本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥材料技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種以瓊脂糖凝膠和有序化多壁碳納米管為基礎(chǔ)的仿生骨組織工程支架及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

骨組織的重要性和骨相關(guān)疾病帶來(lái)的危害，加速了骨組織工程的發(fā)展。在此大背景下，骨組織工程因具有治療骨相關(guān)損傷或疾病的巨大潛力，而成為修復(fù)損傷器官的新的前沿的方法。通常而言，骨組織工程的研究包含了三大元素：支架、細(xì)胞和生長(zhǎng)因子。上述三者中，對(duì)支架的研究是目前研究較為活躍的領(lǐng)域之一。骨組織工程要求所用支架既是理想的骨替代物，又同時(shí)具有能夠誘導(dǎo)骨細(xì)胞形成礦化組織的性能。

目前，市場(chǎng)上以滅活異種骨替代物為產(chǎn)品主流，該類型支架是對(duì)已有異種動(dòng)物的成型骨組織進(jìn)行滅活處理，得到無(wú)或少免疫排斥反應(yīng)的支架材料。但材料形狀不可控和滅活的高成本是其最明顯的兩個(gè)缺點(diǎn)。此外，以羥基磷灰石(ha)和磷酸三鈣為基礎(chǔ)的支架材料是另一類主流產(chǎn)品。該產(chǎn)品可結(jié)合前期診斷中的磁共振成像結(jié)果，通過(guò)3d打印技術(shù)打造出與骨損部位相匹配的形狀。然而，打印所采用的煅燒探頭決定了該技術(shù)只能使用無(wú)機(jī)材料作為原材料，仿生程度不高，同時(shí)，高昂的診斷、構(gòu)建和植入成本也成為這一治療手段的弊端。因此，作為關(guān)鍵因素之一，構(gòu)建和修飾支架同樣值得我們關(guān)注。而能否構(gòu)建更接近于生理骨組織結(jié)構(gòu)的仿生支架材料，便成了這一領(lǐng)域主要的研究課題之一。骨組織工程包含三大元素：細(xì)胞、支架和生長(zhǎng)因子。在支架設(shè)計(jì)上，如何仿造正常生理結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以構(gòu)建與其相仿的骨組織工程支架以促進(jìn)骨細(xì)胞更好的生長(zhǎng)，是當(dāng)前研究的一大熱點(diǎn)。

盡管目前已開(kāi)發(fā)出多種修飾骨組織工程支架的方案，但開(kāi)發(fā)出最接近理想的技術(shù)仍然是一種挑戰(zhàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有仿生骨組織工程支架的缺陷和不足，采用瓊脂糖凝膠(ag)作為支架本體，利用電泳技術(shù)使表面礦化的多壁碳納米管(cnts)在其內(nèi)部形成有序化的結(jié)構(gòu)以此修飾支架構(gòu)建了ag-o-cnts仿生骨組織工程支架。該支架能夠有效促進(jìn)骨間充質(zhì)干細(xì)胞(bmscs)的生長(zhǎng)，在骨組織工程支架材料或骨替代材料方面具有很好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的目的是提供一種以瓊脂糖凝膠和有序化多壁碳納米管為基礎(chǔ)的仿生骨組織工程支架及其制備方法。

本發(fā)明另一目的是提供所述仿生骨組織工程支架在作為或制備骨組織工程支架材料或骨替代材料方面的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種以瓊脂糖凝膠和有序化多壁碳納米管為基礎(chǔ)的仿生骨組織工程支架的制備方法，首先對(duì)碳納米管(cnts)依次進(jìn)行羧基化和多巴胺化表面修飾，然后在模擬體液環(huán)境中使得多巴胺化cnts表面形成羥基磷灰石顆粒，構(gòu)建得到生物礦化cnts；最后利用瓊脂糖(ag)構(gòu)建本體支架，并在此基礎(chǔ)上利用電泳技術(shù)使得礦化cnts在支架內(nèi)部泳動(dòng)，形成有序化平行排列的陣列，以此構(gòu)建得到仿生骨組織工程支架ag-o-cnts。

具體地，上述以瓊脂糖凝膠和有序化多壁碳納米管為基礎(chǔ)的仿生骨組織工程支架的制備方法，包括如下步驟：

s1.對(duì)cnts進(jìn)行羧基化處理得到羧基化cnts；

s2.對(duì)羧基化cnts進(jìn)行多巴胺化處理得到多巴胺化cnts；

s3.多巴胺化cnts在模擬體液中浸泡處理，形成羥基磷灰石化cnts(h-cnts)；

s4.將h-cnts進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后靜置，得到ag-o-cnts支架。

其中，優(yōu)選地，步驟s1是利用體積比為1：3～1：5的濃硝酸與濃硫酸的混酸進(jìn)行羧基化處理。

優(yōu)選地，步驟s2是利用edc、hhs和左旋多巴胺共處理進(jìn)行多巴胺化修飾。

優(yōu)選地，步驟s3所述浸泡處理的時(shí)間為4～12周。

優(yōu)選地，步驟s4所述電泳的條件為140mv恒壓電泳0.5～1.5h，靜置時(shí)間為3～5h。

更優(yōu)選地，步驟s1的具體方法是：

s11.將cnts超聲分散于2.0～3.0mol/l硝酸中，交替進(jìn)行超聲與磁攪拌處理24～48h，離心分離并用去離子水洗至中性后干燥；

s12.將s11干燥后的產(chǎn)物超聲分散于體積比1：3～1：5的濃硝酸與濃硫酸的混酸中，交替進(jìn)行超聲與磁攪拌處理2～6h，離心分離并用去離子水洗至中性后干燥；

s13.將s12干燥后的產(chǎn)物超聲分散于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10～25％的過(guò)氧化氫水溶液中，交替進(jìn)行超聲與磁攪拌處理1.5～2.5h，用去離子水洗至中性后干燥，得到羧基化cnts。

其中，優(yōu)選地，步驟s11中cnts和硝酸的質(zhì)量體積比為0.1～0.3g：10～30ml。

優(yōu)選地，步驟s12中干燥后的產(chǎn)物和混酸的質(zhì)量體積比為0.1～0.3g：10～30ml。

優(yōu)選地，步驟s13中干燥后的產(chǎn)物和過(guò)氧化氫水溶液的質(zhì)量體積比為0.1～0.3g：10～30ml。

另外，優(yōu)選地，步驟s2的具體方法是：

s21.將羧基化cnts加入無(wú)水乙醇中并超聲分散制成分散液，然后加入edc與nhs，交替進(jìn)行超聲與磁攪拌處理1～3h；然后加入左旋多巴胺，繼續(xù)交替進(jìn)行超聲與磁攪拌處理1～3h；

s22.步驟s21得到的產(chǎn)物離心分離并用去離子水洗滌至中性后干燥，得到多巴胺化cnts。

其中，優(yōu)選地，步驟s21所述羧基化cnts和無(wú)水乙醇的質(zhì)量體積比為0.1～0.3g：10～30ml。

優(yōu)選地，步驟s21所述羧基化cnts、edc、nhs和左旋多巴胺質(zhì)量比為10～30：6～18：9～27：9～27。

另外，優(yōu)選地，步驟s3所述多巴胺化mwcnts和模擬體液的質(zhì)量體積比為：0.001～0.003g：0.5～5ml。

更優(yōu)選地，步驟s3的具體操作為：取多巴胺化mwcnts浸泡于模擬體液(sbf)中，處理完成后將mwcnts離心分離并用去離子水洗滌至中性后干燥，得h-cnts。

優(yōu)選地，所述模擬體液(sbf)的配方為：nacl6～10g/l；nahco30.1～0.4g/l；kcl0.1～0.4g/l；k2hpo4·3h2o0.1～0.4g/l；mgcl2·6h2o0.1～0.5g/l；1.0mhcl10～50ml/l；cacl20.1～0.5g/l；na2so40.05～0.15g/l；tris5～10g/l。

優(yōu)選地，步驟s4的具體操作為：在水平電泳槽中制備0.5％～5％的瓊脂糖凝膠，然后加入tae電泳緩沖液，于電泳孔中添加h-cnts支架，采用140mv恒壓電泳0.5～1.5h后，靜置3～5h，得到ag-o-cnts支架。

其中，0.5％～5％的瓊脂糖凝膠的制備方法為：tae緩沖液中加入0.5％～5％瓊脂糖粉末，80～320℃加熱至粉末溶解并持續(xù)沸騰0.5～1.5h后，靜置20～50min，待液體溫度下降至60～80℃，倒入電泳槽，靜置，使其自然凝結(jié)。

優(yōu)選地，所述tae緩沖液的配方為：tris1～10g/l；na2edta·2h2o0.5～1.0g/l；冰醋酸0.5～3ml/l。

另外，優(yōu)選地，上述碳納米管(cnts)為多壁碳納米管(mwcnts)。

另外，作為一種優(yōu)選地可實(shí)施方案，上述以瓊脂糖凝膠和有序化多壁碳納米管為基礎(chǔ)的仿生骨組織工程支架(ag-o-cnts)的制備方法，包括如下步驟：

s1.cnts羧基化(即混酸化學(xué)功能化cnts)：

將0.1～0.3gcnts超聲分散于10～30ml濃度為2.0～3.0mol/l的硝酸中，超聲與磁攪拌交替處理24～48h后，將cnts離心分離并用去離子水洗至中性后干燥；再將0.1～0.3g干燥后的cnts超聲分散于10～30ml混酸中(濃硝酸與濃硫酸體積比為1：3～1：5)，并將cnts混酸分散液交替進(jìn)行超聲與磁攪拌處理2～6h，處理后將cnt離心分離并用去離子水洗至中性后干燥，將0.1～0.3g干燥后的cnts超聲分散于10～30ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10～25％的過(guò)氧化氫水溶液，超聲與磁攪拌交替處理1.5～2.5h，用去離子水洗至中性后干燥后，得到羧基化cnts；其中，超聲與磁攪拌交替處理的間隔時(shí)間為0.5h～1h交換一次；

s2.cnts多巴胺化(即edc、hhs和左旋多巴胺共處理化學(xué)功能化cnts)：

在10～30ml無(wú)水乙醇中加入0.1～0.3g羧基化cnts并超聲分散制成分散液，加入60～180mgedc與90～270mgnhs后，超聲與磁攪拌交替處理1～3h，加入左旋多巴胺90～270mg，繼續(xù)超聲與磁攪拌交替處理1～3h；處理完成后將cnts離心分離并用去離子水洗滌至中性后干燥，得到多巴胺化cnts；其中，超聲與磁攪拌交替處理的間隔時(shí)間為0.5h～1h交換一次；

s3.制備羥基磷灰石化cnts(h-cnts)

取0.001～0.003g多巴胺化cnts浸泡于0.5～5ml模擬體液(sbf)中4～12周；處理完成后將cnts離心分離并用去離子水洗滌至中性后干燥，得h-cnts；

其中，模擬體液(sbf)的配方為：nacl6～10g/l；nahco30.1～0.4g/l；kcl0.1～0.4g/l；k2hpo4·3h2o0.1～0.4g/l；mgcl2·6h2o0.1～0.5g/l；1.0mhcl10～50ml/l；cacl20.1～0.5g/l；na2so40.05～0.15g/l；tris5～10g/l；

s4.構(gòu)建ag-o-cnts支架：

在水平電泳槽中制備0.5％～5％的瓊脂糖凝膠：tae緩沖液中加入0.5％～5％瓊脂糖粉末，80～320℃加熱至粉末溶解并持續(xù)沸騰0.5～1.5h后，靜置20～50min，待液體溫度下降至60～80℃，倒入電泳槽，靜置，使其自然凝結(jié)；

電泳槽中加入tae電泳緩沖液，于電泳孔中添加h-cnts支架，采用140mv恒壓電泳0.5～1.5h后，靜置3～5h，得到ag-o-cnts支架；

其中，標(biāo)準(zhǔn)tae緩沖液的配方為：tris1～10g/l；na2edta·2h2o0.5～1.0g/l；冰醋酸0.5～3ml/l。

根據(jù)上述方法制備得到的仿生骨組織工程支架，及其在在作為或制備骨組織工程支架材料或骨替代材料方面的應(yīng)用，也均應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

在本發(fā)明的研究過(guò)程中，為更好的設(shè)計(jì)骨組織工程支架，我們需要更好的了解骨組織的組成成分和結(jié)構(gòu)特征。骨組織的成分可分為有機(jī)成分和無(wú)機(jī)成分兩大類，各自比例分別為35％和65％。其中，95％的有機(jī)成分為膠原纖維(col)，另外約5％為無(wú)定型凝膠狀機(jī)制，其主要成分為糖胺聚糖和鈣結(jié)合蛋白。無(wú)機(jī)成分的大部分為ha，是由成骨細(xì)胞的胞外基質(zhì)鈣化所得。在骨組織中，兩分子膠原原纖維互相纏繞形成膠原纖維。鈣化的膠原纖維平行排列，形成片層結(jié)構(gòu)，即骨板。各骨板交錯(cuò)疊加，圍繞形成骨單位，從而構(gòu)成密質(zhì)骨的基本結(jié)構(gòu)。由此可見(jiàn)，該結(jié)構(gòu)中起主要作用的成分有兩種：ha和col。為了達(dá)到仿生的目的，我們可以從兩方面入手：一者是材料成分上的仿生，二者是材料結(jié)構(gòu)上的仿生。

在本發(fā)明的研究過(guò)程中，顯示了cnts對(duì)bmscs的生長(zhǎng)促進(jìn)作用(圖12-圖14)，經(jīng)過(guò)6天培養(yǎng)，原始支架上的細(xì)胞數(shù)目可以增加約50％，而有序化cnts修飾的支架更使得細(xì)胞數(shù)目增加近一倍。進(jìn)一步地，由于cnt存在毒性和生物相容性問(wèn)題，我們對(duì)cnts進(jìn)行了表面修飾處理。

首先，我們對(duì)cnts進(jìn)行了多巴胺修飾處理，其后在模擬體液環(huán)境中利用多巴胺上的酚羥基促使羥基磷灰石結(jié)晶在cnts表面成型，得到了cnts表面的羥基磷灰石結(jié)晶，即構(gòu)建了h-cnts。我們的理化表征結(jié)果表面這一構(gòu)建是成功的：cnts管徑加大，表面上形成突起，cns之間相互連接，以及最重要的是saed結(jié)果顯示出規(guī)則的六邊形結(jié)構(gòu)，提示了單晶的存在(圖1-圖4)。

另外，在解決了分散性的問(wèn)題的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步提升碳納米管的性能，使其更加適合適應(yīng)骨組織工程的要求，我們對(duì)利用cnts對(duì)支架材料進(jìn)行修飾，而且是有序化的修飾以實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)上的仿生，是我們探討的另一個(gè)重點(diǎn)。瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳的最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過(guò)時(shí)會(huì)受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當(dāng)大，對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中。在本發(fā)明的研究中，碳納米管首先經(jīng)過(guò)礦化處理，其次在凝膠支架中形成有序化陣列，使得支架更接近骨頭的生理生化特性，以便骨細(xì)胞在其上的生長(zhǎng)。當(dāng)前結(jié)果表面，ag-o-cnts支架確實(shí)能夠引導(dǎo)bmscs呈現(xiàn)有序化的排布，同時(shí)提高了細(xì)胞數(shù)目，即促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)。將瓊脂糖凝膠用于組織工程領(lǐng)域的支架構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)瓊脂糖膜阻止細(xì)胞的勃附和伸展，從而保持細(xì)胞的圓形形態(tài)，同時(shí)，細(xì)胞在瓊脂糖表而直接接觸，加強(qiáng)了細(xì)胞之間的信息交流，有利于維持細(xì)胞的表型。

本發(fā)明在制備ag-o-cnts支架后，通過(guò)掃描電鏡、透射電鏡、電子衍射、紅外光譜、管徑檢測(cè)、白光干涉等多種理化表征結(jié)果表明，多壁碳納米管表面修飾成功，有序化ag-o-cnts支架得以成功構(gòu)建；同時(shí)，有序化碳納米管陣列改變了支架的力學(xué)性能。然后，體外實(shí)驗(yàn)中，將bmscs細(xì)胞接種于支架上，并通過(guò)dapi染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)支架對(duì)該細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)作用；結(jié)果顯示支架能有效地促進(jìn)bmscs的生長(zhǎng)，表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量的增加和生長(zhǎng)更加有序化。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1、首次在cnts上進(jìn)行礦化處理，構(gòu)建了表面ha修飾的cnts；這一處理豐富了cnts表面修飾的可能性，實(shí)現(xiàn)了支架成分上的仿生，為后續(xù)提高支架強(qiáng)度奠定了基礎(chǔ)。

2、在電泳條件下實(shí)現(xiàn)了h-cnts在支架上的有序排布，實(shí)現(xiàn)支架材料結(jié)構(gòu)上的仿生，提高支架的力學(xué)性能。

3、本發(fā)明制備得到的仿生骨組織工程支架ag-o-cnts應(yīng)用于骨組織工程的研究發(fā)現(xiàn)，該支架能夠有效促進(jìn)骨間充質(zhì)干細(xì)胞(bmscs)的生長(zhǎng)，在骨組織工程支架材料或骨替代材料方面具有很好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為仿生骨組織工程支架ag-o-cnts的制備過(guò)程示意圖。

圖2為紅外表征結(jié)果，a圖為羧基化、多巴胺化、礦化多壁碳納米管后的紅外表征結(jié)果，b圖為有序化ha-col-cnt支架的紅外結(jié)果。

圖3為羧基化、多巴胺化、礦化多壁碳納米管后的掃描電鏡(sem)與透射電鏡(tem)結(jié)果。

圖4為羧基化、多巴胺化、礦化多壁碳納米管后的管徑對(duì)比。

圖5為羧基化、多巴胺化、礦化多壁碳納米管后的選區(qū)電子衍射圖譜。

圖6為多巴胺化多壁碳納米管瓊脂糖電泳后的掃描電鏡(sem)檢測(cè)結(jié)果。

圖7為支架材料sem圖像的fft分析結(jié)果。

圖8為不同修飾方法修飾支架后，單位支架上cnt加載量。

圖9為支架表面形貌表征結(jié)果。

圖10為支架熱失重情況分析結(jié)果。

圖11為支架硬度檢測(cè)結(jié)果。

圖12為支架彈性模量檢測(cè)結(jié)果。

圖13為支架上bmscs細(xì)胞的dapi熒光檢測(cè)結(jié)果。

圖14為支架上bmscs細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

圖15為支架上培養(yǎng)bmscs細(xì)胞的流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果。

圖16為流式細(xì)胞術(shù)統(tǒng)計(jì)支架上培養(yǎng)bmscs的數(shù)量(左)和細(xì)胞周期(右)。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說(shuō)明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購(gòu)。

以下實(shí)施例所用細(xì)胞株為：大鼠骨間充質(zhì)干細(xì)胞(bmscs)，由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

以下實(shí)施例所用主要試劑為：

多壁碳納米管(mwcnts)：分為粗短、細(xì)長(zhǎng)兩種類型，粗短型(以下簡(jiǎn)稱短碳管s碳管)直徑90-100nm、長(zhǎng)1-2μm，細(xì)長(zhǎng)型(以下簡(jiǎn)稱長(zhǎng)碳管l碳管)直徑10-20nm、長(zhǎng)10-20μm，購(gòu)自深圳市納米港有限公司；常規(guī)瓊脂糖g-10粉劑購(gòu)自biowest公司；低糖dmem培養(yǎng)基均為gibcobrl公司產(chǎn)品；新生小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；24孔聚苯乙烯組織培養(yǎng)基板為美國(guó)corning康寧公司產(chǎn)品；凝膠回收試劑盒購(gòu)自康維世紀(jì)生物技術(shù)有限公司。

以下實(shí)施例所用主要儀器為：

德國(guó)leo公司場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡：leo1530vp,nikon顯微鏡，日本olympus公司光學(xué)倒置顯微鏡，sigma32184高速冷凍離心機(jī)，thermoco2培養(yǎng)箱，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠78-1磁力攪拌器，hv-85高壓滅菌器，無(wú)菌操作臺(tái)，廣州科橋?qū)嶒?yàn)技術(shù)設(shè)備有限公司恒溫水浴鍋等。

以下實(shí)施例統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本實(shí)驗(yàn)采用用spss19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，分析函數(shù)為lsd和duncan，p<0.05表示差異顯著。

實(shí)施例1仿生骨組織工程支架ag-o-cnts的制備

本發(fā)明仿生骨組織工程支架的制備過(guò)程如圖1所示，首先對(duì)羧基化多壁碳納米管(cooh-cnts)進(jìn)行多巴胺化修飾，形成多巴胺化多壁碳納米管(dopamine-cnts，d-cnts)。其后，將該類型碳納米管置于模擬體液中4-8周，模擬體液中的磷離子和鈣離子將在多巴胺上酚羥基的引導(dǎo)下形成羥基磷灰石，因此，構(gòu)建得到礦化多壁碳納米管(hydroxyapatite-cnts，h-cnts，即搭載了羥基磷灰石的多壁碳納米管)。其后，以電泳的方式使得h-cnts在瓊脂糖凝膠中形成有序化平行排列的陣列，以此構(gòu)建得到仿生有序化瓊脂糖-碳納米管支架(ag-o-cntsscaffold)。

具體地，本發(fā)明仿生骨組織工程支架ag-o-cnts的制備方法如下：

1、多壁碳納米管(mwcnts)的化學(xué)功能化

(1)mwcnts羧基化(即混酸化學(xué)功能化mwcnts)：

將0.1～0.3gmwcnts超聲分散于10～30ml濃度為2.0～3.0mol/l的硝酸中，超聲與磁攪拌交替處理24～48h后，將mwcnts離心分離并用去離子水洗至中性后干燥。再將0.1～0.3g干燥后的mwcnts超聲分散于10～30ml混酸中(濃硝酸與濃硫酸體積比為1：3～1：5)，并將mwcnts混酸分散液交替進(jìn)行超聲與磁攪拌處理2～6h，處理后將mwcnt離心分離并用去離子水洗至中性后干燥，將0.1～0.3g干燥后的mwcnts超聲分散于10～30ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10～25％的過(guò)氧化氫水溶液，超聲與磁攪拌交替處理1.5～2.5h，用去離子水洗至中性后干燥后，得到羧基化mwcnts，備用。

其中，超聲與磁攪拌交替處理的間隔時(shí)間為0.5h～1h交換一次。

(2)mwcnts多巴胺化(即edc、hhs和左旋多巴胺共處理化學(xué)功能化mwcnts)：

在10～30ml無(wú)水乙醇中加入0.1～0.3g羧基化mwcnts并超聲分散制成分散液，加入60～180mgedc與90～270mgnhs后，超聲與磁攪拌交替處理1～3h，加入左旋多巴胺90～270mg，繼續(xù)超聲與磁攪拌交替處理1～3h。處理完成后將mwcnts離心分離并用去離子水洗滌至中性后干燥，得到多巴胺化mwcnts，備用。

其中，超聲與磁攪拌交替處理的間隔時(shí)間為0.5h～1h交換一次。

2、羥基磷灰石化cnts(h-cnts)的制備

取0.001～0.003g多巴胺化mwcnts浸泡于0.5～5ml模擬體液(sbf)中4～12周。處理完成后將mwcnts離心分離并用去離子水洗滌至中性后干燥，得h-cnts，備用。

其中，模擬體液(sbf)的配方為：nacl6～10g/l；nahco30.1～0.4g/l；kcl0.1～0.4g/l；k2hpo4·3h2o0.1～0.4g/l；mgcl2·6h2o0.1～0.5g/l；1.0mhcl10～50ml/l；cacl20.1～0.5g/l；na2so40.05～0.15g/l；tris5～10g/l。

3、支架構(gòu)建

(1)ag-o-cnts支架構(gòu)建：

在水平電泳槽中制備0.5％～5％的瓊脂糖凝膠：tae緩沖液中加入0.5％～5％瓊脂糖粉末，80～320℃加熱至粉末溶解并持續(xù)沸騰0.5～1.5h后，靜置20～50min，待液體溫度下降至60～80℃，倒入電泳槽，靜置，使其自然凝結(jié)。

電泳槽中加入tae電泳緩沖液，于電泳孔中添加h-cnts支架，采用140mv恒壓電泳0.5～1.5h后，靜置3～5h，得到ag-o-cnts支架。

其中，標(biāo)準(zhǔn)tae緩沖液的配方為：tris1～10g/l；na2edta·2h2o0.5～1.0g/l；冰醋酸0.5～3ml/l。

(2)另外，構(gòu)建了ag-cnts支架進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)：

將0.001～0.003gh-cnts超聲分散于2～10ml標(biāo)準(zhǔn)tae緩沖液中配制成cnts懸浮液。

向體積比1：50～1：100的cnts懸浮液和tae的混合液中加入0.5％～5％瓊脂糖粉末，80～320℃加熱至粉末溶解并持續(xù)沸騰0.5～1.5h后，靜置20～50min，待液體溫度下降至60～80℃，倒入電泳槽，靜置，使其自然凝結(jié)，生成ag-cnts支架。

實(shí)施例2仿生骨組織工程支架ag-o-cnts的表征

1、紅外光譜檢測(cè)

(1)將各試樣和kbr在干燥機(jī)中進(jìn)行干燥處理，將1-2mg試樣與200mg純kbr混合并研磨均勻，并將混合物研磨到粒度小于2μm，以免散射光影響。將混合物置于模具中，在油壓機(jī)上用5-10mpa壓力將混合物壓成透明薄片，上機(jī)待定；同時(shí)，將空白支架與經(jīng)過(guò)修飾的支架進(jìn)行干燥處理，上機(jī)測(cè)定。

(2)cnts多巴胺化和羥基磷灰石修飾后的紅外檢測(cè)

為了進(jìn)一步確定在sh-cnts表面生成的結(jié)構(gòu)的成分，我們首先采用傅里葉紅外光譜檢測(cè)對(duì)樣品進(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)如圖2中的a圖所示，結(jié)果表明，普通cooh-cnts的紅外特征峰和其后經(jīng)修飾的二者存在明顯不同，表明多巴胺和羥基磷灰石成功的修飾在cooh-cnts表面。d-cnts的紅外特征峰和h-cnts的基本一致，唯一差異在于h-cnts樣品在1043.45cm^-1處存在特征峰。這些結(jié)果初步表明，sh-cnts經(jīng)礦化后，其表面確實(shí)形成了主要包含多巴胺和羥基磷灰石，可初步斷定，實(shí)驗(yàn)如我們預(yù)想，sh-cnts的表面被成功礦化。

(3)有序化ha-col-cnt支架的紅外檢測(cè)

為了解支架修飾的結(jié)果，我們采用紅外光譜實(shí)驗(yàn)對(duì)支架經(jīng)行表征。如圖2中的b圖所示，實(shí)驗(yàn)中對(duì)h-cnts的電泳作用并未引起紅外圖譜中相應(yīng)特征峰的變化。這證明支架有序化的構(gòu)建過(guò)程未涉及化學(xué)反應(yīng)。

2、電鏡觀察

(1)掃描電鏡(sem)觀察：將修飾后cnts或支架進(jìn)行自然風(fēng)干，將風(fēng)干后的樣品黏貼固定于樣品臺(tái)上并做噴金處理，將樣品置于掃描電鏡樣品室內(nèi)，將樣品室抽成真空，進(jìn)行掃描電鏡觀察。

透射電鏡(tem)觀察：將修飾后cnts或支架進(jìn)行自然風(fēng)干，將風(fēng)干后的支架樣品固定于樣品臺(tái)上，置于透射電鏡樣品室內(nèi)，將樣品室抽成真空，進(jìn)行觀察。并后續(xù)生成選區(qū)電子衍射(saed)圖樣，用以分析。

(2)cnts多巴胺化和羥基磷灰石修飾后的電鏡觀察結(jié)果

為了在sh-cnts表面進(jìn)行生物礦化處理，我們首先對(duì)sh-cnts進(jìn)行多巴胺修飾。此后，我們又將該cnts浸泡于模擬體液環(huán)境中。如圖3所示，經(jīng)過(guò)6周處理，sh-cnts表面可形成礦化結(jié)構(gòu)：掃描電鏡和透射電鏡結(jié)果同時(shí)表明，單純的多巴胺修飾未能引起sh-cnts形貌上較大的變化。掃描電鏡下，c-cnts和d-cnts呈現(xiàn)出離散的管狀結(jié)構(gòu)，納米管之間彼此相互獨(dú)立，有相互纏繞的現(xiàn)象存在，但彼此之間界限分明，未發(fā)現(xiàn)更多的相互作用。透射電鏡下，c-cnts和d-cnts大小均一，高放大倍數(shù)下可見(jiàn)明顯而平滑的內(nèi)外管壁，且如圖4所示，外管徑約為40nm。礦化處理后的sh-cnts發(fā)生明顯變化：掃描電鏡下，納米管之間界限已不分明，h-cnts外周相互連接，形成片狀結(jié)構(gòu)，甚至能發(fā)現(xiàn)明顯的顆粒結(jié)構(gòu)；透射電鏡下，h-cnts外壁存在大量的顆粒、突起，高放大倍數(shù)下，外表面不再平滑或均一，內(nèi)管壁界限模糊，同時(shí)圖4的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，納米管的外管徑增大約50％，達(dá)到了約60nm。

上述結(jié)果從結(jié)構(gòu)上初步證明了sh-cnts在多巴胺修飾和fbs浸泡的條件下，其表面可形成片狀結(jié)構(gòu)或突起，繼而改變sh-cnts原有的形貌。

(3)cnts多巴胺化和羥基磷灰石修飾后的電子衍射圖譜

如圖5所示，因材料的修飾會(huì)引起材料選區(qū)電子衍射(saed)圖譜的變化，尤其是有晶體生成的情況下，變化更加明顯，所以，為進(jìn)一步檢測(cè)cnts表面羥基磷灰石的結(jié)構(gòu)，我們采用saed對(duì)三種碳納米管進(jìn)行表征。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，單純c-cnts和d-cnts圖譜呈圓形或圓環(huán)形，周邊不存在點(diǎn)狀亮斑，這是因?yàn)檫@兩種碳納米管本身不具有晶體結(jié)構(gòu)，材料本身原子排列不規(guī)整，無(wú)法形成規(guī)則的電子光柵，電子束經(jīng)過(guò)材料后匯集到中央，匯集呈環(huán)狀，不存在更具特征的衍射圖樣。然而，經(jīng)過(guò)模擬體液的礦化后，結(jié)果有了明顯不同：環(huán)狀亮斑消失，取而代之的是呈正六邊形分布的點(diǎn)狀亮斑。這說(shuō)明對(duì)應(yīng)于前述的掃描電鏡或透射電鏡結(jié)果，sh-cnts管壁上增加的物質(zhì)應(yīng)為具有六邊形晶體結(jié)構(gòu)的單晶羥基磷灰石，晶體純度高，在sh-cnts管壁上分布均勻。

綜上，我們發(fā)現(xiàn)，模擬體液環(huán)境下，多巴胺化sh-cnts上的酚羥基有利于羥基磷灰石在sh-cnts管壁上結(jié)晶，用這種方法能得到理想的礦化h-cnts。

(4)有序化ag-o-cnts支架的電鏡檢測(cè)結(jié)果

為了使h-cnts在瓊脂糖支架中呈現(xiàn)更有序的排列，我們采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對(duì)其進(jìn)行處理。我們采用120mv恒壓電流，使h-cnts在0.5-5％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并使用掃描電鏡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)電泳結(jié)果。如圖6所示，對(duì)比于未經(jīng)電泳的ag-cnts組，h-cnts經(jīng)電泳后形成了平行陣列：凝膠垂直面(縱剖面)可見(jiàn)密布的點(diǎn)狀顆粒，水平面(橫剖面)可見(jiàn)平行排列的h-cnts。該結(jié)果表明在電泳作用下的有序化的h-cnts陣列構(gòu)建成功，可用于對(duì)瓊脂糖支架的修飾。

4、快速傅里葉轉(zhuǎn)換(fft)分析

為了進(jìn)一步表明h-cnts在支架上的有序性，我們對(duì)圖6中的sem結(jié)果進(jìn)行快速傅里葉變換處理(fft)。得到上述sem結(jié)果后，采用imagej軟件的fft功能對(duì)圖像進(jìn)行處理，得fft圖像。這種方法可以對(duì)圖像的數(shù)字信號(hào)進(jìn)行簡(jiǎn)化處理，得到其傅里葉頻域圖譜，而越規(guī)則的圖像處理后得到的圖像越具規(guī)律性。

處理結(jié)果如圖7所示：左圖中由ag-cnts支架電鏡圖得到的fft圖像只有深色的背景和中央亮斑，表明原圖樣規(guī)則性不強(qiáng)；但右圖中ag-o-cnts支架電鏡圖得到的fft圖像則不同，中央亮斑呈現(xiàn)波紋樣變化，表明原圖樣具備更高的規(guī)律性。故我們可以得到以下結(jié)論：電泳的方法使得h-cnts在支架上呈現(xiàn)有規(guī)則的排布，即有序化cnts陣列得以實(shí)現(xiàn)。

5、改性后支架的cnts加載量分析

從兩種類型支架上分別切取1-10cm³塊狀材料4-10個(gè)，采用膠回收試劑盒溶解材料，離心、真空冷凍干燥后，稱量cnts質(zhì)量。

單位支架材料上h-cnts的加載量檢測(cè)結(jié)果如圖8。經(jīng)過(guò)測(cè)算我們發(fā)現(xiàn)，h-cnts接近100％的被修飾到了支架上，每立方厘米支架上的h-cnts約為8mg。是否經(jīng)過(guò)有序化并不會(huì)影響h-cnts的加載量(圖8)。

6、支架的表面形貌檢測(cè)

接著，我們采用白光干涉技術(shù)檢測(cè)了支架的外表面形貌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從宏觀上來(lái)看，支架形貌并未發(fā)生明顯的變化，即有序化過(guò)程沒(méi)有引起支架粗糙度的改變。圖9左側(cè)顯示了兩種支架材料的三維立體形貌，ag-cnts支架在這種視圖下呈現(xiàn)不均一的起伏，在本體支架約2.6μm的基底高度上(白色)，可見(jiàn)約為2.8μm的顆粒起伏(黑色)。相比較而言，ag-o-cnts支架較為均一，整體支架呈白色，未發(fā)現(xiàn)明顯突起。然而，如圖9右側(cè)顯示，當(dāng)我們隨機(jī)對(duì)樣本片層進(jìn)行采樣并做統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，兩種支架的粗糙度差別并不明顯：ag-cnts支架的平均ra值為3.68±0.71nm，而ag-o-cnts支架的平均ra值為3.40±0.83nm，兩者間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；同樣，對(duì)于兩種支架的平均ry值而言，該差異依然不明顯(ag-cnts：ry＝25.44±2.70μm；ag-o-cnts：ry＝28.48±0.25μm)。我們更相信該實(shí)驗(yàn)所得的定量結(jié)果，并由此得出結(jié)論：雖然在納米尺度上，電泳的過(guò)程引起了碳納米管有序的排布，但在微米和毫米尺度上，這種有序化的處理對(duì)于支架的形貌并無(wú)明顯的影響，支架依然保持原有的粗糙度不變。

7、支架熱重分析

如圖10，有序化的過(guò)程雖未發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，沒(méi)有新物質(zhì)生成，但h-cnts的有序排布卻增加了材料的熱穩(wěn)定性。在我們進(jìn)行的熱失重檢測(cè)中，ag-cnts支架在34.83℃時(shí)質(zhì)量已損失了20％，且很快，在環(huán)境溫度約100℃的情況下，支架質(zhì)量下降至20％以下。對(duì)比而言，ag-o-cnts支架熱重曲線的80％質(zhì)量點(diǎn)出現(xiàn)在100.73℃處，而直到140℃左右，質(zhì)量才低于20％。

8、支架的力學(xué)性能測(cè)定

分別采用國(guó)家質(zhì)量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)gb/t18258-2000和gbt531.1-2008對(duì)支架進(jìn)行楊氏模量檢測(cè)和邵氏硬度檢測(cè)。楊氏模量主要通過(guò)材料拉伸試驗(yàn)中的應(yīng)力和應(yīng)變測(cè)量獲得，邵氏硬度主要通過(guò)硬度計(jì)測(cè)量獲得。

為了檢測(cè)支架的力學(xué)性能，我們對(duì)其硬度、應(yīng)力和應(yīng)變進(jìn)行檢測(cè)，并發(fā)現(xiàn)有序化前和有序化后，支架的硬度發(fā)生了改變。較為顯著的變化是邵氏硬度測(cè)試中，有序化支架的硬度下降了約5度(圖11)，于此同時(shí)，該支架的楊氏模量也略有下降，但與未經(jīng)有序化處理的支架不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，兩者均在270kpa左右(圖12)。我們推測(cè)其原因是：h-cnts未經(jīng)電泳容易在支架中形成團(tuán)聚，使得支架整體硬度增加，而平行化處理的h-cnts允許支架更大范圍的拉伸變化，所以呈現(xiàn)出這樣的力學(xué)檢測(cè)結(jié)果。

實(shí)施例3仿生骨組織工程支架ag-o-cnts的應(yīng)用

研究ag-o-cnts仿生支架促進(jìn)mscs生長(zhǎng)的作用，并以未經(jīng)電泳處理的碳納米管修飾瓊脂糖支架(ag-cntsscaffold)為對(duì)照。

1、細(xì)胞培養(yǎng)

24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別放入空白與經(jīng)修飾支架1×1×1cm³，細(xì)胞在在培養(yǎng)瓶中融合培養(yǎng)至60-90％后，以1×10⁴-3×10⁴/孔的密度接種至24孔板上，培養(yǎng)2,4,6天，以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。其它細(xì)胞培養(yǎng)條件為：含10％新生牛血清的低糖dmem培養(yǎng)基，37℃，5.0％co2。

為研究?jī)煽钪Ъ懿牧蠈?duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，我們將大鼠骨間充質(zhì)干細(xì)胞(bmscs)接種到支架上，并檢測(cè)其生長(zhǎng)狀況。

2、免疫熒光(dapi)檢測(cè)

首先利用dapi染色方法，初步檢驗(yàn)細(xì)胞在支架上的密度和生長(zhǎng)分布。

24孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)后，pbs溶液搖床清洗3次，每次5min后，采用4％多聚甲醛固定30min，pbs清洗后，將實(shí)驗(yàn)組一分為二：直接進(jìn)行染色或消化細(xì)胞后制成細(xì)胞涂片(涂片方法：胰酶浸泡樣本4min后，含血清培養(yǎng)液終止消化，滴管吹打支架，2500rpm/min離心收集細(xì)胞，涂布于載破片上)。0.2％tritonx-100透化20min；pbs再次清洗后，避光dapi染液孵育3min。pbs清洗，鏡檢。

結(jié)果如圖13所示，bmscs經(jīng)過(guò)4天培養(yǎng)后，在不同支架上呈現(xiàn)明顯不同的生長(zhǎng)特征。對(duì)比于ag-cnts支架，我們發(fā)現(xiàn)，ag-o-cnts支架上的細(xì)胞生長(zhǎng)有兩大特點(diǎn)。一者，細(xì)胞數(shù)量更多，生長(zhǎng)更密集。二者，更重要的是，細(xì)胞分布呈現(xiàn)規(guī)律性，即基本上沿h-cnts電泳的方向呈現(xiàn)平行分布和生長(zhǎng)。h-cnts對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的引導(dǎo)作用尤為明顯。

3、細(xì)胞計(jì)數(shù)與流式細(xì)胞(fcm)檢測(cè)

通過(guò)兩種定量的方式對(duì)支架上的bmscs進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

(1)首先，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算了單位支架上的細(xì)胞數(shù)目在經(jīng)過(guò)2、4、6天培養(yǎng)后的變化。

24孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)后，用胰蛋白酶消化3-5min后，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)?；蛴靡鹊鞍酌赶?-5min后，pbs溶液搖床清洗3次，每次5min后，在流式細(xì)胞儀中檢測(cè)細(xì)胞周期。初始接種密度分別為：細(xì)胞計(jì)數(shù)1.0×10⁴-3.0×10⁴/孔；fcm0.5×10⁵-2.0×10⁵/孔。

結(jié)果如圖14，數(shù)據(jù)表明，經(jīng)過(guò)2天培養(yǎng)后，二實(shí)驗(yàn)組的單位面積細(xì)胞數(shù)均達(dá)到約2.4×10⁴個(gè)。但其后，ag-o-cnts組的細(xì)胞顯著增加，在第4和第6天分別達(dá)到了3.4×10⁴和3.7×10⁴個(gè)，明顯多于ag-cnts組。

(2)其次，流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到的結(jié)果類似，如圖15-16。

與此同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，ag-o-cnts組中s期和g1期的細(xì)胞顯著增加，表明大部分細(xì)胞處在分裂的過(guò)程之中。

因此，我們可以發(fā)現(xiàn)，有序化的h-cnts確實(shí)有利于細(xì)胞的定向生長(zhǎng)，且這種定向生長(zhǎng)有效地提高了細(xì)胞數(shù)目，成功構(gòu)建的ag-o-cnts支架材料是一種理想的骨組織工程支架。

綜上實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可得出如下結(jié)論：

(1)在模擬體液環(huán)境下，表面修飾多巴胺的多壁碳納米管(d-cnts)可以被礦化為表面覆蓋羥基磷灰石的多壁碳納米管(h-cnts)。

(2)以有序化h-cnts和瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)的ag-o-cnts骨組織工程支架可在電泳條件下成功構(gòu)建。

(3)經(jīng)有序化h-cnts陣列修飾后，支架具有良好的理化特性，適合后續(xù)體內(nèi)植入需要。

(4)體外促進(jìn)bmscs生長(zhǎng)的效果在ag-o-cnts支架上得以實(shí)現(xiàn)。

(5)ag-o-cnts支架具有很好的應(yīng)用潛力，可作為骨組織工程支架材料或骨替代材料進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)。