本發(fā)明涉及口腔組織再生領(lǐng)域技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及l(fā)ncrna-tug1在制備調(diào)控牙周膜干細(xì)胞的干性維持能力的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

牙周組織再生是口腔醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)之一，是牙周病學(xué)、頜面外科學(xué)、正畸學(xué)、修復(fù)學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域研究的共同目標(biāo)。近年來(lái)，關(guān)于牙齒干細(xì)胞及組織工程技術(shù)的研究進(jìn)展給牙周組織生物學(xué)再生帶來(lái)了新的研究方向。2004年seo等利用單細(xì)胞克隆技術(shù)，從人體的牙周膜組織中成功分離并鑒定出一種新的成體干細(xì)胞，即牙周膜干細(xì)胞，為口腔進(jìn)行生物功能修復(fù)開(kāi)拓了新思路。

牙周膜干細(xì)胞(pdlscs)是一類在口腔臨床工作中較易獲得的、間充質(zhì)來(lái)源的成體干細(xì)胞；也是一組具有多向分化潛能的異質(zhì)性多能干細(xì)胞，含有成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞及未分化前體干細(xì)胞等多種細(xì)胞成分，具有合成新生牙周組織的潛能，可移行于牙根面并進(jìn)行遷移、增殖、分化等一系列生物學(xué)活動(dòng)，形成新生的牙周組織結(jié)構(gòu)，建立新附著關(guān)系，在牙周再生中發(fā)揮極其重要的主導(dǎo)作用。它可表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物并具備干細(xì)胞樣特性(stem-cell-likeability)，具備自我更新及多向分化能力；能表現(xiàn)出較高的增殖和克隆形成能力，可維持牙周組織的再生修復(fù)。在體外通過(guò)適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)能夠形成骨、軟骨、神經(jīng)、脂肪、血管等多種組織；具備潛在分化為成骨細(xì)胞或成牙骨質(zhì)細(xì)胞的能力，并能在體內(nèi)移植后形成牙骨質(zhì)-牙周膜-牙槽骨樣結(jié)構(gòu)物，為牙齒和牙周組織生物學(xué)再生提供了可能；在口腔臨床的骨組織維持、骨再生、牙周改建、修復(fù)及正畸治療中，pdlscs可發(fā)揮分化、增殖、自我更新、遷移等作用，為促進(jìn)牙周組織改建、生物性牙根形成、骨組織愈合及骨再生方面提供了重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。本申請(qǐng)發(fā)明人課題組前期已在國(guó)際上率先提出利用牙齒相關(guān)干細(xì)胞進(jìn)行生物牙根再生的新理念，并進(jìn)行了系列相關(guān)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)，如在小型動(dòng)物模型上成功再生出可正常行使功能的生物牙根；將自體異體牙周膜干細(xì)胞及vc誘導(dǎo)的牙周膜干細(xì)胞膜片用于組織再生，并取得了良好的效果；同時(shí)，發(fā)現(xiàn)抑制mirna-21的表達(dá)可以促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞成骨分化及組織再生。

在人類基因組研究中，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)一種長(zhǎng)度超過(guò)200bp的非編碼rna(longnoncodingrna，lncrna),這類rna本身不編碼蛋白，由真核生物基因組轉(zhuǎn)錄而來(lái)，以rna的形式存在多種層面上，如表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等調(diào)控基因的表達(dá)水平。研究顯示，lncrna參與眾多的生命調(diào)節(jié)活動(dòng)：可對(duì)蛋白編碼基因進(jìn)行表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)；直接調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)降解；參與某些細(xì)胞器的生成過(guò)程及細(xì)胞內(nèi)分子的亞細(xì)胞運(yùn)輸，并常與基因印跡現(xiàn)象有關(guān)。

?；撬嵘险{(diào)基因1(taurineupregulatedgene1,tug1)的表達(dá)產(chǎn)物是一種長(zhǎng)鏈非編碼rna。最早在小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均表達(dá)，敲除tug1后會(huì)引起視網(wǎng)膜發(fā)育畸形，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)減慢或凋亡。lncrna-tug1位于人類染色體22q12.2，長(zhǎng)度約為7.1kb，具有數(shù)個(gè)開(kāi)放閱讀框架但最長(zhǎng)的編碼不超過(guò)100個(gè)氨基酸，因此認(rèn)為它是非編碼rna。它可以與甲基化的polycombrepressivecomplex2(prc2)蛋白結(jié)合，從而調(diào)控某些生長(zhǎng)控制基因的表達(dá)。沉默tug1可以導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)減慢或凋亡，幾種與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因在沉默tug1后均表達(dá)上調(diào)。對(duì)于視網(wǎng)膜祖細(xì)胞進(jìn)行tug1sirna轉(zhuǎn)染后三天，幾種與細(xì)胞凋亡通路相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞死亡增加，tug1的正常表達(dá)可能對(duì)于抑制某些細(xì)胞凋亡相關(guān)基因起到重要作用。tug1對(duì)血管平滑肌細(xì)胞中sm22α具有調(diào)節(jié)作用。敲低tug1后，細(xì)胞生長(zhǎng)減慢或凋亡，sm22αmrna表達(dá)上調(diào)；它可以與多梳蛋白抑制復(fù)合體2(polycombrepressivecomplex2,prc2)中ezh2蛋白結(jié)合，從而調(diào)控某些生長(zhǎng)控制基因的表達(dá)；胞漿中的ezh2具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性并且在pdgf誘導(dǎo)的細(xì)胞偽足的形成過(guò)程中起關(guān)鍵作用，得出tug1與ezh2、f-actin之間的相互作用機(jī)制及其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)作用。研究人員還發(fā)現(xiàn)tug1啟動(dòng)子附近包括一些高度保守的p53綁定位點(diǎn)，能夠被p53介導(dǎo)的dna損傷應(yīng)答所刺激并表達(dá)上調(diào)。

干細(xì)胞的干性維持能力，主要體現(xiàn)在高增殖、低分化、自我更新、具備遷移能力及干性相關(guān)基因(如sox2，klf4，nanog，c-myc和oct4)的表達(dá)(stemnessassociatedgenes)，通常被認(rèn)為可以維持干細(xì)胞的干性。最近的研究也表明，這些干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)主要體現(xiàn)在一些腫瘤中，并調(diào)控腫瘤的成瘤和轉(zhuǎn)移，干性相關(guān)基因及其信號(hào)通路異常可能是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的機(jī)制。沉默mir-302-367簇的啟動(dòng)子可以使胚胎干細(xì)胞缺乏干細(xì)胞的表型和特性，而在人皮膚癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)mir-302-367簇后細(xì)胞具有多能性胚胎干細(xì)胞特性，表現(xiàn)為干細(xì)胞標(biāo)記oct3/4,ssea-3,ssea-4,sox2和nanog的表達(dá)。

然而，目前還未有關(guān)于lncrna調(diào)控人牙周膜干細(xì)胞的干性維持能力的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供lncrna-tug1在制備調(diào)控牙周膜干細(xì)胞的干性維持能力的藥物中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供lncrna-tug1作為生物標(biāo)志物在制備調(diào)控牙周膜干細(xì)胞的干性維持能力的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第二方面，提供lncrna-tug1促進(jìn)劑在制備正性調(diào)控牙周膜干細(xì)胞的干性維持能力的藥物中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述lncrna-tug1促進(jìn)劑是指任何可以提高lncrna-tug1的活性、增加lncrna-tug1表達(dá)量的物質(zhì)，例如增加lncrna-tug1表達(dá)量的lncrna-tug1的過(guò)表達(dá)載體。

上述應(yīng)用中，所述正性調(diào)控牙周膜干細(xì)胞的干性維持能力包括：促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的增殖能力、促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的多向分化能力、促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的遷移能力和促進(jìn)細(xì)胞干性相關(guān)因子表達(dá)的能力。

本發(fā)明的第三方面，提供lncrna-tug1抑制劑在制備負(fù)性調(diào)控牙周膜干細(xì)胞的干性維持能力的藥物中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述lncrna-tug1抑制劑包括了拮抗劑、下調(diào)劑、阻滯劑、阻斷劑等。任何可以降低lncrna-tug1的活性、減少lncrna-tug1表達(dá)量的物質(zhì)均可用于本發(fā)明。

作為優(yōu)選的，所述lncrna-tug1抑制劑為抑制lncrna-tug1表達(dá)的慢病毒載體。

上述應(yīng)用中，所述負(fù)性調(diào)控牙周膜干細(xì)胞的干性維持能力包括：抑制牙周膜干細(xì)胞的增殖能力、抑制牙周膜干細(xì)胞的多向分化能力、抑制牙周膜干細(xì)胞的遷移能力和抑制細(xì)胞干性相關(guān)因子表達(dá)的能力。

本發(fā)明的第四方面，提供一種調(diào)控牙周膜干細(xì)胞的干性維持能力的藥物組合物，所述藥物組合物含有有效量的上述lncrna-tug1促進(jìn)劑或lncrna-tug1抑制劑。

進(jìn)一步的，所述藥物組合物中還包含：藥學(xué)上可接受的載體。

所述“藥學(xué)上可接受的載體”為常規(guī)的給藥載體，包括各種賦形劑或稀釋劑等。

上述技術(shù)方案具有如下有益效果：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)lncrna-tug1在牙周膜干細(xì)胞干性維持過(guò)程中起了重要的調(diào)控作用，當(dāng)lncrna-tug1下調(diào)，pdlscs的增殖、自我更新、分化、遷移能力均受到抑制，由此確認(rèn)lncrna-tug1可作為多能干細(xì)胞干性維持的潛在靶點(diǎn)，推動(dòng)開(kāi)發(fā)出新的關(guān)于lncrna-tug1相關(guān)藥物或因子，并最終將其運(yùn)用到再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，達(dá)到臨床上真正的精準(zhǔn)醫(yī)療。

附圖說(shuō)明

構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的說(shuō)明書附圖用來(lái)提供對(duì)本申請(qǐng)的進(jìn)一步理解，本申請(qǐng)的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本申請(qǐng)，并不構(gòu)成對(duì)本申請(qǐng)的不當(dāng)限定。

圖1：牙周膜干細(xì)胞的生物學(xué)特性研究結(jié)果；a為原代培養(yǎng)的pdlscs(p0)；b為第三代培養(yǎng)的pdlscs(p3)；c為干細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定結(jié)果；d和e分別為pdlscs成骨向、脂肪向誘導(dǎo)分化的能力。a、b、d、e中scalebar：200μm。

圖2：慢病毒載體轉(zhuǎn)染pdlscs用以降低tug1的表達(dá).a.免疫熒光染色(scalebar：200um)；b.qrt-pcr。

圖3：tug1對(duì)牙周膜干細(xì)胞增殖能力，細(xì)胞周期和凋亡能力的影響；圖中，a.edu顯示sh-nc和sh-tug1-2#組的增殖能力；b.cck-8法顯示sh-nc和sh-tug1-2#組的增殖能力；c.mtt法顯示sh-nc和sh-tug1-2#組的增殖能力；d.克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示sh-nc和sh-tug1-2#組的細(xì)胞增殖和自我更新能力；e、f.tug1對(duì)牙周膜干細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡能力的影響。(以p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；*p<0.05、**p<0.01)，a、d中scalebar：200μm。

圖4：tug1對(duì)人牙周膜干細(xì)胞多向分化能力的影響；圖中，a、b.alp染色(7d)和alp活性；c、d.茜素紅染色(21d)和鈣離子濃度；e.成骨向相關(guān)因子(alp、runx2、ocn)的表達(dá)情況；f、g、h.油紅o染色和成脂肪相關(guān)因子的表達(dá)情況。a、c、f中scalebar：200μm。

結(jié)果顯示sh-tug1-2#組較空載體組呈下降趨勢(shì)。(以*p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。

圖5：tug1對(duì)人牙周膜干細(xì)胞遷移能力的影響；圖中，a為transwell實(shí)驗(yàn)；b為劃痕實(shí)驗(yàn)；結(jié)果顯示sh-tug1-2#組較空載體組(sh-nc)的遷移能力呈減弱趨勢(shì)，scalebar：200μm。(以*p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。

圖6：tug1對(duì)人牙周膜干細(xì)胞干性相關(guān)因子的影響；圖中，a.干性相關(guān)因子mrna水平的變化；b.干性相關(guān)因子蛋白水平的變化。

具體實(shí)施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說(shuō)明都是示例性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的說(shuō)明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語(yǔ)僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說(shuō)明書中使用術(shù)語(yǔ)“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟、操作和/或它們的組合。

正如背景技術(shù)所介紹的，目前還未有關(guān)于lncrna調(diào)控人牙周膜干細(xì)胞的干性維持能力的報(bào)道?；诖?，本發(fā)明通過(guò)lncrna-tug1調(diào)控pdlscs干性維持能力的體外實(shí)驗(yàn)，并對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行分子水平研究，提出了lncrna-tug1在制備調(diào)控牙周膜干細(xì)胞的干性維持能力的藥物中的新用途。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本發(fā)明的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。

實(shí)施例1：牙周膜干細(xì)胞的生物學(xué)特性研究

1.人牙周膜干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

麻醉下無(wú)菌拔除人阻生第三磨牙，輕輕剝離其周圍的牙周組織，取中段的牙周組織，用pbs反復(fù)清洗，剪碎，置于含ⅰ型膠原酶(3g/l)和dispaseⅱ酶(4g/l)的消化液，37℃下消化40分鐘，過(guò)70um細(xì)胞篩收集細(xì)胞，1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，去除上層的液體，用新鮮的培養(yǎng)液重新懸浮成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種于25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在α-mem培養(yǎng)基(含15％胎牛血清、2mmol/l谷氨酰胺、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)中37℃、5％co2培養(yǎng)，每隔2-3天換液1次，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80％匯合狀態(tài)時(shí)，用0.25％胰蛋白酶按1：2或1：3消化傳代。

結(jié)果見(jiàn)圖1a和圖1b。

2.自我更新能力檢測(cè)和牙周膜干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)，觀察牙周膜干細(xì)胞stro-1，cd146，cd45，cd31等間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況。

結(jié)果見(jiàn)圖1c。

3.多向分化能力檢測(cè)

將牙周膜干細(xì)胞分別在成骨向誘導(dǎo)培養(yǎng)基和脂肪向誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，然后分別通過(guò)茜素紅染色、油紅o染色以及rt-pcr技術(shù)檢測(cè)其多向分化潛能。

結(jié)果見(jiàn)圖1d和圖1e。

由上述結(jié)果可以看出，分離培養(yǎng)的pdlscs通過(guò)鑒定和誘導(dǎo)，可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，具備干細(xì)胞的多向分化潛能。

實(shí)施例2：lncrna-tug1對(duì)牙周膜干細(xì)胞干性維持能力的調(diào)控影響

1.慢病毒載體的構(gòu)建：

根據(jù)人lncrna-tug1序列(id:55000)設(shè)計(jì)引物，引物由上海領(lǐng)科生物科技有限公司合成并純化。退火后連接至線性化的pgenesil-1質(zhì)粒，構(gòu)建lncrna-tug1(沉默)的表達(dá)載體慢病毒，抑制lncrna-tug1的表達(dá)。

具體如下：

vector：pleno-gfp

lenti-human-nc序列：ttctccgaacgtgtcacgt(seqidno:1)；(negativecontrol)。

lenti-human-sh1tug1

gph-htug1-sh1forwardsequence

5’-gatccctgttgaccttgctgtgagaacttcctgtcagattctcacagcaaggtcaacagtttttg-3’(seqidno:2)；

gph-htug1-sh1reversesequence

5’-aattcaaaaactgttgaccttgctgtgagaatctgacaggaagttctcacagcaaggtcaacagg-3’(seqidno:3)。

lenti-human-sh2tug1

gph-htug1-sh2forwardsequence

5’gatccgcttggcttctattctgaatcctttcttcctgtcagaaaaggattcagaatagaagccaagctttttg3’(seqidno:4)；

gph-htug1-sh2reversesequence

5’-aattcaaaaagcttggcttctattctgaatccttttctgacaggaagaaaggattcagaatagaagccaagcg-3’(seqidno:5)。

lenti-human-sh3tug1

gph-htug1-sh3forwardsequence

5’-gatccgctacaactatcttcctttaccttcctgtcagagtaaaggaagatagttgtagctttttg-3’(seqidno:6)；

gph-htug1-sh3reversesequence

5’-aattcaaaaagctacaactatcttcctttactctgacaggaaggtaaaggaagatagttgtagcg-3’(seqidno:7)。

lenti-human-sh4tug1

gph-htug1-sh4forwardsequence

5’-gatccgcaagagataactatgaaagccttcctgtcagagctttcatagttatctcttgctttttg-3’(seqidno:8)；

gph-htug1-sh4reversesequence

5’-aattcaaaaagcaagagataactatgaaagctctgacaggaaggctttcatagttatctcttgcg-3’(seqidno:9)。

考察構(gòu)建的不同慢病毒載體對(duì)lncrna-tug1的沉默效果，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，sh-tug1-2#的沉默效果最明顯。因此，以sh-tug1-2#用于后續(xù)的試驗(yàn)研究。

2.試驗(yàn)分組：

試驗(yàn)分為三組，分別為：control組、sh-nc組、sh-tug1-2#組。

用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，將sh-tug1-2#和sh-nc空載體，按照轉(zhuǎn)染步驟說(shuō)明書加入到細(xì)胞中。8-10h后換用正常的培養(yǎng)基，孵育24h后在熒光顯微鏡下觀察，出現(xiàn)綠色熒光說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功，完成后續(xù)干性維持能力的相關(guān)驗(yàn)證。

3.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：

edu、mtt、cck-8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖率；細(xì)胞周期及凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞特性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可以看出，沉默lncrna-tug1，細(xì)胞的增殖能力減弱，凋亡能力增強(qiáng)。

4.多向分化能力檢測(cè)：

(1)成骨向分化能力測(cè)定：

alp染色和茜素紅染色，并進(jìn)行alp活性、鈣離子濃度測(cè)定，通過(guò)實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)成骨關(guān)鍵因子runx2、alp和ocn基因的表達(dá)變化。

(2)成脂向分化能力測(cè)定：

進(jìn)行油紅染色及pparγ和lpl因子的測(cè)定。

多向分化能力檢測(cè)的結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，沉默lncrna-tug1，細(xì)胞的成骨向和成脂肪向能力減弱。

5.遷移能力檢測(cè)：

采用transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)對(duì)遷移能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。有圖5可以看出，沉默lncrna-tug1，細(xì)胞的遷移能力減弱。

6.干性相關(guān)因子的測(cè)定：

對(duì)干性相關(guān)因子的mrna和蛋白水平進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，沉默lncrna-tug1，細(xì)胞干性相關(guān)因子表達(dá)減弱。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>山東大學(xué)

<120>lncrna-tug1在制備調(diào)控牙周膜干細(xì)胞的干性維持能力的藥物中的應(yīng)用

<130>

<160>9

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

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gatccctgttgaccttgctgtgagaacttcctgtcagattctcacagcaaggtcaacagt60

ttttg65

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<211>65

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

aattcaaaaactgttgaccttgctgtgagaatctgacaggaagttctcacagcaaggtca60

acagg65

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gatccgcttggcttctattctgaatcctttcttcctgtcagaaaaggattcagaatagaa60

gccaagctttttg73

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<211>73

<212>dna

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