，人膀胱癌T24細胞，人腎細胞癌VMRC-RCW細胞，人胃癌NUGC-2細胞，人的甲狀腺癌8305C細胞，人乳腺癌MRK-nu-1細胞，人的肝細胞瘤HuH-7細胞，人的卵巢癌TYK-nu細胞，人的絨毛膜癌BeWo細胞。
對于上述惡性腫瘤細胞，NFD的LD50值(50%生長抑制劑量;與IC50相同)大約在5.5-25ng/ml范圍內(nèi)。同時，對培養(yǎng)的正常人的N6KA成纖維細胞、氣管上皮細胞、腎細胞和淋巴細胞的LD50值(IC50值)在55-84ng/ml范圍內(nèi)。就普通毒理學而言，腹腔內(nèi)用藥時，對ICR小鼠(雄)的NFD的LD50值為0.73mg/100克體重;口腔給藥時為0.84mg/100克體重。
如上所述，NFD是一種能抗各種類型的癌癥且副作用極小的極好抗腫瘤藥。也發(fā)現(xiàn)NFD干擾由化學致癌因素或病毒引起正常細胞向癌細胞轉(zhuǎn)變的最重要的過程一促進階段，在致癌過程中起到抗致癌啟動子的作用。在本說明書中所說的“抗腫瘤劑”是指包括能有效地治療或緩解所有類型的惡性腫瘤如固形腫瘤、血癌、肉瘤及預(yù)防這些惡性腫瘤的產(chǎn)生的藥物。
在附圖中

圖1表示NFD對人肺腺癌A-549細胞的生長抑制和致死作用。
圖2表示NFD對人肺腺癌VMRC-LCD細胞的生長抑制和致死作用。
圖3表示NFD對人肺腺癌SK-LU-1細胞的生長抑制和致死作用。
圖4表示NFD對人肺鱗狀上皮細胞癌Calu-1細胞的生長抑制和致死作用。
圖5表示NFD對人結(jié)腸腺癌Wi Dr細胞的生長抑制和致死作用。
圖6表示NFD對人前列腺癌LNCaP細胞的生長抑制和致死作用。
圖7表示NFD對人陰道鱗狀上皮細胞癌A-431細胞的生長抑制和致死作用。
圖8表示NFD對人頸部癌HeLa細胞的生長抑制和致死作用。
圖9表示NFD對人膽道癌HuCC-T1細胞的生長抑制和致死作用。
圖10表示NFD對小鼠皮膚黑色素瘤B16(M4)細胞的生長抑制和致死作用。
圖11表示NFD對人惡性B細胞淋巴瘤細胞的生長抑制和致死作用。
圖12表示NFD對人慢性骨髓性白血病K562細胞的生長抑制和致死作用。
圖13表示NFD對人胰腺癌ASPC-1細胞的生長抑制和致死作用。
圖14表示NFD對人成神經(jīng)細胞瘤IMR-132細胞的生長抑制和致死作用。
圖15表示NFD對人肺小細胞癌SCCH-194細胞的生長抑制和致死作用。
圖16表示NFD對人膀胱癌T24細胞的生長抑制和致死作用。
圖17表示NFD對人腎細胞癌VMRC-RCW細胞的生長抑制和致死作用。
圖18表示NFD對人胃癌NUGC-2細胞的生長抑制和致死作用。
圖19表示NFD對人甲狀腺癌8305C細胞的生長抑制和致死作用。
圖20表示NFD對人乳腺癌MRK-nu-1細胞的生長抑制和致死作用。
圖21表示NFD對人肝細胞瘤HuH-7細胞的生長抑制和致死作用。
圖22表示NFD對人卵巢癌TYK-nu細胞的生長抑制和致死作用。
圖23表示NFD對人絨毛膜癌Be Wo細胞的生長抑制和致死作用。
圖24表示NFD對正常人N6KA成纖維細胞的生長抑制和致死作用。
圖25表示NFD對正常人氣管上皮細胞的生長抑制和致死作用。
圖26表示NFD對正常人末梢血淋巴細胞的生長抑制和致死作用。
圖27表示NFD對正常人腎細胞的生長抑制和致死作用。
圖28表示NFD對致癌促進因子的抑制作用。
圖29表示Lapacoal對致癌促進因子的抑制作用，為活性對照。
下述實施例詳細解釋本發(fā)明。
實施例1 NFD的制作將Tabebuia avellanedae Lorentz，ex Griseb.的干燥樹皮(出產(chǎn)國巴西;可從日本的Taheebo Japan Co.Ltd買到)切成碎片，用三份1000毫升的甲醇回流提取30分鐘;減壓蒸除溶劑。將剩余物(145克)浸泡于三份400毫升的冷氯仿中。氯仿層用水洗滌并用無水硫酸鎂干燥，蒸發(fā)溶劑后得1g殘留物。將殘留物在厚度為0.5mm的硅膠60F254薄層層析板上進行制備薄層層析，用甲苯乙酸乙酯(4∶1，體積/體積)的混合物作展開劑。將Rf＝0.24的斑點刮下來并用氯仿-甲醇(9∶1，體積/體積)的混合物提取，得NFD。重復此TLC過程，得到總量為0.8毫克的NFD，熔點為181℃。
實施例2 NFD對包括人的固形腫瘤細胞、血癌和肉瘤在內(nèi)各種類型惡性腫瘤細胞的抗腫瘤活性(1)實驗樣品的制備將適量的NFD溶于二甲亞砜，制成1.0mg/ml的貯備液，根據(jù)需要，使用前將其稀釋。
(2)NFD體外抗腫瘤實驗(生長抑制作用和致死能力)按照下述方法測定NFD對人癌細胞和小鼠癌細胞的抗癌作用。
用胰蛋白酶鈉(含0.25%胰蛋白酶鈉和0.02%乙二胺四醋酸，37℃，3分鐘)處理后，下列細胞在后對數(shù)相被收集用于本實驗人肺腺癌A-549、VMRC-LCD和SK-LU-1細胞，人肺鱗狀上皮細胞癌Calu-1細胞，人結(jié)腸腺癌Wi Dr細胞，人前列腺癌LNCaP細胞，人陰道鱗狀上皮細胞癌A-431細胞，人頸部癌HeLa細胞，人膽道癌HuCC-T1細胞，小鼠皮膚癌黑色素瘤B16(M4)細胞，人胰腺癌ASPC-1細胞，人成神經(jīng)細胞瘤IMR-132細胞，人肺小細胞癌SCCH-194細胞，人膀胱癌T24細胞，人腎細胞癌VMRC-RCW細胞，人胃癌NUGC-2細胞，人甲狀腺癌8305C細胞，人肝細胞瘤HuH-7細胞，人卵巢癌TYK-nu細胞和人絨毛膜癌BeWo細胞。人乳腺癌MRK-nu-1細胞，人惡性B細胞淋巴瘤細胞和人慢性骨髓性白血病k562細胞的懸浮培養(yǎng)液用于收集這些用于實驗的細胞。同時，在胰蛋白酶化后于后對數(shù)相收集正常人N6KA成纖維細胞，直接由氣管和腎組織采集正常人氣管上皮細胞和腎細胞，從正常成人捐獻者的末梢血中采集正常人的淋巴細胞。將這些細胞用含10%胎牛血清的DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)基以5-10×103細胞/cm2的密度移植到一個96孔的微平皿中，用通常方式培養(yǎng)24小時，然后將溶于二甲亞砜的預(yù)定量的NFD加到每個孔中。培養(yǎng)是連續(xù)的，并且在24、48和72小時后數(shù)存活細胞的數(shù)目。為了排除作為NFD溶劑的二甲亞砜的可能的有害作用，將培養(yǎng)基中二甲亞砜的終濃度調(diào)至0.5%或更低，使其不出現(xiàn)毒性，并且用只加入二甲亞砜的孔作為對照。
(3)存活細胞的計數(shù)在胰蛋白酶作用后收集生長在96孔微平皿上的腫瘤細胞，并向其中加入0.25%臺盼蘭液。沒有染上色的細胞被認為是活細胞，被染成蘭色的細胞被認為是死細胞(臺盼蘭排斥實驗)。
(4)用于實驗的腫瘤細胞和正常細胞a)人肺腺癌(A-549細胞)從Flow Labo Inc.獲得人肺腺癌A-549細胞。在每毫升含50國際單位青霉素和50微克鏈霉素，并用10%胎牛血清補充的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃，含5%CO2的大氣壓下，這些細胞被傳代培養(yǎng)，并用于實驗。
b)人肺腺癌(VMRC-LCD細胞)從國家衛(wèi)生科學研究所獲得人肺腺癌VMRC-LCD細胞。在每毫升含50國際單位青霉素和50微克鏈霉素，并用10%胎牛血清補充的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，這些細胞被傳代培養(yǎng)，并用于實驗。
c)人肺腺癌(SK-LU-1細胞)從放射性危害研究所獲得人肺腺癌SK-LU-1細胞。在每毫升含50國際單位青霉素和50微克鏈霉素，并用10%胎牛血清補充的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的氣壓下，這些細胞被傳代培養(yǎng)，并用于實驗。
d)人肺鱗狀上皮細胞癌(Calu-1細胞)從放射性危害研究所獲得人肺鱗狀上皮細胞癌Calu-1細胞。在每毫升含50國際單位青霉素和50微克鏈霉素，并用10%胎牛血清補充的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的氣壓下，這些細胞被傳代培養(yǎng)，并用于實驗。
e)人結(jié)腸腺癌(Wi Dr細胞)從食物和藥品的生物安全研究中心，Hatano實驗室獲得人結(jié)腸腺癌Wi Dr細胞。在每毫升含50國際單位青霉素和50微克鏈霉素，并用10%胎牛血清補充的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，這些細胞被傳代培養(yǎng)，并用于實驗。
f)人前列腺癌(LNCaP細胞)從Kagawa醫(yī)學院內(nèi)分泌學系獲得人前列腺癌LNCaP細胞。在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，對這些細胞進行培養(yǎng)并用于實驗。
g)人陰道鱗狀上皮細胞癌A-431細胞從Kanazawa醫(yī)科大學生化系獲得人陰道鱗狀上皮細胞癌A-431細胞。在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，對這些細胞進行培養(yǎng)并用于實驗。
h)人頸部癌(HeLa細胞)從Flow實驗有限公司獲得人頸部癌HeLa細胞。在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，對這些細胞進行培養(yǎng)并用于實驗。
i)人膽道癌(HuCC-Tl細胞)從Kanazawa醫(yī)科大學生化系獲得人膽道癌HuCC-T1細胞。在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，對這些細胞進行培養(yǎng)并用于實驗。
j)小鼠皮膚癌(黑色素瘤)從Kanazawa醫(yī)科大學生化系獲得小鼠黑色素瘤B16(M4)細胞。在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，對這些細胞進行培養(yǎng)并用于實驗。
k)人惡性淋巴瘤從Kanazawa醫(yī)科大學內(nèi)科系獲得人惡性B細胞淋巴瘤細胞。在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，對這些細胞進行培養(yǎng)并用于實驗。
l)人慢性骨髓性白血病K562細胞從Kanazawa醫(yī)科大學內(nèi)科系獲得人慢性骨髓性白血病K562細胞。在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，對這些細胞進行培養(yǎng)并用于實驗。
m)人胰腺癌(ASPC-1細胞)
從Flow實驗有限公司獲得人胰腺癌ASPC-1細胞。在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，對這些細胞進行培養(yǎng)并用于實驗。
n)人成神經(jīng)細胞瘤(IMR-132細胞)從國家衛(wèi)生科學研究所獲得人成神經(jīng)細胞瘤IMR-132細胞。在含有10%NEAA，每ml含50國際單位青霉素和50μg鏈霉素，并用10%胎牛血清補充的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，這些細胞被傳代培養(yǎng)并用于實驗。
o)人肺小細胞癌(SCCH-194細胞)從放射性危害研究所獲得人肺小細胞癌SCCH-194細胞。在每ml含60μg的卡那霉素硫酸鹽并用10%胎牛血清補充的ES培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，這些細胞被傳代培養(yǎng)并用于實驗。
p)人膀胱癌T24細胞從橫濱市立大學Kihara生物研究院獲得人膀胱癌T24細胞。在含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，這些細胞被傳代培養(yǎng)并用于實驗。
q)人腎細胞癌(VMRC-RCW細胞)從放射性危害研究所獲得人腎細胞癌VMRC-RCW細胞。在含1%NEAA、4mM HEPES并用10%胎牛血清補充的MEM培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，這些細胞被傳代培養(yǎng)，并用于實驗。
r)人胃癌(NUGC-2細胞)從放射性危害研究所獲得人胃癌NUGC-2細胞。在含有4mM HEPES和用10%胎牛血清補充的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，這些細胞被傳代培養(yǎng)并用于實驗。
s)人甲狀腺癌(8305C細胞)從放射性危害研究所獲得人甲狀腺癌8305C細胞。在含1%NEAA、4mM HEPES和用10%胎牛血清補充的MEM培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，這些細胞被傳代培養(yǎng)并用于實驗。
t)人乳腺癌(MRK-nu-1細胞)從東京大學醫(yī)學科學研究院獲得人乳腺癌MRK-nu-1細胞。在含10%胎牛血清的DM-160培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，對這些細胞進行培養(yǎng)并用于實驗。
u)人肝細胞瘤(HuH-7細胞)從Okayama大學癌癥研究所獲得人肝細胞瘤HuH-7細胞。在含有0.2%乳白蛋白水解產(chǎn)物和用1%胎牛血清補充的培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，對這些細胞進行培養(yǎng)并用于實驗。
v)人卵巢癌(TYK-nu細胞)從食物和藥品的生物安全研究中心Hatano實驗室獲得人卵巢癌TYK-nu細胞。在含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，對這些細胞進行培養(yǎng)并用于實驗。
w)人絨毛膜癌(Be Wo細胞)從國家衛(wèi)生科學研究所獲得人絨毛膜癌Be Wo細胞。在含有15%胎牛血清的Ham's F12(K)培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，對這些細胞進行培養(yǎng)并用于實驗。
x)正常人成纖維細胞(N6KA細胞)從Kanazawa醫(yī)科大學生化系獲得正常人N6KA成纖維細胞。在每ml含50國際單位青霉素和50μg鏈霉素并用10%胎牛血清補充的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，這些細胞被傳代培養(yǎng)并用于實驗。
y)正常人氣管上皮細胞從Kanazawa醫(yī)科大學醫(yī)院的尸體解剖樣本中獲得氣管上皮，經(jīng)胰蛋白酶化后收集到正常人氣管上皮細胞。在每ml含50國際單位青霉素和50μg鏈霉素并用10%胎牛血清補充的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，這些細胞被傳代培養(yǎng)并用于實驗。
z)正常人末梢血淋巴細胞從正常成人捐獻者獲得的末梢血樣品，經(jīng)Ficoll-Hypaque梯度離心作用分離出正常人末梢血淋巴細胞。將這些淋巴細胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基按5×103細胞/cm2的密度移植到一個96孔的微平皿中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，這些細胞被傳代培養(yǎng)并用于實驗。
aa)正常人腎細胞在Kanazawa醫(yī)科大學泌尿?qū)W系，由于腫瘤或其它原因切除的腎，經(jīng)膠原酶處理后，分離出正常人腎細胞。在含有1%NEAA，4mMHEPES和60μg/ml卡那霉素硫酸鹽并用10%胎牛血清補充的MEM培養(yǎng)基中，于37℃，在含5%CO2的大氣壓下，這些細胞被傳代培養(yǎng)并用于實驗。
(5)實驗結(jié)果NFD對上述各種類型的惡性腫瘤細胞和正常的人細胞的生長抑制作用和致死能力，通過計數(shù)96孔微平皿的每一個孔中存活細胞的數(shù)目來評估。將在不含NFD的培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長的細胞用做對照。結(jié)果如圖1-27所示，這些圖中所用的符號含意如下。
圖1中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●5.6ng/ml;□-□11.2ng/ml;■-■22.4ng/ml;△-△33.5ng/ml;△-△44.7ng/ml。
圖2中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●5.6ng/ml;□-□16.8ng/ml;■-■27.9ng/ml;△-△44.7ng/ml;△-△55.9ng/ml。
圖3中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●11.2ng/ml;□-□22.4ng/ml;■-■33.5ng/ml;△-△44.7ng/ml;△-△55.9ng/ml。
圖4中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●11.2ng/ml;□-□22.4ng/ml;■-■33.5ng/ml;△-△44.7ng/ml;△-△55.9ng/ml。
如圖1-4所示，NFD在11.2～16.8ng/ml時，幾乎完全地抑制人肺癌細胞的生長，并且在33.5～55.4ng/ml時使幾乎所有的腫瘤細胞壞死。
圖5中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●11.2ng/ml;□-□22.4ng/ml;■-■33.5ng/ml;△-△44.7ng/ml;△-△55.9ng/ml。
如圖5所示，NFD在22.4～33.5ng/ml時，幾乎完全地抑制人結(jié)腸腺癌細胞的生長，并且在44.7～55.9ng/ml時使幾乎所有的腫瘤細胞壞死。
圖6中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●11.2ng/ml;□-□22.4ng/ml;■-■33.5ng/ml;△-△44.7ng/ml;△-△55.9ng/ml。
如圖6所示，NFD在11.2ng/ml時，幾乎完全地抑制人結(jié)腸腺癌細胞的生長，并且在22.4～55.9ng/ml時使幾乎所有的腫瘤細胞壞死。
圖7中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●16.8ng/ml;
□-□22.8ng/ml;■-■27.9ng/ml.
如圖7所示，NFD在27.9ng/ml時，幾乎完全地抑制人陰道鱗狀上皮細胞癌細胞的生長。
圖8中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●5.6ng/ml;□-□11.2ng/ml;■-■16.8ng/ml;△-△22.4ng/ml;△-△27.9ng/ml。
如圖8所示，NFD在22.4ng/ml時，幾乎完全地抑制人頸部癌細胞的生長，并且在27.9ng/ml時，使這些細胞壞死。
圖9中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●11.2ng/ml;□-□16.8ng/ml;■-■22.4ng/ml;△-△27.9ng/ml。
如圖9所示，NFD在22.4ng/ml時，幾乎完全地抑制人膽道癌細胞的生長，并且在27.9ng/ml時，使這些細胞壞死。
圖10中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●5.6ng/ml;□-□11.2ng/ml;■-■16.8ng/ml;△-△22.4ng/ml;△-△33.5ng/ml。
如圖10所示，NFD在11.2ng/ml時，幾乎完全地抑制小鼠皮膚黑色素瘤細胞的生長，并且在16.8～33.5ng/ml時，使幾乎所有的腫瘤細胞壞死。
圖11中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●11.2ng/ml;□-□22.4ng/ml;■-■33.5ng/ml;△-△44.7ng/ml;△-△55.9ng/ml。
如圖11所示，NFD在11.2～55.9ng/ml時使人惡性B細胞淋巴瘤細胞壞死。
圖12中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●11.2ng/ml;□-□22.4ng/ml;■-■27.9ng/ml;△-△33.5ng/ml;△-△44.7ng/ml;x-x55.9ng/ml。
如圖12所示，NFD在11.2～22.4ng/ml時，抑制人慢性骨髓性白血病細胞的生長，而在27.9～55.9ng/ml時使這些細胞壞死。
圖13中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●5.6ng/ml;□-□11.2ng/ml;■-■22.4ng/ml;△-△27.9ng/ml;△-△33.5ng/ml;x-x44.7ng/ml。
如圖13所示，NFD在33.5ng/ml時，幾乎完全抑制人胰腺癌細胞的生長，而在44.7ng/ml時使這些細胞壞死。
圖14中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●5.6ng/ml;□-□16.8ng/ml;■-■27.9ng/ml;△-△44.7ng/ml;△-△55.9ng/ml。
如圖14所示，NFD在44.7ng/ml時，幾乎完全抑制人成神經(jīng)細胞瘤細胞的生長，而在55.9ng/ml時使這些細胞壞死。
圖15中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●10ng/ml;□-□20ng/ml;■-■30ng/ml;△-△40ng/ml;△-△50ng/ml。
如圖15所示，NFD在30ng/ml時，幾乎完全抑制人肺小細胞癌細胞的生長，而在40～60ng/ml時使這些細胞壞死。
圖16中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●5.7ng/ml;□-□11ng/ml;■-■23ng/ml;△-△46ng/ml;△-△68ng/ml。
如圖16所示，NFD在23ng/ml時。幾乎完全抑制人膀胱癌細胞的生長，而在46ng/ml時使這些細胞壞死。
圖17中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●17ng/ml;□-□33ng/ml;■-■50ng/ml;△-△90ng/ml;△-△280ng/ml。
如圖17所示，NFD在17ng/ml時，幾乎完全抑制人腎細胞癌細胞的生長，而在50ng/ml時使幾乎所有的腫瘤細胞發(fā)生壞死。
圖18中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●17ng/ml;□-□33ng/ml;■-■50ng/ml;△-△90ng/ml;△-△170ng/ml。
如圖18所示，NFD在33ng/ml時，幾乎完全抑制人胃癌細胞的生長，而在50ng/ml時使這些腫瘤細胞發(fā)生壞死。
圖19中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●17ng/ml;□-□33ng/ml;■-■50ng/ml;△-△90ng/ml;△-△280ng/ml。
如圖19所示，NFD在28ng/ml時，幾乎完全抑制人甲狀腺癌細胞的生長，而在51ng/ml時使這些腫瘤細胞發(fā)生壞死。
圖20中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●17ng/ml;□-□33ng/ml;■-■50ng/ml;△-△90ng/ml;△-△280ng/ml。
如圖20所示，NFD在33ng/ml時，幾乎完全抑制人乳腺癌細胞的生長，而在50ng/ml或＞50ng/ml時使這些腫瘤細胞發(fā)生壞死。
圖21中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●5.0ng/ml;□-□7.5ng/ml;■-■20ng/ml;△-△30ng/ml;△-△40ng/ml。
如圖21所示，NFD在20ng/ml時，幾乎完全抑制人肝癌細胞的生長，而在30ng/ml或＞50ng/ml時使這些腫瘤細胞發(fā)生壞死。
圖22中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●10ng/ml;□-□20ng/ml;■-■40ng/ml;△-△60ng/ml;△-△80ng/ml。
如圖22所示，NFD在20ng/ml時，幾乎完全抑制人卵巢癌細胞的生長，而在40ng/ml或＞40ng/ml時使幾乎所有這些腫瘤細胞發(fā)生壞死。
圖23中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●5.7ng/ml;□-□11.4ng/ml;■-■22.8ng/ml;△-△34.3ng/ml;△-△45.7ng/ml。
如圖23所示，NFD在34.3ng/ml時，幾乎完全抑制人絨毛膜癌細胞的生長，而在45.7ng/ml時使這些腫瘤細胞發(fā)生壞死。
圖24中，培養(yǎng)基中NFD的濃度是0-0無NFD的對照(C);
●-●55.9ng/ml。
圖25中，培養(yǎng)基中NFD的濃度是0-0無NFD的對照(C);
●-●55.9ng/ml。
圖26中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下O-O無NFD的對照(C);
●-●16.8ng/ml;□-□33.5ng/ml;■-■55.9ng/ml。
圖27中，培養(yǎng)基中NFD的濃度如下0-0無NFD的對照(C);
●-●30ng/ml;□-□50ng/ml;■-■100ng/ml。
如圖27所示，NFD僅在100ng/ml的較高濃度時才抑制正常腎細胞的生長。
如圖24、25、26和27所示，NFD在使上述腫瘤細胞壞死的濃度時，對正常人成纖維細胞、氣管上皮細胞、末梢血淋巴細胞或腎細胞的生長沒有有害作用。
(6)50%生長抑制劑量(LD50，IC50)表1總結(jié)了NFD對每個細胞系的50%生長抑制劑量(LD50、IC50)，該劑量依據(jù)圖1-12由在培養(yǎng)基中與NFD一同培養(yǎng)3天后的細胞的活力來測定;所述的活力由實驗孔中活細胞數(shù)相對于對照孔中(無NFD的培養(yǎng)基)活細胞數(shù)的百分比來表示。NFD對人和小鼠惡性和正常細胞的50%生長抑制劑量(LD50，IC50)細胞系 LD50(IC50)(ng/ml)人肺腺癌A-549細胞 9.5人肺腺癌VMRC-LCD細胞 13人肺腺癌SK-LU-1細胞 17人肺鱗狀上皮細胞癌Calu-1細胞 17人結(jié)腸腺癌Wi Dr細胞 11人前列腺癌LNCaP細胞 1.7人陰道鱗狀上皮細胞癌A-431細胞 21人頸部癌HeLa細胞 18人膽道癌HuCC-T1細胞 20小鼠皮膚黑色素瘤B16(M4)細胞 6.7人惡性B細胞淋巴瘤細胞 5.6人慢性骨髓性白血病K562細胞 14人胰腺癌ASPC-1細胞 17人成神經(jīng)細胞瘤I MR-132細胞 10人肺小細胞癌SCCH-194細胞 10
人膀胱癌T24細胞 21人腎細胞癌VMRC-RCW細胞 19人胃癌NUGC-2細胞 17人甲狀腺癌8305C細胞 25人乳腺癌MRK-nu-1細胞 12人肝細胞瘤HuH-7細胞 5.5人卵巢癌TYK-nu細胞 17人絨毛膜癌BeWo細胞 18正常人N6KA成纖維細胞 84正常人氣管上皮細胞 >55正常人末梢血淋巴細胞 84正常人腎細胞 65已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NFD對所有的惡性腫瘤細胞和血液瘤的LD50值在5.5～25ng/ml的范圍內(nèi)。
NFD存在于培養(yǎng)基中3天后，依據(jù)圖13-15所計算的NFD對正常人細胞的LD50值也列入表1中，該LD50值在55～84ng/ml范圍內(nèi)。
實施例3 在小鼠肺內(nèi)兩步抑制致癌因素實驗動物為雌性ICR小鼠，15只小鼠飼養(yǎng)在一個籠子里，供給小的圓柱塊壓縮飼料食物，任意喝水。預(yù)先飼養(yǎng)一周后，6周令的小鼠用溶于橄欖油和膽固醇(20∶1)混合液中的4-硝基喹啉-N-氧化物(4NQO)按每公斤體重10mg于背部皮下注射。從開始后第五周，隨意飼喂小鼠8%的甘油作為一種致癌啟動子。接受4NQO和8%甘油25周的小鼠作為陽性對照組;另一方面，實驗組的小鼠隨意飼喂每ml含1ngNFD的8%的甘油25周。實驗開始后的第30周，由頸部脫位殺死小鼠，經(jīng)尸體解剖用福爾馬林固定后摘出肺葉。在體視顯微鏡下，觀察到肺中形成的腺瘤;測定腺瘤的數(shù)目，并將這個數(shù)目與陽性對照組及NFD用藥組進行比較。表2總結(jié)了實驗結(jié)果。實驗開始后第30周飼喂NFD的NFD組的肺腺瘤表現(xiàn)百分數(shù)如表2所示，比陽性對照組低1/3，表明肺中腺瘤形成得到明顯抑制。小鼠肺腺瘤的數(shù)目及表觀百分數(shù)組 腺瘤 腺瘤數(shù) 具腺瘤的總數(shù)目 /小鼠 小鼠的百分數(shù)I僅以水為飲用水 0 0 0II僅以8%甘油為飲用水 0 0 0III僅以4NQO+水作飲用水 3 0.2 13.3IV僅以4NQO+8%甘油作飲用水 48 3.2 100V以4NQO+含0.1mg/mlNFD的8%甘油為飲用水 9 0.6 33.3實施例4 在小鼠皮膚上兩步抑制皮膚致癌因素實驗動物為雌性ICR小鼠，15只小鼠養(yǎng)在一個籠子里，連續(xù)飼喂市售小的圓柱塊壓縮飼料食物，隨意喝水，直到實驗結(jié)束。購買出生6周的小鼠，剃除小鼠背毛后第二天，用溶于0.1ml丙酮中的390毫摩爾7，12-二甲基苯并(a)蒽(DMBA)作為起始物，涂擦于該剃除毛的背部。一周后，作為一種促進劑，用溶于0.1毫升丙酮中的1.7毫摩爾12-0-十四酰大戟二萜醇-13-乙酸酯(TPA)作為啟動子，在上述相同部位每周涂擦二次。上述步驟重復20周。在用TPA處理前一小時，對由15只小鼠組成的各組，施用丙酮0.1ml或溶于0.1ml丙酮的85毫摩爾NFD涂擦皮膚，并測定NFD對皮膚致癌因素的抑制效果。
每周觀測一次小鼠大于1mm的乳頭瘤的數(shù)目。實驗結(jié)果以每只小鼠的乳頭瘤數(shù)和每組產(chǎn)生乳頭瘤小鼠的百分數(shù)表示。
圖28表示NFD的抑制作用，圖29表示作為陽性對照而使用的lapacoal的抑制作用。
實施例3和4表明NFD可用作一種致癌促進抑制劑使用;并可用作抗腫瘤劑。
當NFD作為一種抗腫瘤劑作用時，最好每天口服NFD三次。對成年人最好的日劑量是0.15～1.5mg，對于兒童和嬰兒最好的日劑量是成年人的1/2到1/6。NFD可以經(jīng)口腔和不經(jīng)腸道兩種方式給藥，但是，經(jīng)口腔給藥最好。
藥用組合物將作賦形劑的乳糖66.5mg、作粘合劑的淀粉糊劑10mg、作崩解劑的淀粉20mg及作片劑潤滑劑的硬脂酸鎂2mg加到1.5mg NFD中，將上述各物質(zhì)完全混合，并壓制成含1.5mg NFD的100mg的片劑(總重100mg)。
權(quán)利要求
1.下式2-(1-羥乙基)-5-羥基萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮
2.由作為活性成份的權(quán)利要求1的化合物和載體共同組成的抗腫瘤劑。
3.權(quán)利要求1所述的化合物的制備方法，它包括下述步驟用熱甲醇提取Tabebuia avellanedae Lorentz，ex Griseb的干燥樹皮;將提取物經(jīng)蒸發(fā)后得到的殘留物用冷氯仿提取;用制備薄層層析以甲苯/乙酸乙酯(4∶1，體積/體積)為展開劑分離氯仿可溶的成分，并回收Rf值為0.24的成分。
全文摘要
本發(fā)明提供具有上式結(jié)構(gòu)的新的抗腫瘤劑——2-(1-羥乙基)-5-羥基萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮。
文檔編號A61K31/34GK1086815SQ93116259
公開日1994年5月18日 申請日期1993年8月7日 優(yōu)先權(quán)日1992年9月18日
發(fā)明者上田伸一, 德田春邦, 平井圭一, 畠中平八 申請人:太日保日本株式會社