專利名稱：纖維蛋白溶酶原激活劑的抑制劑治療炎癥和創(chuàng)傷的用途的制作方法
各種疾患是由于纖維蛋白溶酶活性的調(diào)節(jié)作用受到損傷。纖維蛋白溶酶是由纖維蛋白溶酶原經(jīng)纖維蛋白溶酶原激活劑(PA)如UPA(尿PA)或組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)作用而生成的。纖維蛋白溶酶原激活劑的抑制劑(PAI)可抑制各種PA。生理相關(guān)的PAI現(xiàn)在已知有兩種不同的類型纖維蛋白溶酶原激活劑的抑制劑Ⅰ型(PAI-1)和纖維蛋白溶酶原激活劑的抑制劑Ⅱ型(PAI02)，這兩種PAI都是蛇根平型的抑制劑。
眼睛、耳或皮膚發(fā)生炎癥，例如角膜損傷時，通常淚液中纖維蛋白溶酶的活性會增高。纖維蛋白溶酶又會使細胞間質(zhì)的纖維mectin降解、促進血管生成并使膠原酶原激活成有活性的膠原酶，后者可使膠原分子降解(Barlati等εxp.EyeRes.51，1-9(1990)，為了治療由于增高的纖維蛋白溶酶活性而引起作用的各種病理狀態(tài)，已使用低分子量物質(zhì)如2-氨基己酸或止血環(huán)酸(反式-4-氨乙基-環(huán)已羧酸)。例如止血環(huán)酸/明適于治療骨關(guān)節(jié)炎。用止血環(huán)酸也可降低潰瘍性結(jié)腸炎及相關(guān)疾病的纖維蛋白溶解活性的過剩增高。然而上面提及的低分子量纖維蛋白溶酶抑制劑因有毒副作用是有缺點的。
另一種纖維蛋白溶酶抑制劑可用抑胰肽酶，在有些情況下用它可以治療角膜潰瘍。
現(xiàn)在令人意外地發(fā)現(xiàn)一些炎癥，特別是眼、耳或(或)皮膚炎證，但也可例如在骨關(guān)節(jié)炎或潰瘍性結(jié)腸炎可以方便地用纖維蛋白溶酶原激活劑的抑制劑加以治療。
因此，本發(fā)明內(nèi)容是應(yīng)用纖維蛋白溶酶原激活劑的抑制劑，作為制備治療和(或)眼、耳、皮膚、骨關(guān)節(jié)炎和(或)潰瘍性結(jié)腸炎的藥物。
尿激酶(uPA)和(或)tPA，尤其是uPA和(或)tPA被抑制。適宜的抑制劑尤其是PAI-1和(或)PAI-2及其突變體或變異體，特別是PAI-2，尤其是PAI-2片斷，成熟的PAI-2的N端氨基酸1-82或1-84。該抑制劑可單獨應(yīng)用或與其它藥物合用，如抗生素，既可局部用藥也可全身用藥。用于骨關(guān)節(jié)炎時，有效物質(zhì)最好是關(guān)節(jié)內(nèi)或手術(shù)中期給藥(開放型或關(guān)節(jié)鏡檢查)。局部用藥的有效劑量一般是1-300000尿激酶抑制單位，優(yōu)選為500-50000尿激酶抑制單位，靜脈注射或加溶的肌肉注射用藥劑量為每Kg體重50-750000尿激酶抑制單位。
抑制劑特別是PAI-2可加入生理可溶性穩(wěn)定劑以使穩(wěn)定化，例如加入白蛋白，聚纖維物質(zhì)，明膠水解液，甘氨酸，半胱氨酸，葡萄糖，乳糖，麥芽糖和(或)蔗糖。
這些抑制劑的適應(yīng)癥一般是眼睛炎癥疾患的局部治療和(或)預(yù)防作用，例如角膜潰湯，眼色素層炎，結(jié)膜炎，術(shù)中和術(shù)后治療，眼結(jié)構(gòu)。特別是炎癥過程的保護，或者是炎性耳病，如中耳炎，鼓膜炎，炎癥過程的鼓膜破壞，但也可用于具有炎性癥候群的皮膚疾患，如紅斑，尤其是當炎證細胞浸潤到組織時，這此癥細胞例如有巨噬細胞，單核細胞和粒細胞，皮膚棘層松解，水皰形成，例如天皰瘡，濕疹，接觸性皮炎和特應(yīng)性皮炎，炎癥過程的燒灼感，脈管炎，促進傷面愈合，開放性創(chuàng)傷和皮膚潰瘍的治療等。其它的適應(yīng)癥是治療表皮損傷，骨關(guān)節(jié)炎，潰瘍性結(jié)腸炎，節(jié)段性回腸炎，IBD(炎性腸疾患)，胰腺炎，痤瘡，治療上皮損傷，角膜損傷，眼損傷相關(guān)的瘢痕，鞏膜炎，非治愈性角膜糜爛，干燥病和角化病。這些抑制劑還可以單獨應(yīng)用或與其它有效物質(zhì)合用，優(yōu)選以沖洗液用于術(shù)中和術(shù)后處理和(或)治療這些炎癥的開放性創(chuàng)傷。另一個有利的應(yīng)用方式是在配帶接觸式透鏡之前單用本抑制劑或與其它藥物合用的溶液治療，以抑制新的血管形成，并且用于治療接觸式透鏡配帶者的眼損傷，眼炎癥和(或)角膜浸潤以及眼角膜炎癥。
下面詳細說明纖維蛋白溶酶原激活劑的抑制劑如PAI-2的一些優(yōu)選的用途。
1.用于治療激光角膜切除術(shù)造成的眼角膜損傷，但也可用于角膜切開術(shù)的治療。這種激光角膜切除方法可用于校正近視和遠視的折光率，校正散光，校正角膜缺損，去除瘢痕，用于角膜成形術(shù)，角膜出現(xiàn)干燥時使其平滑，角膜的新近損傷，眼睛的感染，例如病毒(如皰疹)、細菌、真菌或寄生蟲，上皮層下的鈣沉積(衰老象征)，結(jié)膜與角膜的粘連(翼狀胬肉)。
2.用于眼睛發(fā)炎和眼睛混濁，例如激光治療后，正常眼科手術(shù)(例如玻璃體切開術(shù)，白內(nèi)障手術(shù)，晶狀體手術(shù)，晶狀體置換，晶狀體移植，角膜成形術(shù)，角膜移植)，結(jié)膜炎，角膜結(jié)膜炎，角膜結(jié)膜炎干燥癥，虹膜炎，虹膜睫狀體炎，角膜炎，格雷夫斯眼病，莫倫潰瘍，脈管炎，眼色素層炎，眼睛過敏性癥候，感染，代謝紊亂，炎性疾病和自家免疫性疾病(例如全身性紅斑狼瘡，維格奈肉芽腫病，風濕性關(guān)節(jié)炎，肉樣瘤病，多關(guān)節(jié)炎，類天皰瘡，天皰瘡，多形性紅斑，斯耶格倫綜合癥，炎性腸病，多發(fā)性硬化病，重癥肌無力，角化病，鞏膜炎。
3.用于預(yù)防眼外科手術(shù)或損傷后的瘢痕。
4.用于提高創(chuàng)傷愈合和最佳再生的速度(例如使老的基質(zhì)和新生成的上皮之間的界面平滑)，使手術(shù)或損傷后上皮組織與基質(zhì)的代謝功能正?；头€(wěn)定化。
5.用于抑制由于視網(wǎng)膜病特別是糖尿病引起的新血管形成;視網(wǎng)膜脫離，視網(wǎng)膜血管損傷，視網(wǎng)膜和眼色素層炎癥，角膜移植。
6.用于眼球移植，特別是(角膜移植，這是由于PAI-2降低了PMN的吸附作用，可以降低敏感性和阻止新血管形成，而對創(chuàng)傷愈合不會同時有不良作用，這就減少了排斥作用的危險。
7.用于眼部水腫，例如斑-水腫，斑下-水腫，光照性凝固后的水腫，角膜水腫，結(jié)膜水腫，視網(wǎng)膜水腫，眼部周圍的水腫。
8.用于眼部區(qū)域的浸潤，特別是角膜附近，眼房區(qū)域，結(jié)膜和鞏膜區(qū)域。
9.用于治療角膜潰瘍。
PIA-2例如可按如下方法制備如EP0238275所述，分出PAI-2CDNA，克隆，連接到載體上，用本領(lǐng)域熟知的方法將其轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)染到適宜的宿主細胞上。按已知的方法使細胞繁殖，破壞，為了純化由例如大腸桿菌溶菌液得到的rPAI-2，適于且各種組合的層析方法(例如經(jīng)Q-瓊脂糖凝膠進行離子交換層析，經(jīng)苯基-瓊脂糖凝膠的疏水層析，于Sephacryl或Fractogel上凝膠過濾)。由酵母溶菌液純化rPAI02的適宜方法包括有基本純化(去除細胞，用球磨破碎細胞，支叉流動過濾，交叉流動濃縮)和最后高純化(層析法，如WO91/02057中所述或用離子交換層析和免疫親和層析)。比活性按對人尿激酶抑制作用計，一般為150000單位/ml或更高。
PAI-1可按類似的方法制備，如WO90/13648所述。
纖維蛋白溶酶原激活劑的抑制劑的優(yōu)點特別表現(xiàn)在對同時具有抑制新血管形成的這些炎癥的單一治療中，一般是無毒的，沒有副作用。由于對纖維蛋白溶酶原激活劑的抑制作用允許用藥的濃度明顯低于纖維蛋白溶酶抑制劑的濃度，所以同時用其它類有效物質(zhì)或與之合用，例如抗生素特別有優(yōu)點。此外，纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑的用量明顯低于纖維蛋白溶酶抑制劑的用量，而且，通常減低了過敏反應(yīng)的危險，也觀察到它與纖維蛋白溶酶抑制劑相比，有優(yōu)越的長效作用。
實施例1PAI-2用于治療角膜潰瘍在Cejkova等1975年(HistoChemistry4571-75)所述的角膜潰瘍的家兔模型，將PAI-2以不同的濃度(5-100μg/ml)局部用于眼睛上(25μg/ml，每日三次;100μg/ml每日兩次)。對照組用等體積(1ml)的溶劑(生理鹽水，pH7.2)，每日兩次。參比物是抑胰肽酶(前兩周用5000IU/ml，每日兩次;后兩周劑量降為2500IU/ml)。
用0.75M氫氧化鈉處理后，借助內(nèi)徑為11mm的塑料管流出大量炎癥細胞這些分泌蛋白水解活性，同時誘發(fā)角化細胞在角膜上皮組織合成其它一系列的蛋白多糖。這引起角膜的次序結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，從而不導(dǎo)致失去透明度。
測定下面的參數(shù)，角膜的穿孔，潰瘍的形成，新血管形成，淚液中纖維蛋白溶酶的活性，炎癥特征，如炎證細胞的流入，眼睛透明性，虹膜的可見性(表1)。與安慰劑組比較，PAI-2組有如下優(yōu)點可將纖維蛋白溶酶活性降到最低程度。用抑胰肽酶降低纖維蛋白溶酶活性，為了達到同樣的程度，須經(jīng)常頻繁地用藥。用PAI-2可完成阻止穿孔和潰瘍的形成。用抑胰肽酶也可得到同樣的效果。令人意外的是，用PAI-2對由于實驗性刺激所流入的炎癥細胞數(shù)目劇烈地經(jīng)久地降低，甚至降到健康組織的正常水平。
下面陽性的作用又令人意外地得到了PAI-2發(fā)生的對完全治愈所絕對必要的抑制新血管形成，以致可以恢復(fù)眼睛的透明度，并且虹膜又可以看見了。用抑胰肽酶治療雖然可阻斷角膜潰瘍和穿孔，但仍然失去了透明度。甚至用比較低劑量的PAI-2所得到的陽性效果，用較高劑量的抑胰肽酶也不能達到。
用PAI-2對纖給蛋白溶酶原激活劑的抑制作用與用例如抑胰肽酶對纖維蛋白溶酶的抑制作用相比甚至還有另外的優(yōu)點用纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑單獨治療，其結(jié)果與常規(guī)法治療相比有優(yōu)點。所用的有效成分的極其強的作用可以用非常低的抑制劑濃度，以致也可以很好地與例如抗生素如氯霉素聯(lián)合治療。
另一個試驗是在例如用堿作用后不馬上治療角膜潰瘍，而是在10天后才開始。在這后來的時刻淚液中纖維蛋白溶每活性已經(jīng)升高達2-2.5μg/ml。
在相同的時間(誘導(dǎo)后的10天)開始用抑胰肽酶治療(5000國際單位/ml，局部應(yīng)用，每日2次)，使淚液中可檢測出的活性纖維蛋白溶酶的濃度回復(fù)到正常值。但這種作用只維持大約2小時，而后纖維蛋白溶酶的水平又升高。
在同樣的時間開始用PAI-2治療(例如100μg/ml，局部應(yīng)用)，活性的纖維蛋白溶酶的濃度回復(fù)到正常值(0.4-0.6μg/ml)，一次應(yīng)用PAI-2的效果意外地保持非常長的時間。因此，例如PAI-2一次給藥后，淚液中纖維蛋白溶酶的濃度48小時后仍然是1μg/ml。在這種情況下，受試的PAI-2的所有三種濃度(5，25，100μg/ml)都適于降低潰瘍過程。用PAI-225μg/ml濃度可獲得最佳治療結(jié)果。
這種意外長時間的持續(xù)作用只能在用PAI-2抑制纖維蛋白溶酯原激活劑才觀察到，而用抑胰肽酶不能抑制纖維蛋白溶酶。
當局部應(yīng)用甾體如地塞米松-磷酸納治療眼睛時，會產(chǎn)生副作用，如玻璃體腫脹的變化和眼內(nèi)壓的變化，而且PAI-2治療正常眼睛時，不會有副作用。因此，組織學(xué)上例如動脈基質(zhì)的層狀結(jié)構(gòu)樣式和生化指標，例如角膜的氫化作用、酶活性(乳酸脫氫酶，酸性磷酸酶，酸性糖苷酶，堿性磷酸酶，琥珀酸脫氫酶)都沒有變化。此外，還可指出，除了對炎癥有成功的抑制作用外，不會對上皮再生作用產(chǎn)生抑制。
淚液中纖維蛋白溶酶活性的測定小紙盤(Whatman濾紙，直徑5mm)用D-Val-Leu-Lys-三氟甲胺基香豆素(FCA，酶系統(tǒng)產(chǎn)物出品，LiVermore，加州，美國)的底物溶液浸潤并干燥，底物溶液制備如下1mg底物溶解于4滴N，N-二甲基甲酰胺中，加入1ml0.1Mtris-Hcl(pH7.2)。纖維蛋白溶酶0.2-0.5μg/ml溶液的制備是將纖維蛋白溶酶(Sigma)溶解于0.1Mtris-Hcl的pH7.2緩沖溶液。各種濃度的溶液20μl放到預(yù)先用底物溶液處理的紙盤中，然后與用淚液浸潤的紙盤一起在潮濕房室中37℃恒溫中保溫。為了測定淚液中纖維蛋白溶酶的濃度，將紙盤放在角膜上，淚液被吸收5秒鐘。于37℃紙盤保溫時，每隔2h于紫外光下測定。淚液樣80在紫外光下發(fā)射的黃色螢光的強度與已知濃度的纖維蛋白溶酶樣品樣比較(已知纖維蛋白溶酶濃度的紙盤的校正圖)，從而可以確定樣品中的纖維蛋白溶酶的活性。
表1堿誘導(dǎo)的角膜潰瘍的治療試驗組第1組安慰劑組(生理鹽水;一日兩次)第2組抑胰肽酶組(5000國際單位/ml，一日兩次)第3組rPAI-2(100μg/ml;一日兩次)第4組rPAI-2(25μg/ml;一日兩次)
實施例2PAI-2用于角膜上皮組織的再生用家兔模型研究了PAI-2對角膜上皮組織的再生作用。
模型說明用體重為2.5～3.0kg成年灰兔進行研究。動物靜脈注射硫賁妥(25mg/ml/kg體重)使麻醉。然后將眼睛固定，機械造成角膜損傷用格雷費刀仔細將上皮組織兩次去除(間隔一周)，將不同濃度(5-50μg/ml)PAI-2(于PBS緩沖液，pH7.2)局部點在眼上，每日三次。對照組織動物用同體積(0.5ml)PBS緩沖液(pH7.2)或抑胰肽酶(60μg/ml)或氟比洛芬(0.1%溶液)的PBS緩沖溶液(pH7.2)。產(chǎn)生損傷后的動物在不同時間(1，4，7，14，21，28天后)被處死，用組織學(xué)和組織化學(xué)方法檢查角膜結(jié)構(gòu)。測定淚液中纖維蛋白溶酶活性并與組織學(xué)數(shù)據(jù)作相關(guān)性處理。照相記錄眼睛的光學(xué)形象，每周兩次。纖維蛋白溶酶活性按實施例1所述方法進行。處死動物后立刻摘除眼球，切除角膜或眼睛的整個前部。
一些角膜用麥克格溫銀浸滲法處理(1955)。剝離上皮組織后，將樣品置于明膠中。所有其它的方法用于整個眼睛的前部。一部分用被丙酮-干冰冷卻的石油醚使其停止。在冷凍狀態(tài)下，平行于或垂直于眼表面切片(12μm厚)。將切片轉(zhuǎn)移到未預(yù)冷的載片或半透膜上，進行葡萄糖胺聚糖，氨基肽酶M(APM)，二肽肽酶Ⅳ(DPPⅣ)，r-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)，堿性磷酸酶(AlP)，Na+/K+一依頓的三磷酸腺苷酶(ATPase)和脫氫酶(琥珀酸脫氫酶SDH，乳酸脫氫酶LDH)測定。在測定APM，DPPⅣ、GGT和AlP之前，將切片用氯仿和丙酮(1∶1)的冷混合物固定2分鐘。AlP用萘酚-AS-MX-磷酸鹽(Cal-biochem，La Jolla;加州，美國)和快藍B鹽(Michrome，Gurr，Poole，英國)的偶氨偶聯(lián)方法測定;APM用丙氨酰-4-甲氧基-β-萘胺-丙氨酰-MNA(Bachem，Bubendorf，瑞士)和快藍B鹽(Michrome，Gurr，英國)測定;DppⅣ用Gly-Pro-MNA(Bachem，瑞士)和快藍B鹽(Michorme，Gurr，英國)測定;GGT用r-Glr-MNA(Bachem，瑞士)，Gly(Lachema，Brmo，捷克)和快藍B按Lojda等(1979)的方法測定。半透膜上的切片用來測定酸性磷酸酶(AcP)-用偶氮偶聯(lián)反應(yīng)測定，即同萘酚-AS-BI-磷酸鹽(Calbiochem)和P-品紅六偶氮鹽反應(yīng)，后一試劑是由無吖啶的品紅(Merck，Darmstadt，德國)制備的;半透膜上的切片還測定β-葡糖苷酸酶(β-glu)和N-乙酰-β-D-氨基葡糖苷酶(Ac-Glu)底物是萘酚-AS-BI-β-葡糖苷酸和萘酚-AS-BI-N-乙酰-β-D-氨基葡糖苷(二者為Calbiochem出品)，二者的偶聯(lián)反應(yīng)都用P-品紅六偶氮鹽。酸性β-半乳糖苷酶(β-Gal)用Lojda的靛藍生成方法(Cejkova和Lojda，1975;Lojda等，1979)用4-氯-5-溴-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(Cyclo Chemicals，洛杉磯，加州，美國)測定。ATP酶用ATP-Tris和Ba2+鹽按Cejkova和Lojda(1978)方法測定。脫氫酶用Lojda等(1979)方法在未固定的冷凍切片上用硝基BT(Lachema，Brno，捷克)作為電子受體加以測定。為了測定氨基葡萄糖聚糖，將切片固定在冷乙醇中5分鐘，用1%濃度的含有不同濃度NgCl2的Alcian藍溶液染色(Cejkova等，1973)，但也可用1%濃度的Alcian藍在3%乙酸的溶液(pH2.5)染色，眼球前部的其余部分用4%多聚甲醛于0.1M磷酸緩沖液(pH7.2)固定，然后冷凍切片。將12μm厚的切片轉(zhuǎn)移到用白蛋白覆蓋的載片上，解凍干燥。被固定的切片用來測定DPPⅣ(用Gly-Arg-MNA，Bachem，瑞士，和硝基水楊醛，NSA，Merck)和DPPⅡ(用Lys-pro-MNA和快藍B)(Lojda法1985和Cejkova和Lojda，1986)。一些被固定的角膜用于作組織學(xué)變化的檢查(用蘇木素-曙紅染色)。
緩沖液對照未處理眼睛的纖維蛋白溶酶活性在損傷后2h內(nèi)由0.2-0.4μg/ml增加，1日后達到1.0-2.0μg/ml，到第7日仍維持此水平，到第14日降至0.2～0.4μg/ml，21日后低于0.2μg/mg(見表2)。
上皮組織從角膜邊緣開始再生，含有各種不同的酶活性(DPPⅣ，酸性糖苷酶和溶酶體蛋白酶(見表3))。去上皮后4天內(nèi)，炎癥細胞(特別是多形核嗜中性粒細胞，DMN)向角膜基質(zhì)大量滲入。在外周發(fā)生角膜新血管形成作用。一些角化細胞壞死，這些被鄰近的角化細胞取代。在14-21日后，上皮細胞再生成完全。應(yīng)當提及的負性結(jié)果是血管形成作用和失掉透明度(透明度未能完全恢復(fù))。發(fā)生的角膜渾濁是不可逆的。
用氟比咯芬治療淚液中纖維蛋白溶酶活性的增加與緩沖液對照組相同(見表2)。但與緩沖液對照組相反，炎癥細胞流入角膜基質(zhì)較少，新血管形成作用受阻但未完全阻斷。某些眼睛未發(fā)生上皮再生成作用，一些甚至被抑制了。角膜上皮組織只有很低的ATPase和GGT活性。這些數(shù)據(jù)列于表3。
用抑胰肽酶或PAI-2治療整個實驗過程中纖維蛋白溶酶活性顯著降低。抑胰肽酶治療組的最大濃度為1.0μg/ml，而PAI-2治療組只有0.4μg/ml(見表2)。這兩個治療組的DPPⅣ，酸性糖苷酶和溶酶體水解酶的活性比較弱，而ATPase和GGT的活性是正常的。用抑胰肽酶治療時，只有較少的炎癥細胞流到角膜基質(zhì)中，在PAI-2組中，幾乎未檢測到炎癥細胞的流入。兩個治療組都恢復(fù)了透明度。抑胰肽酶組至14日后創(chuàng)傷愈合尚未完全，而PAI-2組在去上皮后第10天創(chuàng)傷愈合就已完全。用抑胰肽酶治療時不能避免角膜的新血管形成作用，而PAI-2治療時則完全阻斷了血管形成(各種濃度均阻斷)。
因此，用PAI-2或纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑治療的優(yōu)點是增加了上皮再生成的速率，完全阻止了新血管形成，完全而迅速恢復(fù)透明度(比用抑胰肽酶或其它物質(zhì)要迅速得多)。PAI-2非常好地抑制了角膜和基質(zhì)的炎癥。因此，由于不會在炎癥區(qū)域檢測出任何PWN。用PAI-2治療過程中，角膜上皮組織的酶活性會非常迅速地回復(fù)正常。另一個優(yōu)點是所用的PAI-2濃度比用抑胰肽酶濃度低得多。PAI-2濃度甚至為10ag/ml時仍完全有活性。PAI-2是另一優(yōu)點因此可同時與其它有效物質(zhì)合用。
表3家兔眼角膜的反復(fù)去上皮組織化
實施例3PAI-2用于治療眼損傷和術(shù)中和術(shù)后治療本實驗按實施例2所述方法進行和評價。然而此處不剝離上皮組織，而是用手術(shù)刀切口使角膜損傷，切的深度是角膜基質(zhì)厚度的60-80%，并包括了角膜的所有表面(由邊緣到5mm)。角膜切口后，淚液中纖維蛋白溶酶活性較迅速地增高(2小時內(nèi))，數(shù)日內(nèi)維持高水平(見表4)。僅在1日后炎癥細胞就移入到創(chuàng)傷2區(qū)域。這就有可能測定創(chuàng)傷附近的溶酶體水解酶和糖苷酶增加的活性。從第1到第7日上皮細胞就移入到切口傷處。10日后切口傷處被上皮細胞充滿。不過，移入到基質(zhì)底層的細胞的附著力非常差，因而真正的傷封口來得緩慢遲滯。傷愈合時膠原-原纖維的排布是無規(guī)則的。在創(chuàng)傷部位檢測不到氨基葡萄糖聚糖。而在該部位的糖苷酶特別是β-半乳糖苷酶的活性增加了。肉眼觀察表明切口傷處在一些情況下暫時失去了透明度，在創(chuàng)傷愈合的第4到第7日失去透明度達最大程度。角膜被非透明性的疤痕組織愈合。角膜透明度變化是非可逆的，數(shù)據(jù)列于表5。
用PAI-2治療在治療的全過程中，用PAI-2治療的動物淚液中只檢出最低量的纖維蛋白溶酶的活性。最大活性為0.4μg/ml。與緩沖液對照組相反，用PAI-2治療的動物完全停止了炎癥。例如用PAI-2治療的第1天在緊靠眼基質(zhì)創(chuàng)傷處就檢測不到炎癥細胞。角化細胞的激活發(fā)生得較早。移入的上皮細胞只有比較低的溶酶體水解酶的活性，而GGT、ATPase和SDH的活性則很快回復(fù)正常。只4日后切口傷處完全被上皮細胞充滿。這些細胞非常好地附著在基質(zhì)底層。在第10日原來形成的裂開的切口傷處又完全長平?；|(zhì)的較深層被鄰近的角化細胞的參與(代謝和細胞分裂活性)而愈合。14日后創(chuàng)傷完全愈合。新形成的角化細胞呈現(xiàn)正常的代謝活性(例如有關(guān)GGT活性)，而沒有炎證的證據(jù)?？傊肞AI-2治療可以使創(chuàng)傷以相當快的速度愈合并且愈合的質(zhì)量大大改善了。角膜創(chuàng)傷的愈合生成完全透明的組織，完全不會出現(xiàn)瘢痕。本發(fā)明的重要指標是PAI-2在兩種濃度(10μg/ml和20μg/ml)下就能達到治療效果。
PAI-2數(shù)據(jù)列于表5。
用抑胰肽酶的治療與緩沖液對照組相比，淚液中纖維蛋白溶酶的濃度降低了(見表3)。切口傷處以正常速率愈合(低于PAI-2)。移入的上皮細胞中溶酶體水解酶和糖苷酶活性與PAI-2的效果相比較降低了。新生成的上皮細胞與基質(zhì)的附著力不像用PAI-2治療動物的那樣強。切口傷處的愈合較慢，但仍生成透明組織。創(chuàng)傷部位的組織化學(xué)與用PAI-2治療動物的非常相似。
緩沖液對照組緩沖液對照組動物的淚液中纖維蛋白溶酶活性在較長時間內(nèi)增高了(見表4)。同時，可觀察到炎癥細胞(主要是PMN)移入到角膜內(nèi)很明顯。上皮細胞增高了水解能力，這主要是由例如溶酶體水解酶構(gòu)成，而GGT和ATP酶活性降低了。創(chuàng)傷本身封口很慢(大約10天)，新生成的上皮細胞對基質(zhì)底層的附著力非常差，生成白色的瘢痕，透明度部分地喪失，且不可逆轉(zhuǎn)。
用PAI-2或纖維蛋白溶酶/纖維蛋白溶酶激活劑抑制劑系統(tǒng)進行治療的優(yōu)點在于只用這個方法就達到迅速且完全滿意的角膜恢復(fù)-完全透明，無瘢痕，良好附著性，無新血管形成，角膜的正常代謝活性-根據(jù)組織學(xué)檢查也是如此。
表4淚液中纖維蛋白溶酶活性角膜深度切開創(chuàng)傷
表5家兔角膜深度切開創(chuàng)傷
實施例4激光手術(shù)后用PAI-2治療用Lohmann等1991年敘述的方法(193nm激態(tài)原子激光)給家兔實行光屈折激光角膜切除術(shù)，然后以20μg/ml濃度的PAI-2局部點眼(每日2-3次)。對照組用同體積的溶劑(20mM甘氨酸，pH7.2;150mMNaCl，0.3%明膠水解液)。參比組用抑胰肽酶(5000國際單位/ml;每日2次，2周)或0.1%強的松龍乙酸酯(1日2次，1周;1日1次11周)，或0.1%氟比咯芬(用法同強的松龍乙酸酯)。測定的參數(shù)是渾濁的生成，淚液中纖維蛋白溶酶的濃度和組織學(xué)指標。
對照組的纖維蛋白溶酶濃度在短時間內(nèi)由大約1μg/ml升到50μg/ml，但1周后恢復(fù)正常。在新生的上皮組織與原來的基質(zhì)之間的封口部位不平滑。此外可檢測到新生成的基質(zhì)物質(zhì)，例如膠原。在基質(zhì)中可觀察到一些空泡。若不作治療，就有退化成近視的趨勢。由于形成錯誤的結(jié)構(gòu)和新合成，會觀察到眼睛的渾濁。用強的松龍乙酸酯治療，結(jié)果原則上相同，只是膠原的新合成略有減少，而用氟比洛芬治療時除了渾濁外，可觀察到顯著的膠原新合成。用抑胰肽酶治療時，在舊基質(zhì)和新生成的上皮組織之間的交界處是平滑的。然而與光屈折有關(guān)的角膜渾濁還是可見的。未見空泡，基底細胞大小正常，但合成了新的膠原。用PAI-2治療會得到絕對清亮透明的眼睛(見表6)。即使3個月之后也不會有渾濁-通常渾濁的出現(xiàn)不會遲于3-5周后。上皮細胞再生得非常好;舊基質(zhì)與新生的上皮細胞之間的交界處是平滑的，無沉積物，無空泡，無膠原的新合成，無上皮細胞增生。不會退還成近視。即使將所有參比物聯(lián)合應(yīng)用，治療結(jié)果也不會比PAI-2治療效果好。與PAI-2治療相比，這種聯(lián)合治療或用參比物治療的缺點是-局部應(yīng)用甾體3個月或更長時間會有生成不希望有的繼發(fā)性青光眼的高度危險(取決于切除的程度)。
-抑胰肽酶證明不能與強的松龍合用。
-已知對抑胰肽酶有超敏感性。
-BSE問題，純度，外源性蛋白質(zhì)性質(zhì)等都不宜于抑胰蛋白的應(yīng)用。
表6激光角膜切開術(shù)后的治療
1)但有一種新合成的尚屬未知的物質(zhì)
權(quán)利要求
1.纖維蛋白酶原激活劑的抑制劑在制備用于治療和(或)預(yù)防眼、耳、皮膚、骨、關(guān)節(jié)、腸或其它內(nèi)臟、手術(shù)中和(或)手術(shù)后治療以及(或)開放性創(chuàng)傷治療藥物制劑中的用途。
2.按照權(quán)利要求1的用途，其特征是，這些纖維蛋白溶酶原激活劑是尿激酶和(或)tPA。
3.按照權(quán)利要求1的用途，其特征是，該抑制劑是PAI-1和(或)PAI-2，優(yōu)選為PAI-2片段。
4.按照權(quán)利要求1用于治療角膜潰瘍，眼色素層炎，結(jié)膜炎，中耳炎，鼓膜炎，炎癥過程的鼓膜破裂，皮膚紅斑，皮膚棘層松解，天皰瘡，濕疹，接觸性皮炎，特應(yīng)性皮炎，炎癥過程的灼燒感，脈管炎，皮膚潰湯，骨關(guān)節(jié)炎，IBD(炎性腸病)，胰腺炎，座瘡，治療上皮損傷，角膜損傷，治療眼損傷的瘢痕形成，鞏膜炎的治療，非愈合性角膜糜爛，干燥病和(或)角化病。
5.按照權(quán)利要求1用于術(shù)中的(或)術(shù)后治療和(或)治療開放性創(chuàng)傷或上述炎癥。
6.按照權(quán)利要求1用于抑制新血管形成，治療眼角膜浸潤或配帶接觸性透鏡者的角膜炎癥。
7.按照權(quán)利要求1的用途，其特征是，該手術(shù)治療是激光角膜切除術(shù)和(或)開放性創(chuàng)傷和炎癥是激光角膜切除術(shù)的后果。
8.按照權(quán)利要求1治療眼睛炎癥和眼渾濁的用途，例如激光治療后，正常的眼外科(如玻璃體切開術(shù)，白內(nèi)障手術(shù)，囊外白內(nèi)障摘除，晶狀體手術(shù)，晶狀體置換，晶狀體移植，角膜成形術(shù)，角膜移植)以及如下疾病的后果，結(jié)膜炎，角膜結(jié)膜炎，角膜結(jié)膜炎干燥癥，虹膜炎，虹膜睫狀體炎，角膜炎，格雷夫斯眼病，莫倫潰瘍，脈管炎，眼色素層炎，眼睛過敏性癥候，感染，代謝紊亂，炎性疾病和自家免疫性疾病(例如全身性紅斑狼瘡，維格奈肉芽腫病，風濕性關(guān)節(jié)炎，肉樣瘤病，多關(guān)節(jié)炎，天皰瘡，類天皰瘡，多形性紅斑，斯耶格倫綜合癥，炎性腸病，多發(fā)性硬化病，重癥肌無力，角化病，鞏膜炎。
9.按照權(quán)利要求1用于阻止眼睛手術(shù)后或損傷后瘢痕的產(chǎn)生。
10.按照權(quán)利要求1用于阻止視網(wǎng)膜病的新血管形成，特別是糖尿病患者，視網(wǎng)膜脫離，視網(wǎng)膜血管損傷，或視網(wǎng)膜和眼色素層炎癥或角膜移植。
11.按照權(quán)利要求1用于眼睛移植特別是角膜移植的用途。
12.按照權(quán)利要求1用于治療眼部水腫，例如斑-水腫，斑下-水腫，光照凝固后水腫，角膜水腫，結(jié)膜水腫，視網(wǎng)膜水腫，眼部周圍的水腫。
13.按照權(quán)利要求1用于治療眼部的浸潤，特別是角膜，眼房，結(jié)膜和鞏膜的浸潤。
14.按照權(quán)利要求1用于加速創(chuàng)傷愈合，特別是眼科領(lǐng)域。
15.按照權(quán)利要求1用于局部注射，例如注射到結(jié)膜下，玻璃體，眼房或鞏膜。
16.按照權(quán)利要求1用于微量注射的用途。
17.按照權(quán)利要求1用于沖洗溶液。
18.按照權(quán)利要求1的抑制劑與生理可溶性載體聯(lián)合的應(yīng)用。
19.按照權(quán)利要求1的抑制劑與生理可溶性載體的聯(lián)合應(yīng)用，例如與纖維素衍生物，聚合物基質(zhì)或接觸性透鏡。
20.按照權(quán)利要求1抑制劑與穩(wěn)定劑聯(lián)合的應(yīng)用。
21.按照權(quán)利要求1抑制與其它有效物質(zhì)的聯(lián)合應(yīng)用。
22.按照權(quán)利要求1抑制劑的用途，其特征是，其它的有效物質(zhì)是一個或多個抗生素。
全文摘要
本發(fā)明涉及纖維蛋白溶酶原激活劑如尿激酶、uPA或tPA的抑制劑，用于術(shù)中與術(shù)后治療，治療損傷，以及治療和預(yù)防炎性疾病。適宜的抑制劑尤其為PAI—1和PAI—2。
文檔編號A61P27/02GK1080873SQ9310525
公開日1994年1月19日 申請日期1993年4月29日 優(yōu)先權(quán)日1992年4月30日
發(fā)明者E·舒勒, J·羅米舒, E-P·帕庫斯, G·迪克尼特 申請人:柏林魏克股份公司